NL9400096A - Nieuwe Streptomyces-stam en werkwijze voor het bereiden van antitumormiddelen daarmee. - Google Patents

Nieuwe Streptomyces-stam en werkwijze voor het bereiden van antitumormiddelen daarmee. Download PDF

Info

Publication number
NL9400096A
NL9400096A NL9400096A NL9400096A NL9400096A NL 9400096 A NL9400096 A NL 9400096A NL 9400096 A NL9400096 A NL 9400096A NL 9400096 A NL9400096 A NL 9400096A NL 9400096 A NL9400096 A NL 9400096A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
aclacinomycin
culture medium
medium
aclacinomycins
cells
Prior art date
Application number
NL9400096A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Dongkook Pharmaceutical Co
Ki Beom Kwon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dongkook Pharmaceutical Co, Ki Beom Kwon filed Critical Dongkook Pharmaceutical Co
Publication of NL9400096A publication Critical patent/NL9400096A/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P15/00—Preparation of compounds containing at least three condensed carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/56—Streptomyces lavendulae
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Nieuwe Streptomvces-stam en werkwijze voor het bereiden van antitumormiddelen daarmee
De uitvinding betreft een nieuwe stam van het genus Streptomvces en een werkwijze voor het bereiden van de antitumormiddelen aclacinomycine A, B, Y en aglyconen daarvan door het kweken van deze stam.
Aclacinomycine is een antitumormiddel van de anthracyclinegroep, dat een pyrroolring en drie deoxypyrano-seresten bevat. Het vertoont een cytotoxische werking doordat het tussen de baseparen van het DNA wordt geschoven en zodoende de synthese van nucleïnezuren remt. Bovendien remt het selectief de synthese van RNA, in tegenstelling tot andere anthracyclinen zoals daunorubicine, doxorubicine en carminomycine. Verder is het werkzaam tegen acute leukemie en maligne lymfomen, terwijl de giftigheid voor het hart gering is.
Aclacinomycine kan worden verdeeld in drie typen, namelijk aclacinomycine A, B en Y. Zij hebben als essentieel bestanddeel een aglyconrest met de naam aklavine. Van deze drie typen wordt aclacinomycine B nauwelijks klinisch toegepast omdat het neveneffekten vertoont en een lage antitumor-werking heeft. Aclacinomycine A wordt wel in de praktijk gebruikt vanwege zijn sterke antikanker- of antitumorwer-king, zijn geringe neveneffekten en zijn hoge opbrengst bij de bereiding. Aangenomen wordt dat aclacinomycine Y het meest nuttige antikankermiddel is, aangezien het een hoge antitumorwerking heeft en weinig neveneffekten vertoont. De opbrengst van aclacinomycine Y bij winning uit het kweekme-dium van Streptomyces is echter gering, zodat het sterk gewenst is om de opbrengst van de bereidingswijze te verbeteren.
In het Amerikaanse octrooischrift 3.988.315 wordt een werkwijze voor het bereiden van aclacinomycinen door fermentatie van Streptomvces aalilaeus beschreven. Dit octrooischrift geeft aan dat Streptomvces qalilaeus ca. 18 analogen produceert, waaronder aclacinomycine A, B en Y. De opbrengst aan deze stoffen is echter gering, want: aclacinomycine A wordt als hoofdprodukt verkregen in een hoeveelheid van 46 mg per liter kweekmedium, aclacinomycine B wordt verkregen in een hoeveelheid van 23 mg/1 en andere stoffen met inbegrip van aclacinomycine Y worden in een extreem kleine hoeveelheid gevormd. Met de genoemde Streotomvces-stam is het derhalve moeilijk om aclacinomycinen op industriële schaal te bereiden, zodat behoefte bestaat aan een nieuwe stam die in staat is om aclacinomycinen in hogere opbrengst te leveren.
