DE1770204B1 - Adriamycin und dessen Salze mit pharmakologisch vertraeglichen anorganischen und organischen Saeuren sowie diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen - Google Patents
Adriamycin und dessen Salze mit pharmakologisch vertraeglichen anorganischen und organischen Saeuren sowie diese enthaltende therapeutische ZusammensetzungenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Adriamycin und dessen Salze mit pharmakologisch verträglichen
anorganischen und organischen Säuren sowie auf diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen.
Sie sind neue antibiotische Substanzen, die in der Therapie insbesondere als Antitumorprodukte
von Nutzen sind. Adriamycin wird auch als Antibiotikum »B-106 F.I.« bezeichnet.
Adriamycin wird unter Anwendung eines neuen Mikroorganismus, der durch Mutation aus dem
bekannten Stamm Streptomyces peucetius, der in der britischen Patentschrift 1 003 383 und in Giorn.
Microbiol., Bd. 11, 1963, S. 109 bis 118, beschrieben worden ist, biosynthetisch hergestellt. Der neue Stamm
ist unter der Bezeichnung F.I. 106 in der mikrobiologischen Sammlung von Farmitalia hinterlegt. Er
wird Streptomyces peucetius var. caesius genannt. Er ist ferner bei dem Commonwealth Mycological
Institute, Ferry Lane, Kew, Surry (England) mit der Indexnummer I.M.I. 131 502 und bei dem Institute
of Microbiology of the Rutger University (U.S.A.) mit der Indexnummer I. M. R. U. 3920 hinterlegt.
Der neue Mikroorganismus hat folgende mikroskopische, makroskopische und biochemische Eigenschaften:
Mikroskopische Eigenschaften
Das vegetative Mycel auf den üblichen Kulturmedien zeigt dünne Hyphen (0,5 bis 0,9 μ dick), die
mehr oder weniger lang und verzweigt sind. Die Verzweigungen bilden dickere Hyphen (1,1 bis 1,6 μ
dick), die Conidiophoren sind oft in büschelförmigen Formen, die in Haken enden, gesammelt. Die Conidien
sind sphärisch mit einem Durchmesser zwischen 1,8 und 3,3 μ, zuerst in kleinen Ketten angeordnet, dann
frei.
Unter dem Elektronenmikroskop erscheinen die Conidien nahezu sphärisch, mit unregelmäßigen Rändern
und warziger Oberfläche.
Makroskopische Eigenschaften
In Tabelle I sind die Kultureigenschaften festgehalten, die an den angezeigten Medien festgestellt
wurden, in denen der Mikroorganismus bei 28° C gezogen wurde, wobei die Beobachtungen am 3., 8.,
15., 21. und 30. Tag nach der Beimpfung vorgenomir η wurden.
Biochemische Eigenschaften Gelatine: langsame und teilweise Hydrolyse.
Nitrate: keine Reduktion zu Nitriten. Produktion von Schwefelwasserstoff: positiv.
Milch: keine Peptonisierung; keine Koagulation. f Stärke: sehr langsame und schwache Hydrolyse.
Maltose, Xylose, Mannose, Mannit, Glycerin, Glucose, Saccharose, Trehalose, Raffmose,
Fructose werden als Nährmedium angewandt.
Lactose, Adonitol, Ramnose, Sorbit, Arabinose, Esculin und Mesoinosit werden als
Nährmedium nicht verwendet.
Antibiotika: Er erzeugt Substanzen mit antiobiotischer und antitumoraler Aktivität.
Klassifizierung des Mutanten »F.I. 106«
Der Mutant F.I. 106 hat die folgenden taxonome Stellung: Im Klassifizierungssystem von Pridham
u. a. (Appl. Microbiol., Bd. 6, 1958, S. 52) gehört der Mikroorganismus zur Gruppe Retinaculum apertum,
Reihe RED. Im Klassifizierungssystem von B a 1 d a c c i (Giorn. Microbiol., Bd. 6, 1958, S. 10)
gehört der Mikroorganismus zur Reihe Albosporeus und schließlich im System von W a k s m a η (The
Actinomycetes, Bd. Π, 1961, S. 129) zur Reihe Ruber.
Ein Vergleich zwischen den Merkmalen des Mikroorganismus und denen der Arten, die zu den zitierten
systematischen Gruppen (Taxa) gehören, zeigt, daß keine derselben Eigenschaften aufweist, die denen des
zur Prüfung stehenden Mikroorganismus entsprechen.
In Tabelle II sind diese Vergleichsdaten angegeben. In der Tabelle wurden S. cinereoruber, S. cinereoruber
var. fructo-fermentans, S. caespitosus und S. antibioticus hinzugefügt, auch wenn sie nicht Teil
der oben angegebenen Gruppen sind. Ebenso sind die Unterschiede zu den Arten angeführt, von der
Art des Adriamycins die keine Substanzen erzeugen.
Der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus unterscheidet sich von der Art
S. albosporeus (Waksman, The Actinomycetes,
Bd. II, 1961, S. 171), weil diese keine löslichen Pigmente erzeugt, Nitrate reduziert und kein H2S
erzeugt; von S. cinnamomensis (Waksman, The
Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 195) und von S. fradiae (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II, 1961,
S. 211) in der Farbe des vegetativen Mycels und Luftmycels; von der Art S. ruber (Waksman,
The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 271), weil letzterer die Milch koaguliert, keine löslichen Pigmente
und kein H2S erzeugt. Er unterscheidet sich von S. rubescens (Waksman, The Actinomycetes,
Bd. II, 1961, S. 271) in der Farbe des Luftmycels und weil S. rubescens keine löslichen Pigmente bildet
" und keinen Schwefelwasserstoff erzeugt; von S. oidiosporus (Waksman, The Actinomycetes, Bd. II,
1961, S. 251), weil letzterer Nitrate nicht reduziert und Milch nicht peptonisiert. überdies erzeugt
S. oidiosporus keine löslichen Pigmente.
Daraus folgt, daß der Mutant »F.I. 106« von S. peucetius sich von allen Arten unterscheidet, die
ähnliche Substanzen erzeugen und allgemeiner sich von allen Arten unterscheidet, die den systematischen
subgenerischen Gruppen angehören, denen der Stamm selbst angehört. Insbesondere.unterscheidet sich der
Stamm »F.I. 106« vom Mutterstamm S. peucetius, der Daunomycin erzeugt (britische Patentschrift
1 003 383), da er ein vegetatives Mycel, das intensiver rot gefärbt ist, und ein Luftmycel, das manchmal eine
blaugrüntürkise Tönung annimmt, bildet und schließlich das Antibiotikum Adriamycin erzeugt, das eine
andere Struktur als Daunomycin besitzt.
