DE4401546C2 - Streptomyces lavendofoliae DRKS Stamm, Verfahren zur Gewinnung der Aclacinomycine A, B, Y und von Aglycon durch Anwendung dieses Verfahrens - Google Patents

Streptomyces lavendofoliae DRKS Stamm, Verfahren zur Gewinnung der Aclacinomycine A, B, Y und von Aglycon durch Anwendung dieses Verfahrens

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Description

Die Erfindung betrifft einen neuartigen Stamm der Gattung Streptomyces, sowie ein Verfahren zur Gewinnung der Antitumor Aclacynomycine A, B, Y und von Aglyconen durch Aufzucht des Stammes.
Aclacinomycin ist ein Pyrrol enthaltendes Antitumormittel der Anthrazyklingruppe und besteht aus drei Desoxypyranoseresten. Bei Interkalierung in die Basenpaare einer DNA, weist es zyto­ toxische Aktivitäten auf, indem es die Synthese von Nuklein­ säure hemmt. Im Gegensatz zu anderen Anthrazyklinen, wie z. B. Daunorubicin, Doxorubicin und Carminomycin hemmt es außerdem selektiv die Synthese von RNA. Darüber hinaus wirkt das Mittel aktiv gegen akute Leukämie und maligne Lymphome, wobei seine kardiale Toxizität jedoch gering ist.
Aclacinomycin kann in drei Gruppen eingeteilt werden, nämlich die Aclacinomycine A, B und Y. Sie weisen im wesentlichen einen als Aklavin bezeichneten Aglyconrest auf. Von den genannten Substanzen findet Aclacinomycin B aufgrund seiner Nebenwirkun­ gen und der geringen Antitumoraktivität in der klinischen Pra­ xis kaum Verwendung. Gründe für die praktische Verwendung von Aclacinomycin A sind die hohen Anti-Krebs- bzw. Anti-Tumorakti­ vität der Substanz, ihre geringen Nebenwirkungen, sowie die hohe Ausbeute. Aclacinomycin Y gilt aufgrund seiner hohen Anti- Tumoraktivität und der geringen Nebenwirkungen als das effi­ zienteste dieser Antikrebsmittel. Seine Ausbeute aus der Streptomyces Kulturbrühe ist jedoch gering und muß daher erhöht werden.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Aclacinomycinen durch Fermen­ tierung von Streptomyces galilaeus ist bekannt (US 3,988,315 Hamao Umezawa). In dieser Patentschrift wird berichtet, daß Streptomyces galilaeus etwa 18 Analoge produziert, unter an­ derem auch die Aclacinomycine A, B und Y. Die Ausbeute ist je­ doch sehr gering: Aclacinomycin A, ein Hauptprodukt wurde in einer Menge von 46 mg/l Kulturbrühe gewonnen, Aclacinomycin B in einer Menge von 23 mg/l und andere Produkte, einschließlich Aclacinomycin Y, nur in verschwindend kleinen Mengen. Es ist daher problematisch, Aclacinomycine mit Hilfe des o.g. Strepto­ myces Stammes in großem Maßstab herzustellen. Es bestand somit Bedarf, einen neuen Stamm mit einer hohen Gewinnausbeute an Aclacinomycinen zur Verfügung zu stellen.
Die Erfinder haben große Forschungsbemühungen unternommen, um ein Verfahren zur industriellen Gewinnung von Aclacinomycinen durch Fermentierung zur Verfügung zu stellen. Das Ergebnis die­ ser Bemühungen ist der Streptomyces lavendofoliae 12/3A, wel­ cher die Fähigkeit aufweist, die Aclacinomycine A und B zu pro­ duzieren. Die Forschungsbemühungen der Erfinder wurden fortge­ setzt mit dem Ziel, einen verbesserten Stamm, der größere Men­ gen Aclacinomycin produziert, zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch die vom Stamm 12/3A abstammenden Mutante Streptomyces lavendofoliae DKRS erfüllt.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung einen neuen Streptomyces la­ vendofoliae DKRS Stamm zur Verfügung zu stellen, der die Fähig­ keit aufweist, größere Mengen der Aclacinomycine A, B, Y, sowie die Aglycone zu produzieren. Des weiteren soll ein Verfahren zur Gewinnung von Aclacinomycinen durch Aufzucht des Streptomyces lavendofoliae DKRS Stammes angegeben werden. Fer­ ner sollen die Aclacinomycine aus der Flüssigkeit und den Zel­ len gesammelt werden. Schließlich soll ein Verfahren zur selek­ tiven Gewinnung der Aclacinomycine A oder Y angegeben werden, nämlich durch Einstellen des pH-Wertes der Kulturbrühe auf einen bestimmten Wert mit Acetatpuffer bzw. Salzsäure nach Auf­ zucht des Streptomyces lavendofoliae DKRS Stammes.