Bij eerder onderzoek van de onderhavige uitvinders naar een methode voor het bereiden van aclacinomycinen door fermentatie op industriële schaal is reeds een stam Strepto-mvces lavendofoliae 12/3A gevonden, die in staat is om aclacinomycine A en B te produceren. Verder onderzoek naar het verkrijgen van een verbeterde stam die een grotere hoeveelheid aclacinomycinen levert heeft thans geleid tot het vinden van de mutant Streptomvces lavendofoliae DKRS, die van de stam 12/3A is afgeleid.
De uitvinding verschaft derhalve de nieuwe Strep-tomvces-stam Streptomvces lavendofoliae DKRS, die in staat is om een grote hoeveelheid aclacinomycine A, B, Y en agly-conen daarvan te produceren.
Verder verschaft de uitvinding een werkwijze voor het bereiden van aclacinomycinen door het kweken van de stam Streptomvces lavendofoliae DKRS en het winnen van de aclacinomycinen uit het kweekmedium en de cellen.
Daarnaast verschaft de uitvinding een werkwijze voor het selectief bereiden van aclacinomycine A of Y door instellen van de pH van een kweekmedium op een bepaalde waarde met behulp van een acetaatbuffer of zoutzuur na het kweken van de stam Streptomvces lavendofoliae DKRS.
Thans zal de uitvinding meer in detail worden besproken.
De stam Streptomvces lavendofoliae 12/3A, die de moederstam van Streptomvces lavendofoliae DKRS volgens de uitvinding vormt, kan 60 mg/1 aclacinomycine A en 10 mg/1 aclacinomycine B leveren.
De stam Streptomvces lavendofoliae DKRS volgens de uitvinding kan worden verkregen door de moederstam Streptomvces lavendofoliae 12/3A tot mutatie te brengen met behulp van een mutagene chemische stof, N-nitrosomethylbiureet (NMB). De mutant is in staat om aclacinomycine A, B, Y en aglyconen daarvan te vormen en levert in het bijzonder een grote hoeveelheid aclacinomycine Y.
De mutant volgens de uitvinding werd met de volgende methode geselecteerd. Na 6-7 dagen kweken van Strepto-myces lavendofoliae 12/3A in een compleet vast medium bij 30°C, werden de sporen met behulp van een glaswol filter afgefiltreerd, 3 maal gewassen met 0,05 M Tris-malaatbuffer van pH 6,5 en daarna met dezelfde buffer verdund tot een concentratie van 106-108 sporen/ml. Na toevoeging van NMB aan de sporensuspensie in een eindconcentratie van 500 μg/ml mocht het mengsel 20 minuten bij 30°C blijven staan. Na voltooiing van de reaktie werden de sporen door centrifugeren of filtreren geïsoleerd, 3 maal gewassen met een steriele fysiologische zoutoplossing en uitgestreken op een compleet agarmedium. Na 7-10 dagen kweken bij 30°C verschenen koloniën van de mutant op de agarplaat.
De mutant volgens de uitvinding, Streptomvces lavendofoliae DKRS, is op 26 augustus 1993 gedeponeerd bij de "Korean Collection for Type Cultures" in Taejeon, Korea, en heeft daar het toelatingsnummer KCTC 8539P verkregen. Het depot werd op 26 augustus 1993 omgezet in een depot onder het verdrag van Budapest, waarbij het toelatingsnummer KCTC 0092BP werd verkregen.
Het bij de uitvinding gebruikte complete voedings-medium heeft de volgende samenstelling: 10,0% glucose, 0,2% caseïnehydrolysaat, 0,1% vleesextract, 0,1% gistextract en 1,5% agar, pH 7,0-7,2.
De stam Streptomvces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) volgens de uitvinding heeft de volgende microbiologische eigenschappen: 1. Morfologische eigenschappen:
Na kweken van de stam in een vast medium blijkt onder de microscoop dat het substraat zich niet in segmenten verdeelt. De sporen zijn ellipsvormig en vormen matig lange kettingen. De sporen meten ca. 2,3 Mm x 1,4 Mm en vormen oidiën, waarbij het oppervlak glad is.
2. Eigenschappen op diverse media:
Bij incubatie bij 28°C in de volgende vaste media vertoont de stam volgens de uitvinding de volgende eigenschappen : (1) op het medium van Waksman: groene groei, rose-bruin oplosbaar pigment.