3 4
Kultureigenschaften des Mutanten »F. I. 106« von S. peucetius
Medien | Wachstum | Luftmycel | Vegetatives Mycel | Lösliche Pigmente |
Agar Malzhefe extrakt (gemäß Hesseltine u.a.*) 1954) |
kleine zusammen fließende Kolo nien mit runze ligen Falten, hart, abgehoben reichlich |
sehr spärlich, glatt, blaßrosa gefärbt, keine Spiralen und Wirbel |
reichlich, gelblich, dann gelbrötlich |
intensiv, zuerst Gelbrot, dann Braunrot |
Bennet-Agar | spärlich, einzelne gelbliche kleine Kolonien |
keines | spärlich, zuerst gelblich, dann Orange |
keine |
Emerson-Agar | mäßig, kleine zusammen fließende Kolonien |
keines | mäßig, zuerst Blaß rosa, dann rötlich |
Rötlich-klar Braun |
Kartoffel-Agar (gemäß Hesseltine u. a.*) 1954) |
reichlich in glatter regelmäßiger Patina |
reichlich, zuerst Rosa, dann schwach Blau grüntürkis. Hyphen mit hakenförmigen Enden und dann kugelförmigen Enden |
reichlich, fleisch farben. Harte glatte Patina |
intensiv, zuerst gelbrötlich, dann von stark Orange bis Hellrot |
Agar Pepton + KNO3 |
reichlich, in zu sammenfließen den kleinen Kolonien |
keines | reichlich, farblos | keine |
Agar Czapeck | reichlich, in zu sammenfließen den kleinen Kolonien |
spärlich, zuerst Schmutzigweiß, dann schwach Blaugrüntürkis, schwach wattig, Hyphen mit hakenförmigen Enden oder kugelförmigen Enden |
reichlich, schwach rosa gefärbt |
keine |
Asparagin-Glucose- Agar |
spärlich, in iso lierten kleinen Kolonien |
spärlich, weißlich- rosa. Sehr ge brochenes Mycel, kurz ohne apikale Haken |
spärlich, farblos | keine |
Glycerin-Glycin- Agar |
reichlich, in glatter harter Patina |
keines | reichlich, von Gelb bis Orange |
keine |
Stärke-Agar | spärlich, in einzelnen kleinen Kolonien |
keines | spärlich, farblos dann gelblichrosa |
keine |
Gelatine | mäßig, an der Oberfläche |
keines | mäßig, farblos bis gelblich |
reichlich, Braun bis bis Tiefschwarz |
Milch | spärlich | keines | spärlich, ring förmige Ober fläche, lachsrosa gefärbt |
spärlich, Rosa |
·) Hesseltine u. a., Ann. N. Y. Acad. Sei., Bd. 60, S. 136 bis 151 (1954).
5
Vergleich zwischen dem Mutanten »F. I. 106« von S. peucetius und Arten, die Substanzen ähnlich dem
Antibiotikum Adriamycin erzeugen
Mutant »F. I. 106« |
S. purpurescens | S. bobiliae | + | S. cienereoruber | S. ceruleorubidus | |
Sporophoren | gerade oder | spiralenförmig | spiralenförmig | gerade oder | doppelt ge | |
hakenförmig | + | hakenförmig | quirlt, | |||
+ | spiralen | |||||
+ | förmig | |||||
Sporen | fast rund, | oval, stachelig, | — | + | oval, glatt. | oval, stachelig, |
warzig 1,8 | 0,8 bis 1 μ | + | 0,7 bis 1 μ | 0,6 bis 0,9 | ||
zu 3,3 μ | zu 0,4 bis | + | zu 0,9 bis | zu 0,8 bis | ||
0,5 μ | + | 2 μ | 1,2 | |||
Vegetatives | Gelbrot bis | Rot | Korallenrot | + | Gelbrotbraun | Gelbrotbraun |
Mycel | Intensivrot | — | ||||
Luftmycel | Weißrosa, | Weißrosa | Weiß | — | Aschgrau | Blautürkis |
manchmal | ||||||
schwach | Cynerubin | |||||
Blaugrün | ||||||
türkis | ||||||
Reduktion von | ||||||
Nitraten | _ | / | / | / | ||
Milch (Pep. | ||||||
Koag.) | — | — | + | / | ||
L-Xylose | + | + | + | + | ||
L-Arabinose .. | — | + | + | + | ||
L-Ramnose... | — | + | — | + | ||
Fructose | + | + | — | + | ||
Saccharose ... | + | + | — | + | ||
Lactose | — | + | + | + | ||
Raffinose .... | — | + | — | + | ||
D-Mannit | + | + | — | + | ||
D-Sorbit | — | — | — | + | ||
Erzeugte | ||||||
Antibiotika | Adriamycin | Rhodomycin | Rhodomycin | Rubidomycin |
+ = positive Reaktion. — = negative Reaktion. / = keine Daten.
(Fortsetzung)
S.cinereoruber var. fructofermentans |
S. caespitosus | S. niveoruber | S. galilaeus | S. nogalater var. nogalater |
|
Sporophoren | gerade oder hakenförmig |
quirlförmig | spiralenförmig | spiralenförmig | gerade oder hakenförmig |
Sporen | oval, glatt, 0,7 bis 1 μ zu 0,9 bis 2 μ |
oval, glatt, 0,5 bis 1,5 μ zu 0,3 bis 0,5 μ |
glatt | glatt | mehr oder weniger sphärisch, glatt |
Vegetatives Mycel |
Gelbrotbraun | cremefarbig bis Braun bis Gelb rötlich |
Karminrot | Karminrot | Orangerot |
Luftmycel | Aschgrau | Weiß Gelblichgrau |
Weißlich | Weiß bis Aschgrau |
Grau |
Fortsetzung
S. cinereoruber var. fructofermentans |
S. caespitosus | S. niveoruber | S. galilaeus |
S. nogalater var.
nogalater |
|
Reduktion von | |||||
Nitraten | / | 4. | / | / | |
Milch | |||||
(Pep. Koag.) | + | + | — | + | + |
L-Xylose | + | — | / | / | + |
L-Arabinose .. | + | — | / | / | + |
L-Ramnose... | + | — | / | / | + |
Fructose | + | -f | / | / | |
Saccharose ... | + | + | / | / | — |
Lactose | + | / | / | / | 4- |
Raffinose .... | _ | — | / | / | 4- |
D-Mannit .... | + | — | / | / | 4- |
D-Sorbit | + | + | / | / | 4- |
Erzeugte | |||||
Antibiotika... | Cynerubin | Mithomycin | Cynerubin | Cynerubin | Nogalamycin |
+ = positive Reaktion.
— = negative Reaktion.
= keine Daten.
— = negative Reaktion.
= keine Daten.