Streptomyces lavendofoliae 12/3A, der Elternstamm für Strepto­ myces lavendofoliae DKRS, kann erfindungsgemäß 60 mg/l Aclaci­ nomycin A und 10 mg/l Aclacinomycin B produzieren.
Der erfindungsgemäße Stamm Streptomyces lavendofoliae DKRS kann durch Veränderung des Elternstammes Streptomyces lavendofoliae 12/3A mittels N-Nitrosomethylbiuret (NMB), einem chemischem Mu­ tagen, gewonnen werden. Die Mutante ist in der Lage die Aclaci­ nomycine A, B, Y und die Aglycone zu produzieren. Im besonderen ist sie in der Lage eine große Menge Aclacinomycin Y zu produ­ zieren.
Die erfindungsgemäße Mutante wurde nach folgender Methode aus­ gewählt: Nach Aufzucht eines Streptomyces lavendofoliae 12/3A Stammes in einem vollständig festen Medium bei 30°C über einen Zeitraum von 6-7 Tagen wurden die Sporen über einen Glaswolle­ filter herausgefiltert, drei mal mit 0.05M Tris-Malat Puffer (pH 6,5) gewaschen und mit demselben Puffer auf 10⁶-10⁸ Spo­ ren/ml verdünnt. Nach Zugabe von NMB zur Suspension mit den Sporen, so daß sich eine Endkonzentration von 500 g/ml ein­ stellte, ließ man die Mischung für 20 min bei 30°C ruhen. Nach Reaktionsende wurden die Sporen durch Zentrifugieren oder Fil­ trieren isoliert, mit steriler physiologischer Kochsalzlösung dreimal gewaschen und auf das vollständige Agarmedium aufge­ tragen. Nach 7 bis 10 Tagen bei 30°C zeigten sich auf dem Agar Kolonien der Mutante.
Die erfindungsgemäße Mutante Streptomyces lavendofoliae DKRS wurde am 26. August 1993 bei der Korean Collection for Type Cultures in Taejon, Korea hinterlegt. Sie erhielt die Regi­ strierungsnummer KCTC 8539P. Die Sammlung wurde am 15. November 1993 in die Sammlung unter dem Budapester Vertrag übertragen und erhielt die Registrierungsnummer KCTC 0092BP.
Das vollständige erfindungsgemäß verwendete Medium hat folgende Zusammensetzung: Glucose 10%, Kaseinhydrolysat 0,2%, Fleischex­ trakt 0,1%, Hefeextrakt 0,1% und Agar 1,5%, pH 7,0-7,2.
Der erfindungsgemäße Stamm Streptomyces lavendofoliae DKRS (KCTC 092BP) weist folgende mikrobiologischen Eigenschaften auf:
1. Morphologische Eigenschaften
Nach Aufzucht in einem festen Medium zeigt sich unter dem Mi­ kroskop, daß die Substratmyzele nicht fragmentiert sind und die Sporen sind ellipsoid und bilden eine Kette mittlerer Länge. Die Größe der Sporen beträgt ungefähr 2,3 µm × 1,4 µm. Sie bil­ den Oidien und ihre Oberfläche ist glatt.