(2) op het medium van Gaus-I: rose-witte groei, rood-bruin substraatmycelium, geen oplosbaar pigment.
(3) op een medium van havermeel: grijze groei, rood-bruin substraatmycelium, geen oplosbaar pigment.
(4) op een maïsmedium: donkerbruine groei, donkerbruin substraatmycelium.
(5) op het medium van Gaus-II: groen-bruine groei, donkerbruin substraatmycelium, donkerbruin oplosbaar pigment.
(6) op een sojamedium: lichtgroene groei, bruin-groen substraatmycelium, roodbruin oplosbaar pigment.
(7) op het medium van Riestrick: bruine groei, donkerbruin oplosbaar pigment.
(8) op het medium van Czapek-Dock: wit-rose groei, roodbruin substraatmycelium, geen oplosbaar pigment.
(9) op het medium van Bennet: licht zandkleurige groei, geen oplosbare pigmenten.
(10) op vlees-pepton agar, licht zandkleurige groei, bruin oplosbaar pigment.
(11) op een medium van glucose en asparagine: groene groei, geen oplosbaar pigment.
3. Fysiologische eigenschappen:
De stam volgens de uitvinding is aëroob en groeit optimaal bij 28°C. Hij vertoont een rood-oranje groei, peptonisatie, zetmeelhydrolyse en gelatinevervloeiing op een medium dat maïsmeel bevat. De stam groeit overvloedig met maltose en lactose, zwak met rhamnose, xylose, arabinose en galactose, en groeit niet met saccharose, mannitol en sorbitol.
De verschillen in morfologie en fysiologische eigenschappen tussen de moederstam en de onderhavige stam zijn in tabel 1 weergegeven.
Figure NL9400096AD00061
Figure NL9400096AD00071
a) De gebruikte symbolen onder het hoofd "verbruik van koolhydraten" hebben hier de volgende betekenis: +++: overvloedige groei, +: positieve groei, geen groei, ND: geen waarneming
De werkwijze voor het bereiden van aclacinomycinen onder toepassing van de stam volgens de uitvinding omvat het kweken van Streptomvces lavendofoliae DKRS in een medium dat koolstofbronnen, stikstofbronnen en andere voedingsstoffen bevat die gewoonlijk bij de fermentatie van Streotomyces-stammen worden gebruikt om aclacinomycinen in het kweekmedi-um en binnen de cellen te accumuleren, gevolgd door het winnen van deze aclacinomycinen uit het kweekmedium en de cellen.
De bij de kweekmethode volgens de uitvinding gebruikte koolstofbronnen kunnen zetmeel en sojameel omvat ten, maar zijn niet daartoe beperkt. De bij de kweekmethode volgens de uitvinding gebruikte stikstofbronnen kunnen sojameel en ammoniumsulfaat omvatten maar zijn eveneens niet daartoe beperkt. De bij het fermenteren volgens de uitvinding gebruikte anorganische componenten kunnen calciumcarbo-naat, magnesiumsulfaat, zinksulfaat en natriumchloride omvatten, maar zijn niet daartoe beperkt.
De fermentatie kan 4-5 dagen onder aerobe omstandigheden bij 28-30°C en pH 7,2 worden uitgevoerd. Ter instelling van de pH tijdens de fermentatie kunnen organische of anorganische alkalische stoffen, ammoniakwater en calci-umcarbonaat worden gebruikt.
De aclacinomycinen kunnen uit het kweekmedium of de cellen worden afgescheiden met een gebruikelijke methode voor het isoleren van laag moleculaire stoffen, bijv. door extractie met organische oplosmiddelen zoals aceton of chloroform en door kolomchromatografie op kiezelzuur. Voor het isoleren of zuiveren van aclacinomycinen en aglyconen daarvan wordt bij voorkeur een oplosmiddelmengsel van tolueen en isopropanol (volumeverhouding 30:1 tot 35:1) gebruikt .