Fortsetzung
S. antibioticus | / | S.A. 1165 | / | S. A. 220 | S. DOA 1205 | / | |
(A s h e s h ο ν u. a.. | (A sh e s h ο ν u. a.. | (Brockmann, | |||||
gerade | 4- | Antib. and Chemother., | / | Antib. and Chemother., | Chem. Ber., | + | |
/ | Bd. 4, 1954, S. 380) | / | Bd. 4, 1954, S. 380) | Bd. 92, 1959, S. 1880) | / | ||
Sporophoren | glatt, sphärisch | / | nicht beschrieben | / | nicht beschrieben | in Spiralenform her | / |
Gelbcremefarbig | / | / | gestellt | / | |||
Sporen | Weiß bis Maus | / | nicht beschrieben | / | nicht beschrieben | nicht beschrieben | / |
Vegetatives Mycel | grau | / | nicht beschrieben | / | nicht beschrieben | Ziegelrot, Weinrot | / |
Luftmycel | / | nicht beschrieben | / | nicht beschrieben | Rotgrau | / | |
/ | / | / | |||||
Reduktion von | / | ,. | / | ||||
Nitraten | / | - / | / | / | |||
Milch | Cynerubin | Aklavin | Pyrromycin | ||||
(Pep. Koag.) | / | ||||||
L-Xylose | / | ||||||
L-Arabinose .... | / | ||||||
L-Ramnose | / | ||||||
Fructose | / | ||||||
Saccharose | / | ||||||
Lactose | / | ||||||
Raffinose | / | ||||||
D-Mannit | / | ||||||
D-Sorbit | / | ||||||
Erzeugte Antibiotika |
Rutilantin | ||||||
+ = positive Reaktion.
— = negative Reaktion.
= keine Daten.
— = negative Reaktion.
= keine Daten.
Der Mutant »F.I. 106« kann durch Lyophilisierung unter Verwendung von Milch oder Milchserum als
Suspendiermittel oder durch Sammeln der Sporen und Aufbewahren derselben in einem sterilen Substrat
gelagert werden. Außerdem kann er auch durch aufeinanderfolgende Kultivierungen auf einem festen
Medium, das Glucose oder einen anderen geeigneten Zucker und komplexe stickstoffhaltige Substanzen
(Hefeextrakt, Pepton, hydrolisiertes Kasein) gelagert werden. Das Medium kann außerdem einige Salze
109552/436
ίο
enthalten, wobei Magnesiumsulfat und Kaliumphosphat besonders wichtig sind.
Die Herstellung des Antibiotikums Adriamycin erfolgt auf übliche Art und besteht darin, daß der
Mutant »F. I. 106« in einem flüssigen Kulturmedium, das vorher sterilisiert wurde, unter aeroben Bedingungen
bei einer Temperatur zwischen 25 und 37° C (vorzugsweise bei 28° C) während eines Zeitraumes
von 3 bis 7 Tagen, vorzugsweise 5 Tagen, bei einem
zweimal extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum zur Trockene
eingedampft. In einer Probe des Rückstandes wird der Gehalt an Adriamycin mittels des oben angegebenen
Verfahrens bestimmt.
Um Adriamycin zu isolieren, kann das Antibiotikum mit geeigneten Lösungsmitteln entweder aus der
Kulturbrühe ohne Filtrieren der Mycelmasse oder aus dem Mycel und der Kulturflüssigkeit, die vorher
pH-Wert von anfangs 6,5 bis 7,0 und am Ende des io durch Filtrieren getrennt wurden, extrahiert werden.
Fermentationsverfahrens von 7,5 bis 8,0 kultiviert wird. Das Kulturmedium besteht aus einer Kohlenstoff-
und einer Stickstoffquelle und Mineralsalzen. Die .Kohlenstoffquelle kann aus Stärke, Dextrin,
Glucose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreidequellflüssigkeit, Trebern, Sojabohnenöl oder Sojabohnenmehl
bestehen. Die Stickstoffquelle kann außer den obenerwähnten stickstoffhaltigen komplexen Substanzen
aus trockener Hefe, Fleischpepton und Kasein
Wenn die Extraktion getrennt durchgeführt wird, wird folgende Verfahrensweise vorgezogen. Am Ende
der Fermentation wird ein Kieselsäureadsorptionsmittel der Kulturbrühe zugesetzt; die Mischung wird
filtriert, und sowohl der Filterkuchen als auch das Filtrat werden getrennt behandelt. Der Hauptanteil
an Antibiotikum wird im Filterkuchen gefunden, der aus dem Mycel in Mischung mit den Kieselsäureadsorptionsmaterialien
besteht. Dieser Kuchen wird
bestehen. Gute Resultate werden auch bei Verwendung 20 breiig gemacht und in einem Alkohol, wie Methanol,
Äthanol, Butanol; einem Keton, wie Aceton, Methyläthylketon; einem halogenierten Kohlenwasserstoff,
wie Chloroform, Methylenchlorid oder in wässerigen Lösungen von organischen oder anorganischen Säulichen
Mineralsalze können je nach dem verwendeten 25 ren, wie Essigsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, gerührt.
von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitraten, Ammoniumsulfaten und Diammoniumphosphaten, erhalten.
Die für die Herstellung des Antibiotikums nütz-
Die für die Herstellung des Antibiotikums nütz-
Vorteilhafterweise können Mischungen der genannten organischen Lösungsmittel, wie Alkohole und mit
Wasser mischbare Ketone, und wässerige Lösungen von anorganischen Säuren verwendet werden.
Im allgemeinen wird eine Mischung von Aceton und O,ln-Schwefelsäure in einem Verhältnis von
7:1 bis 3:1, vorzugsweise 4:1, verwendet.
Aus der vorher auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 alkalisch gemachten filtrierten Brühe kann das Anti
Medium variieren. In einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände,
enthält, hat sich der Zusatz von Kalziumcarbonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten
als nützlich erwiesen. In Medien, die Glucose, Hefe oder Ammoniumsalze enthalten, sind viel höhere
Zusätze an Mineralsalzen, wie Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Mangan- und Kupfersalzen, erforderlich.
Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder
in Laboratoriums- oder Industriefermentationsappa- 35 biotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren
raturen verschiedener Kapazität durchgeführt werden. Alkohol, Keton oder halogenierten niedrigen alipha-
Die Menge des in den Brühen vorhandenen Adri- tischen Kohlenwasserstoff, wie Amylalkohol, Butylamycins
wird durch folgende Methode berechnet: alkohol, Methylisobutylketon, Methylenchlorid,
Die Kulturlösung wird mit Hilfe von 2%igem Kiesel- Chloroform oder Mischungen davon, extrahiert
gur filtriert. Die filtrierte Brühe wird mit einer 1 n-Na- 40 werden.
triumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,6 Ein anderes Verfahren zum Extrahieren der fil-
eingestellt und dann zweimal mit einer Mischung von trierten Brühe besteht darin, daß die Brühe selbst
Chloroform und Methanol (9:1) extrahiert. Der durch eine chromatographische Säule geleitet wird,
Extrakt wird mit Wasser gewaschen und dann im die kationisches carboxylgruppenhaltiges Austausch-Vakuum
zur Trockene eingedampft. Der Rückstand 45 harz (»Amberlite IRC 50«) in saurer Form enthält,
wird mit Methylalkohol aufgenommen und danach aus dem das Produkt mit einer wässerigen methaüber
Whatman-MM-Nr. 3-Papier, das mit einem nolischen Lösung von Natriumchlorid eluiert werden
m/15-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,4 kann.