2. Eigenschaften auf verschiedenen Medien
Der erfindungsgemäße Stamm zeigt bei Inkubierung bei 28°C auf den folgenden unterschiedlichen, festen Medien folgende Eigen­ schaften:
  • (1) Auf Waksmann Medium, grünes Wachstum; rosa-braunes, lös­ liches Pigment
  • (2) Auf Gaus-I Medium, rosa-weißes Wachstum; rot-braunes Substratmyzel; kein lösliches Pigment
  • (3) Auf Haferflockenmedium, graues Wachstum; rot-braunes Substratmyzel; kein lösliches Pigment
  • (4) Auf Maismedium, dunkelbraunes Wachstum; dunkelbraunes Substratmyzel
  • (5) Auf Gaus-II Medium, grün-braunes Wachstum; dunkelbraunes Substratmyzel, dunkelbraunes, lösliches Pigment
  • (6) Auf Sojabohnenmedium, hellgrünes Wachstum, braun-grünes Substratmyzel; rot-braunes lösliches Pigment
  • (7) Auf Riestrick Medium, braunes Wachstum; dunkelbraunes Pigment
  • (8) Auf Czapek-Dock Medium, weiß-rosa Wachstum; rot-braunes Substratmyzel; kein lösliches Pigment
  • (9) Auf Bennet Medium, hell sandfarbenes Wachstum; braunes Pigment
  • (10) Auf Fleisch-Pepton Agar, hell sandfarbenes Wachstum; braunes lösliches Pigment
  • (11) Auf Glucose-Aspargin Medium, grünes Wachstum; kein lös­ liches Pigment.
3. Physiologische Eigenschaften
Bei dem erfindungsgemäßen Stamm handelt es sich um einen aero­ ben Stamm, der bei 28°C optimales Wachstum zeigt. Unter den Ei­ genschaften finden sich rot-orangenes Wachstum, Peptonisierung, Stärkehydrolyse und Gelatinverflüssigung auf einem Mais enthal­ tenden Medium. Mit Maltose und Lactose zeigt der Stamm ergiebi­ ges Wachstum, mit Rhamnose, Xylose, Arabinose und Galactose ge­ ringes Wachstums und mit Saccharose, Mannit und Sorbit kein Wachstum.
Die Unterschiede zwischen Elternstamm und vorliegenden Stamm in Bezug auf Morphologie und physiologische Eigenschaften sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Das Verfahren zur Gewinnung von Aclacinomycinen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Stammes umfaßt die folgenden Schritte: die Aufzucht von Streptomyces lavendofoliae DKRS in einem Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und andere Nährstoffe enthält, die im allgemeinen zur Fermentierung von Streptomyces Stämmen verwendet werden, um in der Brühe und in den Zellen Aclacinomycine anzusammeln und das Gewinnen der Aclacinomycine aus dieser Brühe und diesen Zellen.
Die bei der erfindungsgemäßen Aufzucht verwendeten Kohlenstoff­ quellen können Stärke und Sojabohnenmehl sein, wobei jedoch an­ dere Substanzen nicht ausgeschlossen sind. Die bei der erfin­ dungsgemäßen Kultivierung verwendeten Stickstoffquellen können Sojabohnenmehl und Ammoniumsulfate sein, wobei jedoch andere Substanzen nicht ausgeschlossen sind. Die bei der erfindungsge­ mäßen Fermentierung verwendeten anorganischen Bestandteile kön­ nen Kalziumkarbonat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat und Natrium­ chlorid sein, wobei jedoch andere Substanzen nicht ausgeschlos­ sen sind.
Die Fermentierung kann unter aeroben Bedingungen bei 28°-30°C, pH 7,2 über einen Zeitraum von 4-5 Tagen durchgeführt werden. Organische oder anorganische alkalische Materialien, Salmiak­ geist und Kalziumkarbonat können verwendet werden, um während der Fermentierung den pH-Wert einzustellen.
Die Aclacinomycine können von der Brühe oder den Zellen mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren zur Trennung von niedermole­ kularen Materialien separiert werden, z. B. durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton oder Chloroform und Säu­ lenchromatographie mit Kieselsäure. Vorzugsweise wird zur Iso­ lierung und Reinigung der Aclacinomycine und der Agklycone ein aus Toluol und Isopropanol (30 : 1-35 : 1 nach Volumen) bestehen­ des Lösungsmittelgemisch verwendet.