Bij de onderhavige uitvinding kunnen de aclacinomycinen, die zich in de cellen hebben opgehoopt, worden uitgetrokken met behulp van een mengsel van methanol en chloroform (20:1) en geanalyseerd met hoge-druk-vloeistof-chromatografie (HPLC). Voor de HPLC kan silica als stationaire fase en een mengsel van chloroform:methanol:azijn-zuur:water:triethanolamine (68:20:10:2:0,01) (v/v) als mobiele fase worden gebruikt. Het elutiemiddel wordt door de kolom gevoerd met een stroomsnelheid van 1,0 mm/min., terwijl in de verzamelde frakties de absorbantie bij 432 nm wordt gemeten. De concentratie aan aclacinomycine A, B, Y en aglyconen daarvan binnen de cellen kan worden berekend door vergelijking van de absorberende verblijfstijd van authentieke monsters met die van de stoffen binnen de cellen.
Volgens de uitvinding kan aclacinomycine A in aclacinomycine Y worden omgezet en terug door wijziging van de omstandigheden van isolering en zuivering. Deze omzetting hangt waarschijnlijk niet alleen van de isoleringsomstandig-heden af maar ook van een bepaalde enzymatische werking van de cellen. Het meeste aclacinomycine A dat zich in het kweekmedium en binnen de cellen bevindt, wordt door instelling van het kweekmedium met een acetaatbuffer op pH 4,4 tot aclacinomycine Y omgezet, terwijl dit aclacinomycine Y tot aclacinomycine A wordt omgezet als het kweekmedium met zoutzuur op pH 4,6 wordt ingesteld. Zodoende is het mogelijk om selectief aclacinomycine A of aclacinomycine Y te verkrijgen door instelling van de pH van het kweekmedium waaruit het produkt wordt gewonnen.
Het is gebleken dat het zuivere geïsoleerde aclacinomycine Y een grotere antikankerwerking tegen kanker van de dikke darm en zelfs bij hogere dosis een lagere giftigheid heeft dan aclacinomycine A of aclacinomycine B.
De uitvinding wordt nader geïllustreerd door de volgende voorbeelden, die niet beperkend mogen worden opgevat.
Voorbeeld I
Een voedingsmedium in een scheefstaande buis (opmerking 2) werd geënt met een hoeveelheid Streptomyces lavendofoliae DKRS, aanwezig in een draadlus van platina. Daarna werd het medium vijf dagen bij 28°C geïncubeerd. De verkregen cultuur werd geënt op 50 ml voedingsmedium voor een uitzaaicultuur (opmerking 3) dat zich in een schudkolf van 500 ml volgens Sakaguchi bevond en vooraf op pH 7,8 was ingesteld en 15 minuten bij 121°C was gesteriliseerd. Dit medium werd twee dagen op een heen-en-weergaand schudtoestel bij 250 rpm geïncubeerd. Vervolgens werd een produktiemedium (opmerking 4) op pH 7,5 ingesteld en met de genoemde uitzaaicultuur geënt tot een concentratie van 10%. In dit produktiemedium werd de stam 4 dagen bij 28°C onder roeren (500 rpm) en beluchting (2,0 wm) gefermenteerd.
De bij de uitvinding gebruikte voedingsmediums hadden de volgende samenstelling:
Opmerking 2: medium in schuinstaande buis: zetmeel 2%, K2HP04 0,05%, MgS04 0,05%, KN03 0,1%, zout 0,05%, Fe2(S04)3 0,001%, agar 1,5-2% (pH 7,2).
Opmerking 3: medium voor uitzaaicultuur: glucose 2%, zetmeel 1,5%, sojameel 1%, gistextract 1%, CaC03 0,3%, MgS04 0,2%, NaCl 0,3% (pH 7,8).
Opmerking 4: produktiemedium: glucose 3%, zetmeel 3,5%, sojameel 1%, CaC03 0,5%, MgS04 0,2%, FeS04 0,001%, ZnS04 0,001% (pH 7,5).
De moederstam en de mutant volgens de uitvinding werden met de bovenstaande procedure gekweekt, waarna de in elk cultuurmedium gevormde hoeveelheid aclacinomycine werd gemeten. De resultaten zijn weergegeven in tabel 2.
Figure NL9400096AD00101
Zoals blijkt uit tabel 2 levert de stam DKRS van de uitvinding een grote hoeveelheid aclacinomycine Y en is de produktie van aclacinomycine B in vergelijking met de moederstam RS verbeterd. Aangenomen wordt dan ook dan de stam DKRS een mutant is, waarin een deel van de syntheserou-te van aclacinomycine als secondair metaboliet is veranderd.
Voorbeeld II
In dit voorbeeld werden aclacinomycinen geïsoleerd uit het cultuurmedium van Streptomvces lavendofoliae DKRS. Het in voorbeeld I verkregen cultuurmedium (700 ml) werd met zoutzuur op pH 4,5 ingesteld waarna het mycelium werd afge-filtreerd en het filtraat met chloroform werd geëxtraheerd. Aan het mycelium werd chloroform toegevoegd tot een concentratie van 2 ml/g mycelium, waarna het mengsel 1 uur werd dooreengemengd en gefiltreerd. Deze methode werd tweemaal herhaald.