gepuffert wurde, chromatographiert, wobei als Eluier- Die organischen Extrakte der Brühe und des Mycels
mittel eine Mischung aus Propanol, Äthylacetat und 50 werden gesammelt, neutralisiert, es wird Wasser zuWasser
(7:1:2) verwendet wird. Der rotgefärbte gesetzt und die erhaltene Lösung dann unter vermin-Teil,
der dem Rf-Wert von Adriamycin entspricht, dertem Druck eingeengt. Das wässerige Konzentrat
wird mit einer Mischung von Methanol und Wasser wird mit ln-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 ein-(9:1)
eluiert, und die Menge des in der filtrierten gestellt und danach mit Chloroform extrahiert. Der
Brühe vorhandenen Adriamycins wird durch spektro- 55 verschiedene Verunreinigungen enthaltende Extrakt
photometrische Prüfung einer Probe des Eluats bei wird entfernt, während die wässerige Schicht auf einen
der Wellenlänge von 495 ηΐμ berechnet und mit einer
Probe von Adriamycin, dessen Titer bekannt ist,
verglichen.
Probe von Adriamycin, dessen Titer bekannt ist,
verglichen.
Die Menge des im Mycel vorhandenen Adriamyeins wird auf'folgende Weise berechnet: Das Mycel
wird mit einer Mischung von Aceton und 0,1 n-Schwefelsäure (4:1) extrahiert; der Extrakt wird neutralisiert
und unter vermindertem Druck bis auf Vs des
ursprünglichen Volumens konzentriert, das Konzen- 65 nente Adriamycin enthält, in Form der freien Base
trat wird mit 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen erhalten. Um das Adriamycin von verschiedenen
pH-Wert von 8,6 eingestellt und dann mit einer wasser- und fettlöslichen Pigmenten zu reinigen, kann
Mischung von Chloroform und Methanol (9:1) Gegenstromverteilung oder Säulenchromatographie
pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und mit einer Mischung von Chloroform und Methanol (9:1)
extrahiert wird.
Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter
vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingedampft. Aus dem Konzentrat wird bei Zusatz von
Äthyläther ein rohes Produkt, das als Hauptkompo-
angewendet werden. Im ersten Falle kann die Mischung Chloroform—Methanol—m/15- Phosphatpuffer
bei einem pH-Wert von 5,4 (2:2:1) verwendet werden; bessere Resultate werden erhalten, wenn
über einer Säule von Zellulose, die mit Phosphaten auf einen pH-Wert von 5,4 gepuffert ist, Chromatographien
und als Eluiermittel die Mischung Propanol—Äthylacetat—Wasser
(7:1:2) verwendet wird.
Die Adriamycin enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und nach Zusetzen von Wasser eingedampft.
Das wässerige Konzentrat wird mit ln-Natriumcarbonat
auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und danach mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung
wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingedampft. Durch
Zusetzen von salzsäurehaltigem, wasserfreiem Methanol wird Adriamycinhydrochlorid in Form von dünnen,
orangerotgefärbten Nadeln erhalten, das beim Umkristallisieren aus wasserfreiem Äthylalkohol
orangerote Nadeln ergibt, Fp. 204 bis 2050C (Zersetzung).
Es ist optisch.aktiv, [,{\T= +248 ± 2°
(c = 0,1 in Methanol). Die Elementaranalyse einer gereinigten Adriamycinhydrochloridprobe ergibt
die folgenden Werte: C = 54,36%, H = 5,43%, N = 2,37%, Cl = 6,42%. Die empirische Formel
entspricht C27H29NO11 · HCl, Molekulargewicht
= 579,98.
Adriamycin besitzt folgende Strukturformel
CH2OH
Das Adriamycinhydrochlorid ist in Wasser, Methanol und wässerigen Alkoholen löslich, aber unlöslich
in Aceton, Benzol, Chloroform, Äthyläther und Petroläther. Die alkoholischen Lösungen des Antibiotikums
ergeben mit Metallsalzen charakteristische Färbungen : scharlachrot mit Magnesiumsalzen, scharlachrot
mit Calciumsalzen, dunkelrot mit Bleisalzen.
Bei einem alkalischen pH-Wert wird ein Umschlagen zur violetten Farbe und Ausfällung der
pigmentierten Substanzen beobachtet. Die wässerigen Lösungen von Adriamycinhydrochlorid bei saurem
pH-Wert sind gelborange gefärbt, bei einem neutralen pH-Wert Rotorange und bei einem pH-Wert von
höher als 9 Violettblau. Das UV-Absorptionsspektrum und das Spektrum in den sichtbaren Bereichen
in Methanol ist durch die folgenden Maxima charakterisiert:
bei 233 ήΐμ (Ε}* = 673)
bei 252 πΐμ (Ε}* = 450)
bei 288 πΐμ (Ε} S. = 159)
bei 479 πΐμ (EJS. = 219)
bei 496 πΐμ (Ε}* = 217)
bei 529 πΐμ (EJ* = 118)
bei 252 πΐμ (Ε}* = 450)
bei 288 πΐμ (Ε} S. = 159)
bei 479 πΐμ (EJS. = 219)
bei 496 πΐμ (Ε}* = 217)
bei 529 πΐμ (EJ* = 118)
Im IR-Absorptionsspektrum werden Banden der folgenden Wellenlängen festgestellt (in μ): 3,00, 3,44,
5,80, 6,17, 6,31, 6,55, 7,05, 7,78, 8,11, 8,24, 9,00, 9,35, 10,10, 10,98, 11,50, 12,68, 13,12, 14,60.
NH, OH H
Das Antibiotikum ist eine Base, die mit anorganischen und organischen Säuren Salze bilden kann.
Der beobachtete Farbwechsel von Rot zu Blauviolett bei einem pH-Wert ~ 9 tritt zufolge Salzbildung der
phenolischen Hydroxylgruppen auf. Durch 1 stündiges Erhitzen auf 10O0C in 0,5n-Mineralsäuren ergibt
Adriamycin ein rotgefärbtes Aglycon, das in Wasser unlöslich ist (Adriamycinon), und eine wasserlösliche,
basische, reduzierend wirkende Fraktion (Daunosamin).
Die wasserlösliche Fraktion besteht aus einem bekannten reduzierenden Aminozucker Daunosamin
der folgenden Strukturformel
—— CHOH
CH2
H-C-NH2 H—C—OH
C-H
CH3
(III)
60
65 C-CH,
Daunosaminhydrochlorid schmilzt bei 168° C (Zersetzung); [o]D = —54,5° (in Wasser); N-Benzoylderivat
schmilzt bei 154 bis 156° C. Durch diese Spaltstücke
ist die Struktur des Adriamycins weitgehend gesichert.