In der vorliegenden Erfindung können die in den Zellen ange­ sammelten Aclacinomycine durch eine Mischung aus Methanol und Chloroform (20 : 1) extrahiert und über HPLC analysiert werden.
Für die HPLC können Silika und eine Mischung aus Chloro­ form : Methanol : Essigsäure : Wasser : Triethanolamin (68 : 20 : 10 : 2 : 0,01 (v/v)) als stationäre bzw. mobile Phasen verwendet werden. Das Eluierungsmittel durchfließt die Säule mit einer Geschwindig­ keit von 1,0 ml/min und die Extinktionen der gesammelten Frak­ tionen werden bei 432 nm gemessen. Die Konzentrationen der Aclacinomycine A, B, Y und der Aglycone erhält man, indem man die absorbierenden Verweilzeiten der ursprünglichen Proben mit denen innerhalb der Zellen vergleicht.
Erfindungsgemäß wird Aclacinomycin A durch Verändern der Isolie­ rungsbedingungen und der Reinigungsschritte zu Aclacinomycin Y umgewandelt und umgekehrt. Diese Konversion ist wahrscheinlich nicht nur auf die Isolierungsbedingungen zurückzuführen, son­ dern auch auf gewisse enzymatische Aktivitäten der Zellen. Der größte Teil des in der Kulturbrühe und in den Zellen vorhan­ denen Aclacinomycin A wird in die Y-Form umgewandelt, wenn die Kulturbrühe mit Acetatpuffer auf einen pH-Wert von 4,4 einge­ stellt wird, wogegen Aclacinomycin Y in die A-Form umgewandelt wird, wenn die Kulturbrühe mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt wird. Demnach ist es möglich durch Einstellen des pH-Wertes der Kulturbrühe, aus der das Produkt entnommen wird, selektiv entweder Aclacinomycin A oder Y zu gewinnen.
Die Erfinder haben bestätigt, daß in reiner Form isoliertes Aclacinomycin Y im Vergleich zu den Aclacinomycinen A oder B eine größere Anti-Krebsaktivität gegen Darmkrebs und eine nied­ rigere Toxizität, selbst bei einer höheren Dosis, aufwies.
Die vorliegende Erfindung soll anhand von Beispielen - bevor­ zugte Ausführungsformen der Erfindung - im folgenden näher er­ läutert werden. Diese Beispiele dienen lediglich zu Erläute­ rung. Die Erfindung ist nicht darauf beschränkt.
Beispiel 1
Streptomyces lavendofoliae DKRS wurde auf ein Schrägmedium (Anmerkung 2) aufgegeben und bei 28°C fünf Tage lang inkubiert. Die so hergestellte Kultur wurde in einer 500 ml Sakaguchi- Schüttelflasche in 50 ml eines Saatkulturmediums (Anmerkung 3), das vorher auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt und bei 121°C 15 min lang sterilisiert worden war, eingeimpft. Die Inkubie­ rung erfolgte in einem Wechsel+72HWechselschüttler bei 250 rpm über einen Zeitraum von zwei Tagen. Ein Produktionsmedium (Anmerkung 4) wurde bei pH 7,5 eingestellt und die o.g. Saatkultur wurde ein­ geimpft, bis sich eine Konzentration von 10% einstellte. Die Fermentierung erfolgte dann bei 28°C über vier Tage unter Schütteln (500 rpm) und Luftzufuhr (2,0 vvm).
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Medien haben fol­ gende Zusammensetzung:
Anmerkung 2:
Schrägmedium: Stärke 2%, K₂HPO₄ 0,05%, MgSO₄ 0,05%, KNO₃ 0,1%, Salz 0,05%, Fe₂(SO₄)₃ 0,001%, Agar 1,5-2% (pH 7,2)
Anmerkung 3:
Saatkulturmedium: Glucose 2%, Stärke 1,5%, Soja­ bohnenmehl 1%, Hefeextrakt: 1%, CaCO₃ 0,3%, MgSO₄ 0,2%, NaCl 0.3% (pH 7,8)
Anmerkung 4:
Produktionsmedium: Glucose 3%, Stärke 3,5%, Soja­ bohnenmehl 1%, CaCO₃ 0,5%, MgSO₄ 0,02%, FeSO₄ 0,001%, ZnSO₄ 0,001%, (pH 7,5).