De chloroformhoudende filtraten (120 ml) werden samengevoegd en in een vacuümverdamper geconcentreerd. Het concentraat werd opgenomen in 15 ml oplosmiddelmengsel van butylacetaat en aceton (4:1) en goed daarin opgelost. De verkregen oplossing werd geëxtraheerd met een acetaatbuffer (pH 3,4), die op zijn beurt weer met chloroform werd geëxtraheerd. Na afdampen van de chloroform en concentreren van het extract werd n-hexaan of petroleumether toegevoegd, waardoor een neerslag van 27 mg aclacinomycine A, 35 mg aclacinomycine B en 41 mg aclacinomycine Y werd verkregen.
Voorbeeld III
De in voorbeeld I verkregen cultuurvloeistof (700 ml) werd met zoutzuur op pH 4,6 ingesteld waarna het mengsel 3 uren bij 28°C werd dooreengemengd. Daarna werd de methode van voorbeeld II herhaald, waarbij 50 mg aclacinomycine A, 20 mg aclacinomycine B en 13 mg aclacinomycine Y werd verkregen .
Voorbeeld IV
De in voorbeeld I verkregen cultuurvloeistof (700 ml) werd met een acetaatbuffer op pH 4,4 ingesteld, waarna het mengsel 2 uren bij 28°C werd dooreengemengd. Vervolgens werd de methode van voorbeeld II herhaald, waarbij 3 mg aclacinomycine A, 40 mg aclacinomycine B en 50 mg aclacinomycine Y werd verkregen.
Voorbeeld V
Een fermentatiemedium (5 1) met de volgende samenstelling (opmerking 5) werd in een fermenter van 10 1 gebracht en op pH 7,5 ingesteld. Dit medium werd geënt met een in voorbeeld I verkregen uitzaaicultuur tot een concentratie van 10% waarna het geheel 4 dagen bij 28°C onder roeren (350 rpm) en beluchting (1,0 wm) werd gefermenteerd.
Opmerking 5: fermentatiemedium: glucose 3%, zetmeel 5,5%, sojameel 1,5%, CaC03 0,9%, MgS04 0,25%, ZnS04 0,002%, FeS04 0,002%.
Het zo verkregen cultuurmedium (3,5 1) bevatte 250 mg aclacinomycine A, 315 mg aclacinomycine B en 560 mg aclacinomycine Y. Het cultuurmedium werd met zoutzuur op pH 4,6 ingesteld waarna het mycelium werd afgecentrifugeerd.
Aan het mycelium werd 1,5 1 chloroform toegevoegd, l uur goed dooreengemengd en afgefiltreerd. Deze methode werd tweemaal herhaald.
Anderzijds werd 600 ml chloroform aan het filtraat toegevoegd ter extractie van aclacinomycinen.
De zo verkregen chloroformextracten werden samengevoegd en onder vacuüm geconcentreerd. De residu's werden opgelost in een mengsel van butylacetaat en aceton (volume-verhouding 4:1). De verkregen oplossing werd vermengd met natriumsulfaat waarna het mengsel werd gefiltreerd en geconcentreerd. Tenslotte werd n-hexaan toegevoegd ter verkrijging van een neerslag. Door afdampen werd 1,5 g mengsel van aclacinomycinen verkregen.
Voorbeeld VI
Het in voorbeeld V verkregen mengsel van aclacinomycinen (1,5 g) werd opgelost in een minimale hoeveelheid mengsel van tolueen en chloroform (volumeverhouding 8:2) en onderworpen aan chromatografie op een kolom van kiezelzuur. Als elutiemiddel werd tolueen gebruikt. Nadat frakties met aglyconen waren geëlueerd, werd het elutiemiddel vervangen door een mengsel van tolueen en isopropanol (volumeverhouding 35:1), waardoor frakties met aclacinomycine B werden verkregen. Daarna werd een mengsel van tolueen en isopropanol (volumeverhouding 30:1) als elutiemiddel gebruikt, waardoor frakties met aclacinomycine Y werden verkregen.
Aan elk van de frakties met één der genoemde produkten werd n-hexaan of petroleumether toegevoegd ter verkrijging van een neerslag. De neerslagen werden gedroogd en leverden toen 10 mg aglyconen, 154 mg aclacinomycine B, 182 mg aclacinomycine Y en 75 mg aclacinomycine A. Al deze produkten verkeerden in de vorm van een geel poeder.