Wie das bekannte Daunomycin (J. Am. Chem. Soc., Bd. 86, 1964, S. 5334 bis 5336) kann Adriamycin
chromatographisch gereinigt werden. Dabei zeigt es jedoch ein unterschiedliches Verhalten.
Es wurde Whatman-Papier Nr. 1, gepuffert mit m/15-Phosphatpuffer (NaH2PO4 und K2HPO4;
pH-Wert 5,4), absteigende 16stündige Entwicklung bei Raumtemperatur.
Lösungsmittel A:
Butanol, gesättigt
(pH-Wert 5,4);
Butanol, gesättigt
(pH-Wert 5,4);
Lösungsmittel B:
Propanol—Äthylacetat—Wasser (7:1:2).
Dünnschichtchromatographie
Kieselsäuregel-G-Schicht (Merck), gepuffert mit
1% Oxalsäure in Wasser. Das Chromatogramm wurde bei Raumtemperatur 10 cm weit laufen gelassen.
mit m/l 5 - Phosphatpuffer
1 77Q204
System C: Methylenchlorid—Methanol
(100:15);
System D: n-Butanol—Essigsäure—Wasser
System D: n-Butanol—Essigsäure—Wasser
(4:1:5) obere Phase;
System E: Benzol—Äthylacetat—Petroläther,
Kp. 80 bis 1200C (80:50:20);
Kp. 80 bis 1200C (80:50:20);
System F: Benzol—Äthylformiat—Ameisensäure
(50:50:1).
Verbindung
Papierchromatographie | B | Dünnschichtchromatographie | C | D | E |
0,25 | System | 0,17 | 0,33 | 0,00 | |
A | 0,50 | 0,35 | 0,40 | 0,00 | |
0,10 | 0,85 | 0,95 | 0,85 | 0,15 | |
0,20 | |||||
0,75 | |||||
Adriamycin Rf
Daunomycinhydrochlorid Rf
Daunomycinon Rf
Daunomycinon Rf
Die Salze von Adriamycin werden durch übliches Umsetzen der Base mit pharmazeutisch verwendbaren
organischen und anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure,
Valeriansäure, Palmitinsäure, ölsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder
Pantothensäure, erhalten. Neutrale Salze werden durch Umsetzen der entsprechenden Säure mit der
freien Base Adriamycin, die durch Extraktion einer wässerigen Lösung des Hydrochlorids bei einem
pH-Wert von 8,6 mit organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie Butanol und Chloroform,
erhalten wird, erzielt. Durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels wird das Antibiotikum
Adriamycin in Form der freien Base erhalten. Die Salze können auch durch doppelte Umsetzung der
Salze erhalten werden: beispielsweise wird aus Adriamycinsulfat mit Calciumpantothenat Adriamycinpantothenat
erhajten.
Obwohl das Antibiotikum Adriamycin eine bemerkenswerte bakteriostatische Aktivität gegenüber
verschiedenen Mikroorganismen (s. Tabelle III) besitzt, hat es sich insbesondere als antitumorales
Mittel wirksam erwiesen.
40
Antibiotische Aktivität von Adriamycinhydrochlorid 0,00
0,00
0,40
0,00
0,40
Das Antibiotikum zeigt einen deutlichen Hemmungseffekt
auf das Tumorwachstum in ascitischer Form, in der ein unmittelbarer Kontakt des Antibiotikums
mit den neoplastischen Zellen erreicht wird. Ein guter Hemmungseffekt wird auch bei festen
Tumoren beobachtet, wo die Aktivität entsprechend der Verabreichungsweise und der Dosis verschieden
ist. Die antitumorale Aktivität von Adriamycin ergibt bessere Resultate bezüglich Wirksamkeit und Dauer
als es bei Daunomycin der Fall ist. Das Antibiotikum Adriamycin und seine pharmakologisch verträglichen
Salze sowie deren Gemische, können als Heilmittel verwendet werden. Diese enthalten die Verbindungen
in Mischung mit üblichen inerten pharmazeutischen Trägern, die für parenteral oder lokale Verabreichung
geeignet sind. Zur parenteralen Verabreichung werden vorzugsweise Iyophylisierte Aufbereitungen verwendet,
die zum Zeitpunkt der Verwendung gelöst werden sollen.
Die Untersuchung der antitumoralen Wirkung des Antibiotikums unter Verwendung des Stamms
Adriamycin, das Streptomyces »F. I. 106« hergestellt wurde, wurde an einigen Mäuse- und Rattentumoren
sowohl in fester als auch ascitischer Form vorgenom
men.
1. Ascitische Tumore
Stämme | Medium | DIM ag, ml |
Staph. aureus cp. 209 P Bacillus subtilis Streptococcus faecalis Salmonella abortivo equina Escherichia coli B ... Shigella fiexneri Candida albicans.... |
Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Fleischbrühe Sabouraud |
12,5 6,25 50 50 3 >50 >50 |
Aktivitätsversuche wurden an Mäusen vorgenommen, die ascitische Ehrlich-Karzinome aufwiesen und
mit Lösungen des Antibiotikums in verschiedenen Konzentrationen fünf aufeinanderfolgende Tage,
beginnend mit dem Tag, der der Tumorimplantation folgte, intraperitoneal behandelt wurden.
Die Tabelle IV, in der die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt sind, zeigt, daß das zu prüfende
Antibiotikum, verabreicht in gleichen Dosen von 1,75 und 2,50 mg/kg/Tag, einen bemerkenswerten
Hemmungseffekt auf das ascitische Tumorwachstum ausübt und die durchschnittliche Uberlebensrate der
behandelten Tiere erheblich erhöht hat.
Tabelle IV Ascitische Ehrlich-Karzinome
Gruppen von 10 Tieren
Dosis
mg/kg/Tag
Körpergewichtsänderung in Gramm
(Tage nach der Implantation)
(Tage nach der Implantation)
6 12
Mittlere
Uberlebenszeit (Tage)
Uberlebenszeit (Tage)
Kontrollen .
Adriamycin
Adriamycin
Adriamycin
Adriamycin
1,75
2,50
2,50
+7,5
-0,5
-1,8
-0,5
-1,8
+ 13,9
+ 3,8
+0,9
+ 3,8
+0,9
14
33,8
34,6
Dieses Ergebnis wurde durch einen nachfolgenden Versuch bestätigt, in welchem das Antibiotikum in Dosen
von 1,25 und 2,50 mg/kgTag (Tabelle V) verabreicht wurde.
Tabelle V Ascitische Ehrlich-Karzinome
Gruppen von 10 Tieren
Dosis
mg/kg/Tag
Körpergewichtsänderung in Gramm
(Tage nach der Implantation)
(Tage nach der Implantation)
6 12
Mittlere
Überlebenszeit (Tage)
Überlebenszeit (Tage)
Kontrollen .