Der Elternstamm und die erfindungsgemäße Mutante wurden gemäß dem o.g. Verfahren gezüchtet und die pro Kultur anfallenden Menge Aclacinomycin wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Ta­ belle 2 festgehalten.
Tabelle 2
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße DKRS Stamm große Mengen an Aclacinomycin Y produziert und darüber hinaus eine im Vergleich zu dem Elternstamm RS gesteigerte Pro­ duktion an Aclacinomycin B aufweist. Es wird folglich davon ausgegangen, daß es sich hier um eine Mutante handelt, bei wel­ cher in einem Teil des Aufbauweges des Aclacinomycins als se­ kundären Metabolit eine Veränderung vorliegt.
Beispiel 2
In diesem Beispiel werden die Aclacinomycine von der Kultur­ brühe des Streptomyces lavendofoliae DKRS isoliert. Die aus Beispiel 1 stammende Kulturbrühe (700 ml) wurde mit Salzsäure auf einen pH von 4,5 eingestellt und zum Erhalt von Myzelen ge­ filtert. Zu den Myzelen wurde Chloroform zugegeben, so daß sich eine Konzentration von 2 ml/g Myzel einstellte. Die Mischung wurde eine Stunde lang gut durchgemischt und dann gefiltert. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt.
Das Cholorformfiltrat (120 ml) wurde gesammelt und in eine Va­ kuumverdampfer konzentriert. Dem Konzentrat wurden 15 ml einer Lösungsmittelmischung bestehend aus Butylacetat und Aceton (4 : 1) zugesetzt und darin vollständig gelöst. Zur Extrahierung von Produkten und Re-Extrahierung mit Chloroform wurde die sich ergebende Lösung mit Acetatpuffer (pH 3,4) behandelt. Nach dem Verdampfen des Chloroforms und dem Konzentrieren des Extraktes, wurde N-Hexan oder Petrolether zugegeben, um Aclacinomycin A (27 mg), B (35 mg) und Y (41 mg) zu präzipitieren.
Beispiel 3
Die aus Beispiel 1 stammende Kulturbrühe (700 ml) wurde mit Salzsäure auf einen pH von 4,6 eingestellt und die Mischung wurde bei 28°C drei Stunden lang gut durchgemischt. Daraufhin wurden die Verfahrensschritte aus Beispiel 2 wiederholt und es ergaben sich folgende Mengen: Aclacinomycin A (50 mg), B (20 mg), Y (13 mg).
Beispiel 4
Die aus Beispiel 1 stammende Kulturbrühe (700 ml) wurde mit Acetatpuffer auf einen pH von 4,4 eingestellt und die Mischung wurde bei 28°C 3 Stunden lang gut durchgemischt. Daraufhin wur­ den die Verfahrensschritte aus Beispiel 2 wiederholt und es er­ gaben sich folgenden Mengen: Aclacinomycin A (3 mg), B (40 mg), Y (50 mg).
Beispiel 5
Ein Fermentierungsmedium (5 l) mit der Zusammensetzung laut An­ merkung 5 wurde in einen 10 l Fermentierer gegeben und auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Eine Saatkultur aus Beispiel 1 wurde auf eine Konzentration von 10% gebracht, und die Fer­ mentierung wurde bei 28°C über einen Zeitraum von vier Tagen unter Schütteln (350 rpm) und Luftzufuhr (1,0 vvm) durchge­ führt.
Anmerkung 5:
Fermentierungsmedium: Glucose 3%, Stärke 5,5%, Sojabohnenmehl 1,5%, CaCO₃ 0,9%, MgSO₄ 0,25%, ZnSO₄ 0,002%, FeSO₄ 0,002%.
Die sich ergebende Kulturbrühe (3,5 l) enthält folgende Mengen an Aclacinomycinen: Aclacinomycin A (245 mg), B (315 mg), Y (560 mg). Die Brühe wurde mit Salzsäure auf einen pH von 4,6 eingestellt und zum Erhalt von Myzelen zentrifugiert. Den Myzelen wurden 1,5 l Chloroform zugegeben und es wurde eine Stunde lang gut durchgemischt. Dies wurde zweimal wiederholt.