Claims (7)

1. Een zuiver geïsoleerde cultuur van Streptomvces lavendofoliae DKRS met de identificatiekenmerken van de gedeponeerde cultuur KCTC 0092BP, welke in staat is om de aclacinomycinen A, B en Y en aglyconen daarvan te produceren.
2. Cultuur van Streptomvces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) volgens conclusie 1, welke in staat is om aclacinomycine A in aclacinomycine Y om te zetten als het cultuurmedium daarvan met een acetaatbuffer op pH 4,4 wordt ingesteld en welke in staat is om aclacinomycine Y in aclacinomycine A om te zetten als het cultuurmedium daarvan met zoutzuur op pH 4,6 wordt ingesteld.
3. Werkwijze voor het bereiden van aclacinomycinen A, B en Y en aglyconen daarvan, gekenmerkt door het kweken van Streptomvces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) in een voedingsmedium ter verkrijging van de aclacinomycinen A, B en Y en aglyconen daarvan in het medium en in de cellen, gevolgd door het winnen van deze stoffen uit het cultuurmedium en de cellen, en het zuiveren daarvan.
4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het kweken wordt uitgevoerd bij 28-30°C en pH 6,8-7,5 onder aerobe kweekomstandigheden.
5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de aclacinomycinen A, B en Y en de aglyconen daarvan uit het kweekmedium en de cellen worden gewonnen en gezuiverd met behulp van een oplosmiddelmengsel van tolueen en isopro-panol (volumeverhouding 30:1 tot 35:1).
6. Werkwijze voor het bereiden van aclacinomycine Y, gekenmerkt door het kweken van Streptomvces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) in een voedingsmedium ter verkrijging van de aclacinomycinen A, B en Y en aglyconen daarvan in het kweekmedium en binnen de cellen, gevolgd door het instellen van het kweekmedium met acetaatbuffer op een pH van 4,4 en het winnen van aclacinomycine Y uit het kweekmedium en de cellen.
7. Werkwijze voor het bereiden van aclacinomycine A, gekenmerkt door het kweken van Streotomvces lavendofoliae DKRS (KCTC 0092BP) in een voedingsmedium ter verkrijging van aclacinomycinen A, B en Y en aglyconen daarvan in het kweek-medium en binnen de cellen, gevolgd door instellen van het kweekmedium met zoutzuur op een pH van 4,6 en winnen van aclacinomycine A uit het kweekmedium en de cellen.
NL9400096A 1993-09-03 1994-01-20 Nieuwe Streptomyces-stam en werkwijze voor het bereiden van antitumormiddelen daarmee. NL9400096A (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR930017589 1993-09-03
KR1019930017589A KR970000591B1 (ko) 1993-09-03 1993-09-03 신균주 스트렙토마이세스 라벤도폴리아 DKRS 및 이를 이용한 아클라시노마이신 A, B, Y 및 아글리콘(Aglycone)의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9400096A true NL9400096A (nl) 1995-04-03