Adriamycin
Adriamycin
1,25 2,50
+ 7,5
-0,6
-0,9
-0,6
-0,9
+ 13,2
+ 4.6
-4,3
17,8
31,8
51,2
31,8
51,2
Ein Vergleich der erhaltenen Ergebnisse unter den gleichen experimentellen Bedingungen an Mäusen,
die ascitische Ehrlich-Karzinome aufwiesen, mit den Antibiotika Daunomycin und Adriamycin im Hinblick
auf Kontrollmäuse erlaubt die Feststellung, daß letzteres ein aktiveres Produkt ist, wie aus Tabelle VI
hervorgeht, aus der ersichtlich ist, daß die Verhältniswerte, die das Ansteigen der Uberlebenszeit bei den
behandelten Mäusen im Vergleich mit den Kontrollmäusen anzeigen, bei gleichen Dosen mit Adriamycin
höher sind.
Mittlere Uberlebenszeit von Mäusen mit ascitischen Ehrlich-Karzinomen (als Verhältniszahl zwischen der
Uberlebenszeit der behandelten Tiere (Mäuse) und der Kontrolltiere; jeder Wert zeigt das Mittel der erhaltenen
Ergebnisse bei Gruppen von 10 Tieren).
Dosis mg, kg, Tag |
Daunomycin | Adriamycin |
2,50 | 1,8 | 2,8 |
Der antimycotische Effekt des zu prüfenden Antibiotikums wurde bei Versuchen aufgedeckt, die an
Mäusen durchgeführt wurden, welche ascitische Tumore im logarithmischen Wachstumsstadium (5. Tag)
aufwiesen. Diese Tiere wurden intraperitoneal behandelt, wobei ihnen Adriamycin in einer Menge von
2 mg/kg lediglich einmal verabreicht wurde. Die Prüfung der Flecken des neoplastischen Exudats, die vorher
und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung (2, 4, 8, 24, 32 und 48 Stunden) durchgeführt wurde,
konnte aufzeigen, daß das Antibiotikum eine sehr schnelle und vollständige Beendigung der mehrfachen
Wirksamkeit des Tumors bewirkt, die bis zur 32. Stunde dauert.
48 Stunden nach der Behandlung wurden zahlreiche Zellen im Mythose festgestellt, aber ihre Morphologie
war konstant verändert.
2. Feste Tumore
Die Versuche bezüglich Wirksamkeit gegenüber festen Tumoren wurden mit Sarcom 180 bei Mäusen
und mit Oberling-Guerin-Guerin-Myelomen bei Ratten durchgeführt.
a) Sarcom 180
Mäuse, denen ein Fragment eines neoplastischen Gewebes eingepflanzt worden war, wurden 8 Tage
subkutan behandelt, beginnend mit dem Tag, der der Tumorimplantation folgte. Das Antibiotikum wurde
als Lösung in verschiedenen Konzentrationen entsprechend den folgenden Dosen in mg/kg/Tag verabreicht:
7, 5, 3,5, 2,5 und 1,75.
Am 11. Tag des Versuches wurden alle Tiere getötet und deren Tumore entfernt und gewogen.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen VII und VIII angegeben:
Gruppe und Dosis
(mg/kg/Tag)
(mg/kg/Tag)
Kontrollen
Adriamycin
7
3,50
1,75
Körpergewichtsänderung brutto netto
Tumorgewicht
Hemmung
Sterblichkeit
+4,78
-5,98 -2,31 + 3,09
+ 0,86
-6,22 -3,01 + 1,10
Tabelle VIII Sarcom 3,922
0,239
0,696
1,988
0,696
1,988
93,9
82,3
49,3
49,3
0/10
6/10
0/10
0/10
0/10
0/10
Gruppe und Dosis
(mg/kg/Tag)
Kontrollen
Adriamycin
5
2,50
Daunomycin
5
2,50
Körpergewichtsänderung brutto netto
Tumorgewicht
g
g
Hemmung
%
+ 5,65
-4,37 -1,60
+0,85 + 1,52
+ 3,19
+4,61 -2,26
-0,18 -0,23 2,461
0,239
0,656
0,656
1,029
1,745
1,745
90,3
73,4
58,2
29,1
29,1
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
109552/436
Aus den zwei Tabellen geht hervor, daß das Antibiotikum eine starke Hemmung des Tumorwachstums
bei allen verwendeten Dosierungen verursacht hat. Eine merkliche Sterblichkeit der behandelten Tiere
wurde nur mit höheren Dosierungen (7 mg/kg/Tag) erzielt.
Unter den gleichen experimentellen Bedingungen ergab sich klar, daß Adriamycin im Vergleich zu
Daunomycin in bezug auf diese Tumorart überlegen wirksam ist. Dieses Ergebnis ist um so anschaulicher,
wenn die Hemmungsdosen 50 (HD50) in Betracht
gezogen werden: Daunomycin etwa 3,3 mg/kg, Adriamycin etwa 1,5 mg/kg.
Versuche bezüglich der Toxizität, die an gesunden Mäusen 8 Tage unter subkutaner Verabreichung
von Adriamycin in Dosen von 10 bis 1,25 mg/kg durchgeführt wurden, zeigten die folgenden Ergebnisse:
Tabelle IX Toxizität von Adriamycin bei Mäusen
Dosis | % Sterblichkeit | am |
(mg/kg/Tag) | 10. Tag | 15. Tag |
10 | 100 | 100 |
8 33 | 70 | 100 |
6,67 | 40 | 80 |
5 | 0 | 0 |
2,50 | 0 | 0 |
1,25 | 0 | o ■ |
Aus obigen Daten ist ersichtlich, mittels einer graphischen Methode, daß die tödliche Dosis 10 (LD10)
bei 6,4 mg/kg liegt. Aus dem Diagramm kann man ersehen, daß die Hemmungsdosis 90(HD90) von
Adriamycin gleich 5 mg/kg ist. Mit diesen Daten ist es möglich, gemäß Skipper (Cancer Chemotherapy
Report, Bd. 17,1962, S. 1) den therapeutischen Index von Adriamycin zu berechnen:
IO
T. I. =
LD
12. -
6,4
HD,
= 1,28.
'90
Es sei darauf hingewiesen, daß der therapeutische Index von Daunomycin unter den gleichen experimentellen
Bedingungen 0,67 beträgt. Außerdem sei noch darauf hingewiesen, daß es gemäß der obenerwähnten
Literaturstelle von S ki ρ ρ e r scheint, daß unter den gleichen experimentellen Bedingungen der therapeutische
Index von anderen antitumoralen Antibiotika, die schon in Verwendung sind (Actinomycin,
Mitomycin, Actinobolin, Actidion), niedriger als 1 ist.
b) Oberling-Guerin-Guerin-Myelome
Wistar-Ratten, denen ein Fragment eines Tumorgewebes eingepflanzt worden war, wurden intravenös
8 Tage, beginnend mit dem Tag, der der Tumorimplantation folgte, behandelt. Am 12. Tag des Versuches
wurden die überlebenden Tiere getötet und die Tumore entfernt und gewogen.