Dem Filtrat wurden zum Extrahieren der Aclacinomycine 600 ml Chloroform zugegeben.
Die so erhaltenen Chloroformextrakte wurden zusammengegeben und im Vakuum konzentriert. Die Präzipitate wurden in einem Lö­ sungsmittel bestehend aus Butylacetat und Aceton (4 : 1 Vol.) ge­ löst. Die sich ergebende Lösung wurde mit Natriumsulfat ver­ setzt und die Mischung wurde filtriert und konzentriert. Zum Erhalt der Präzipitate wurde dann N-Hexan zugegeben. Die fol­ gende Evaporierung führte zu 1,5 g einer Mischung von Aclacino­ mycinen.
Beispiel 6
Die Mischung von Aclacinomycinen (1,5 g) aus Beispiel 5 wurde in einer Mindestmenge Lösungsmittel bestehend aus Toluol und Chloroform (8 : 2 Vol.) gelöst, und dann auf einer mit Kiesel­ säure beladenen Säule chromatografiert. Das dazu verwendete Eluierungsmittel war Toluol. Nach dem die Aglykon enthaltenden Fraktionen eluiert worden waren, wurde das Eluiermittel gewech­ selt; es wurde ein Lösungsmittel bestehend aus Toluol und Iso­ propanol (35 : 1 Vol.) verwendet und man erhielt Aclacinomycin B enthaltende Fraktionen. Dann wurde Lösungsmittel bestehend aus Toluol und Isopropanol (30 : 1 Vol.) als Eluierungsmittel verwen­ det und man erhielt Aclacinomycin Y enthaltende Fraktionen.
Den Fraktionen wurde zum Präzipitieren der jeweiligen Produkte n-Hexan bzw. Petrolether zugegeben. Die Präzipitate wurden ge­ trocknet. Es ergaben sich folgende Mengen: Aglycon (10 mg), Aclacinomycin B (154 mg), Y (182 mg) und A (75 mg). Alle Sub­ stanzen liegen als gelbes Pulver vor.

Claims (6)

1. Streptomyces lavendofoliae KCTC 0092BP.
2. Verfahren zur Gewinnung der Aclacinomycine A, B, Y und de­ ren Aglycone, umfassend die Aufzucht von Streptomyces lavendo­ foliae KCTC 0092BP in einem Medium, so daß sich die Aclacinomy­ cine A, B, Y und deren Aglycone in der Brühe und in den Zellen ansammeln, und diese aus der Brühe und den Zellen entnommen und gereinigt werden.
3. Das Verfahren zur Gewinnung der Aclacinomycine A, B, Y und deren Aglycone nach Anspruch 2, wobei die Aufzucht bei 28°-30°C, bei einem pH-Wert von 6,8-7,5 und unter aeroben Bedin­ gungen erfolgt.
4. Das Verfahren zur Gewinnung der Aclacinomycine A, B, Y und deren Aglycone nach Anspruchs 2, wobei die Aclacinomycine A, B, Y und deren Aglycone mit Hilfe eines aus Toluol und Isopropanol (30 : 1-35 : 1 Vol.) bestehenden Lösungsmittels aus der Brühe und den Zellen gewonnen und gereinigt werden.
5. Verfahren zur Gewinnung von Aclacinomycin Y, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: die Aufzucht von Streptomyces lavendofoliae KCTC 0092BP in einem Medium, so daß sich die Aclacinomycine A, B, Y und deren Aglycone in der Brühe und in den Zellen ansammeln, das Einstellen der Brühe mit Ace­ tatpuffer auf einen pH-Wert von 4,4 und das Gewinnen von Aclacinomycin Y aus der Brühe und den Zellen.
6. Verfahren zur Gewinnung von Aclacinomycin A, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt die Aufzucht von Streptomyces lavendofoliae KCTC 0092BP in einem Medium, so daß sich die Aclacinomycine A, B, Y und deren Aglycone in der Brühe und in den Zellen ansammeln, das Einstellen der Brühe mit Salz­ säure auf einen pH-Wert von 4,6 und das Gewinnen von Aclacinomycin A aus der Brühe und den Zellen.
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