Family

ID=19362801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9400096A NL9400096A (nl) 1993-09-03 1994-01-20 Nieuwe Streptomyces-stam en werkwijze voor het bereiden van antitumormiddelen daarmee.

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5468637A (nl)
JP (1) JP2718002B2 (nl)
KR (1) KR970000591B1 (nl)
CN (2) CN1104682A (nl)
CA (1) CA2113871C (nl)
CH (1) CH688151A5 (nl)
DE (1) DE4401546C2 (nl)
ES (1) ES2078875B1 (nl)
FR (1) FR2709497B1 (nl)
GB (1) GB2281563B (nl)
IT (1) IT1273049B (nl)
NL (1) NL9400096A (nl)
TW (1) TW258754B (nl)

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071411A (en) * 1974-07-27 1978-01-31 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Antitumor antibiotics aclacinomycins A and B [RD-9187A]
JPS5134915B2 (nl) * 1974-07-27 1976-09-29
US4204038A (en) * 1976-04-07 1980-05-20 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Process for preparing antibiotics MA 144-M1 and MA 144-M2
US4209588A (en) * 1976-10-05 1980-06-24 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Process for producing new antitumor anthracycline antibiotics
NL176004C (nl) * 1976-10-05 1985-02-01 Microbial Chem Res Found Werkwijze ter bereiding van geneesmiddelen met antitumorwerking op basis van anthracycline glycosiden en werkwijze ter bereiding van daartoe dienende anthracycline glycosiden.
JPS5648893A (en) * 1979-09-07 1981-05-02 Sanraku Inc Preparation of anthracycline glycoside
DE3164574D1 (en) * 1980-10-27 1984-08-09 Hoffmann La Roche Process for aclacinomycins and microorganism used therein
ATE11142T1 (de) * 1980-10-27 1985-01-15 F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Herstellung von anthracyclinglycosiden.
US4405713A (en) * 1981-12-28 1983-09-20 Hoffmann-La Roche Inc. Process for the preparation of optically active anthracycline glycosides A and B
US4471052A (en) * 1982-01-18 1984-09-11 Adria Laboratories, Inc. Biosynthesis of simplified anthracyclines
SU1069433A1 (ru) * 1982-06-29 1984-11-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков Штамм @ @ 12/3а-продуцент аклациномицинов @ и @

Also Published As

Publication number Publication date
DE4401546A1 (de) 1995-03-30
GB2281563A (en) 1995-03-08
JPH0775575A (ja) 1995-03-20
FR2709497A1 (fr) 1995-03-10
KR950008679A (ko) 1995-04-19
TW258754B (nl) 1995-10-01
US5468637A (en) 1995-11-21
GB2281563B (en) 1998-01-28
IT1273049B (it) 1997-07-01
CN1104682A (zh) 1995-07-05
CH688151A5 (fr) 1997-05-30
CN1108694A (zh) 1995-07-05
FR2709497B1 (fr) 1996-11-15
DE4401546C2 (de) 1997-09-25
ES2078875B1 (es) 1996-08-16
GB9400513D0 (en) 1994-03-09
ITMI940035A0 (it) 1994-01-14
JP2718002B2 (ja) 1998-02-25
US5484712A (en) 1996-01-16
ITMI940035A1 (it) 1995-07-14
KR970000591B1 (ko) 1997-01-14
ES2078875A1 (es) 1995-12-16
CA2113871A1 (en) 1995-03-04
CA2113871C (en) 2000-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0271581A1 (en) Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US5108912A (en) Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
EP0050724B1 (en) Process for anthracycline glycosides
EP0050725B1 (en) Process for aclacinomycins and microorganism used therein
EP0275966B1 (en) A doxorubicin derivative, a process for preparing the same, pharmaceutical preparations comprising the same, and the use of the same for the manufacture of useful medicaments
JP2504450B2 (ja) ダウノルビシンに関連した新規生合成アントラサイクリン
EP0072974B1 (en) Anthracycline antibiotics and their preparation method
US4843008A (en) Novel microorganisms and a novel process for producing antibiotics
NL9400096A (nl) Nieuwe Streptomyces-stam en werkwijze voor het bereiden van antitumormiddelen daarmee.
US4401812A (en) Anthracycline antibiotics
EP0242695B1 (en) New anthracycline antibiotics dcp-1 and 2
US4592999A (en) Process for producing daunomycin
US5194371A (en) Production of pradimicin antibiotics
US4421851A (en) Antitumor antibiotics
JPH05117298A (ja) デプシペプチドａ、ｂその製造方法、並びに抗ウイルス剤及び抗菌剤
KR960016591B1 (ko) 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신을 미생물에 의해 입체 선택적으로 환원시켜 수득한 항종양제
AU601857B2 (en) A new antitumor agent obtained by microbial stereoselective reduction of 4'-deoxy-4'-iododoxorubicin
GB2036021A (en) Antitumor antibiotics
FI90566B (fi) Mikrobiologinen menetelmä 4'-13(S)-dihydro-4'-jodidoksorubisiinin valmistamiseksi
EP0399505B1 (en) Physiologically active compounds SN-198C and method and bacteria for their production
EP0435221A2 (en) New benzanthracene compound and a process for preparing the same
JPS6253518B2 (nl)
GB2131793A (en) A daunorubicin derivative
EP0205981A2 (en) A novel anti-tumor and antimicrobial compound, its microbiological preparation and its use as medicament
JP2000508546A (ja) 抗腫瘍性アントラサイクリン二糖類

Legal Events

Date Code Title Description
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
BM The application is based on a (several) micro-organism(s)
BN A decision not to publish the application has become irrevocable