Tabelle X Oberling-Guerin-Guerin-Myelome
Gruppe und Dosis
(mg/kg/Tag)
(mg/kg/Tag)
Körpergewichtsänderung (g)
brutto
netto Sterblichkeit
Tumorgevvicht
Hemmung %
Kontrollen .
Adriamycin
Adriamycin
0,625
1,25
2,50
+ 15,7
+ 9,2
+25,2 - 1,3
+ 3,3
- 1,0
+ 14,6
- 5,6
0/10
3/10
0/10
1/10
0/10
1/10
12,447
10,253
10,649
4,295
17,7 14,5 65,5
Tabelle X zeigt, daß das Antibiotikum auch gegenüber dieser Tumorart wirksam ist. Unter diesen
experimentellen Bedingungen beträgt die HD50 des
Adriamycins etwa 2 mg/kg.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.
Zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben, die jeweils 60 ml
des folgenden Kulturmediums für die vegetative Phase enthielten, wurden vorbereitet: Pepton 0,6%, trockene
Hefe 0,3%, hydratisiertes Calciumnitrat 0,05%, Leitungswasser. Nach der Sterilisierung betrug der
pH-Wert 7,2. Die Sterilisierung erfolgte durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen im Autoklav auf
1200C.
Jeder Kolben wurde mit einer Menge Mycel des Mutanten »F. I. 106« von Streptomyces peucetius
entsprechend 1Z5 einer Suspension des Mycels in
sterilem Wasser angeimpft; dieses Mycel stammt von einer 10 Tage alten Kultur, die in einer großen Proberöhre
auf dem folgenden Medium gezogen wurde: Saccharose 2%, trockene Hefe 0,1%, Bikaliumphosphat
0,2%, Natriumnitrat 0,2%, Magnesiumsulfat 0,2%, Agar 2%, Leitungswasser. Die Kolben wurden
48 Stunden bei 28° C auf einem Drehschüttler mit einem Hub von 30 mm bei 220 Umdrehungen pro
Minute bebrütet.
2 ml eines so gezogenen vegetativen Mediums wurden dazu verwendet, um 300-ml-Erlenmeyerkolben
mit 60 ml des folgenden Mediums für die Produktionsphase anzuimpfen: Glucose 6%, trockene
Hefe 2,5%, Natriumchlorid 0,2%, Bikaliumphosphat 0,1%, Calciumcarbonat 0,2%, Magnesiumsulfat
0,01%, Ferrosulfat 0,001%, Zinksulfat 0,001%, Kupfersulfat 0,001%, Leitungswasser. Der sich ergebende
pH-Wert beträgt 7. Das Medium wurde bei 1200C
20 Minuten sterilisiert; die Glucose wurde 20 Minuten bei 1100C separat sterilisiert. Sie wurde bei 28° C
unter den gleichen Rührbedingungen, wie für die
vegetativen Medien beschrieben, bebrütet. Die Maximalkonzentration
des Antibiotikums wurde am 6. Tag der Fermentation erreicht. Die Menge nach einer
solchen Zeit hergestellten Adriamycins entspricht einer Konzentration von 15 μg/ml.
Der Versuch wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt mit dem Unterschied, daß die Impfkultur
auf dem folgenden festen Medium gezogen wurde: 200 g geschälte Kartoffeln wurden 20 Minuten
in 500 ml Wasser gekocht; das Volumen wurde auf seinen ursprünglichen Wert gebracht und durch Gase
filtriert. 2% Glucose, 0,1% Difco-Hefeextrakt und 2% Agar wurden zugesetzt. Das Volumen wurde auf
1000 ml gebracht; es wurde 20 Minuten bei 1200C sterilisiert; pH-Wert 6,8 bis 7,0. Die maximale Konzentration
des Adriamycins von 12 μg/ml wurde in
der 140. Stunde erreicht.
Der Versuch wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt mit dem Unterschied, daß die vegetativen
und produktiven Medien die folgenden Zusammensetzungen hatten:
Vegetatives Medium: Stärke 3%, Calciumcarbonat 0,4%, Treber 0,3%, Ammoniumsulfat 0,1%, Kasein
0,5%, Bikaliumphosphat 0,01%, in Leitungswasser. Der pH-Wert nach der Sterilisation im Autoklav bei
1200C während 20 Minuten betrug 7.
Produktives Medium: Stärke 5%, Calciumcarbonat 0,8%, Getreidequellflüssigkeit 0,6%, Kasein 0,5%,
Ammoniumsulfat 0,1%, Bikaliumphosphat 0,01%. Der pH-Wert betrug nach der Sterilisation 7. Die
Sterilisation wurde so, wie für die vegetative Phase beschrieben, durchgeführt. Die Maximalproduktion
wurde am 7. Tag mit 6,5 μg/ml erreicht.
500 ml des flüssigen Mediums der vegetativen Phase, wie im Beispiel 1 beschrieben, die in einem
2000-ml-Pyrex-Glaskolben enthalten waren, wurden
mit einer Kultur des Mutanten »F. I. 106« von Strept. peucetius auf einem festen Medium, wie im Beispiel 2
beschrieben, angeimpft. Es wurde 48 Stunden bei 28° C auf einem Drehschüttler mit einem Hub von
3,5 mm bei 120 Umdrehungen pro Minute bebrütet;
100 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurden danach in 3000 ml des gleichen flüssigen Mediums angeimpft,
das in einem 51 neutralen Glasfermentiergefäß, das mit einem Propellerrührer, einem Einlaßrohr zum
Einblasen von Luft, das unter dem Propellerrührer endigt, einer Wellenbrechereinrichtung, einem Rohr
für das Animpfen, einem Luftauslaßrohr, einer Temperaturprüfeinrichtung und einer Einrichtung zum
intermittierenden oder kontinuierlichen Zusetzen unter sterilen Bedingungen, versehen war, enthalten
war. Das Wachsen erfolgte bei 28° C mit einer Durchlüftungsgeschwindigkeit
von 3 1 pro Minute und unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 400 Umdrehungen
pro Minute (U. p. M.).
300 ml der so erzeugten Kulturbrühe dienten nach 24 Stunden zum Animpfen von 6 1-des im Beispiel 1
beschriebenen produktiven Mediums, das in einem
101 neutralen Glasfermentiergerät, das die oben beschriebenen Merkmale aufwies, enthalten war.
Während der Fermentation, die bei einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen pro Minute
und mit einer Durchlüftungsgeschwmdigkeit von 5 1 pro Minute durchgeführt wurde, wurde das Schäumen
durch Zusetzen von kleinen Mengen Silikon-Antischaummittel geprüft. Die in 150 Stunden der
Fermentation erzielte Höchstproduktion entspricht einer Konzentration von 6 μΒ/ΐηΙ Adriamycin.
Mit einer Kultur, die wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurden 500 ml eines Mediums der
nachstehenden Zusammensetzung in einem 2000 ml Kolben angeimpft: Pepton 0,6%, granulierte trockene
Hefe 0,5%, Calciumnitrat in Wasser 0,05%. Das Medium wurde auf einem Drehschüttler 48 Stunden
bei 28° C gerührt. Mittels der so erhaltenen Kultur wurde ein 80 1 Fermentiergerät mit 50 1 des oben angegebenen
Mediums angeimpft. Dieses Medium wurde bei 230 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit
einem Luftstrom von 0,71/1 Medium pro Minute bei einer Temperatur von 27° C belüftet. Nach 4 bis
5 Stunden wurde die Kulturbrühe dazu verwendet, um 500 ml des Kulturmediums in einem etwa 8001
Fermentiergefäß zu besetzen.
Das Fermentationsmedium hatte die nachfolgende Zusammensetzung: Glucose 7%, Kichererbsenmehl
6,65%, Calciumcarbonat 0,2%, Natriumchlorid 0,2%, Bikaliumphosphat 0,1%, Magnesiumsulfatheptahydrat
0,02%, Ferrosulfatheptahydrat 0,00068%, Mangansulfatheptahydrat 0,001%, Kupfersulfat 0,002%
in Leitungswasser.
Das Medium wurde 30 Minuten bei 1200C sterilisiert,
auf 27° C abgekühlt und nach dem Animpfen bei 250 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit
einem Luftstrom von 0,41/1 Medium pro Minute belüftet. Nach 145 Stunden enthielt die Kulturbrühe
6,5 μg/ml Adriamycin.
60 1 Kulturflüssigkeit, die gemäß Beispiel 4 aus der Fermentation erhalten wurde, wurden vom Mycel
mittels Kieselgur abfiltriert, wobei ein Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert
wurden. Der erhaltene Kuchen wurde in Aceton, das mit 0,1 n-wässeriger Schwefelsäure (4:1) verdünnt
war, suspendiert und 2 Stunden gerührt. Die Flüssigkeit wurde filtriert und der Kuchen weitere
zweimal gerührt. Die erhaltenen Extrakte wurden vereinigt, neutralisiert und das Aceton im Vakuum
abgedampft. Das Konzentrat, das etwa 0,25 g Adriamycin enthielt, wurde mit 1 η-Salzsäure bis zu einem
pH-Wert von 3 angesäuert und danach mit Chloroform extrahiert, wobei ein Teil der Verunreinigungen
entfernt wurde. Die wässerige Phase wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6
eingestellt und dann mit einer Mischung Chloroform— Methanol (9:1) extrahiert; der Vorgang wurde so lange
wiederholt, bis die wässerige Phase farblos war. Die Methanol-Chloroform-Extrakte wurden mit Wasser
bei einem pH-Wert von 8,6 gewaschen, danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und
unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert, worauf Adriamycin mittels Äthyläther
in Form der freien Base ausgefällt wurde. Es wurden 1,50 g des rohen Produktes erhalten, die etwa 0,2 g
Adriamycin enthielten.
Die filtrierte Brühe wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und danach
mit einer Mischung Chloroform—Methanol (9:1)
extrahiert. Der Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die Methanol—Chloroform-Extrakte wurden mit
Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 gewaschen und dann mit 0,01 η-Salzsäure wiederextrahiert, bis die
wässerige Phase eine rote Farbe annahm. Die Chloroformphase wurde entfernt. Die wässerige Phase wurde
filtriert und mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt. Danach wurde sie mit
der Mischung Chloroform—Methanol (9:1) extrahiert.
Der Extrakt, der zu diesem Zeitpunkt neben verschiedenen Verunreinigungen 0,15 g Adriamycin
enthielt, wurde mit Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert. Durch Zusetzen
von 10 Volumteilen Äthyläther wurde ein Niederschlag von 1 g des rohen Produktes, das 0,12 g Adriamycin
enthielt, erhalten.
Insgesamt wurden 0,320 g Adriamycin in Form der rohen Base erhalten.
0,5 g Rohprodukt, enthaltend etwa 15% Adriamycin, wurden in 10 ml eines m/l 5-Phosphatpuffers
(pH-Wert von 5,4) gelöst. Die Lösung wurde an 10 g Zellulosepulver (Whatman-CF-11) adsorbiert, die Mischung
über Nacht im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet, dann in eine Glassäule
für Chromatographie (100 cm hoch und 4 cm Durchmesser), enthaltend 225 g Zellulosepulver (Whatman-CF-Il),
das vorher mit m/l5-Phosphatpuffer (pH-Wert von 5,4) gepuffert worden war, eingebracht und
im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet. Sie wurde mit einer Mischung Propanol—
Äthylacetat—Wasser (7:1:2) eluiert, und 25-ml-Fraktionen
wurden mit einem automatischen Sammler gesammelt. Die verschiedenen Fraktionen wurden
durch Chromatographie über Whatman-Papier-Nr. 1, gepuffert bei einem pH-Wert von 5,4 geprüft, wobei
als Eluiermittel die gleiche Mischung verwendet wurde, die zum Eluieren der Säule verwendet worden
war. Die Fraktionen 40 bis 60 enthielten Adriamycin. Die Fraktionen 40 bis 60 wurden vereinigt und auf
50 ml eingeengt. Die ausgefällten Salze wurden filtriert und zum Filtrat wurden 200 ml Wasser zugesetzt,
und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt.
Sie wurde unter vermindertem Druck auf 50 ml eingeengt, das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert
von 8,6 eingestellt und danach mit Chloroform extrahiert. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt, dann
wurden die Chloroformextrakte vereinigt und mit Wasser bei einem pH-Wert von 8,6 und dann mit
gewöhnlichem Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat
wurde unter vermindertem Druck auf 5 ml eingeengt. Hierauf wurden 0,15 ml einer 1 η-Lösung von wasserfreier
Salzsäure in Methanol zugesetzt, und das Gemisch wurde gekühlt. Nach einigen Minuten bildete
sich ein kristalliner Niederschlag von Adriamycinhydrochlorid, der filtriert und mit kaltem Chloroform
und wasserfreiem Äthyläther gewaschen wurde. Es wurden 50 mg des Produktes erhalten, das aus Äthanol
umkristallisiert wurde.
Auf diese Weise wurden 35 mg des Reinproduktes mit einem Fp. von 204 bis 205° C erhalten. Aus den
Mutterlaugen wurden weitere 15 mg eines amorphen Produktes von 90%iger Reinheit gewonnen.
Claims (2)
- Patentansprüche:
1. Adriamycin der FormelO OHCO-CH2OHOHH
O OH O NH2 OHOCH3 Ch-CH2-CH-CH-CH-CH3-O-und seine Salze mit pharmakologisch verträglichen organischen und anorganischen Säuren. - 2. Therapeutische Zusammensetzungen zur Tumorbehandlung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Adriamycin bzw. dessen Salzen mit pharmakologisch verträglichen organischen oder anorganischen Säuren zusammen mit einem üblichen inerten Träger für parenterale oder lokale Verabreichung.
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