NO124883B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt antibioticum,

kalt adriamycin, dets aglycon eller dets syreaddisjonssalter.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt antibioticum, dets aglycon eller dets syreaddisjonssalter , som har vist seg å være spesielt anvendelige innenfor tera-pien som antitumorvirkende produkter. Det nye antibioticum er av indikatortypen og er blitt kalt "adriamycin" eller betegnet som antibioticum "B-106 F.I.".

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibioticum som angitt i patentkravets over-begrep, eller dets aglycon eller dets syreaddisjonssalter, og fremgangsmåten er særpreget ved de i patentkravets karakteriserende del angitte trekk.

Den nye mikroorganisme som anvendes ved foreliggende fremgangsmåte, kan fås ved den folgende mutagene behandling av Streptomyces peucetius beskrevet i norsk patent hr. 111 521 og i Giorn. Microbiol., 1963, 11, 109 - 118. En fosfatpufferopplosning av N-nitroso-N-methyl-urethan (G. ZetterberExp. Cell. Res., 20, 1960,

s. 659) anvendes som mutagent middel. Fria det ved denne behandling oppnådde mycel isoleres de overlevende mikroorganismer på et egnet medium, og de stammer utvelges som er istand til å produsere adriamycin.

Den erholdte nye stamme er blitt g',itt kodebetegnelsen F.I. 106

i Farmitalias mikrobiologiske samling og er blitt benevnt Streptomyces peucetius var. caesius, og stammen er blitt deponert ved the Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey (Storbritannia) under indekstallet I.M.I. 131.502, og i the Institute of Microbiology ved Rutger University (USA) under indekstallet I.M.R.U. 3920. .Den nye mikroorganisme har de folgende mikroskopiske, makroskopiske og biokjemiske egenskaper:

Mikroskopiske egenskaper

Det vegetative mycel på de vanlige dyrkningsmedia viser tynne hyfer (0,5 - 0,9 Mm tykke) som er mer eller mindre langstrakte og for-grenede. Forgreningene danner tykker hyfer (1,1 - 1,7 Mm tykke). Konidioforene samles ofte i knippeformer som avsluttes av kroker. Konidiene er sfæriske med en diameter av 1,8 - 353 Mm, forst anord-nede i små kjeder og så frie. Under elekitronmikroskopet virker konidiene stort sett sfæriske og har ujevne ytterflater og en vorte-aktig overflate.

Makroskopiske egenskaper

Tabell 1 gjengir de på de angitte media observerte dyrknings-egenskaper, idet mikroorganismen fikk vokse ved 28°C og undersøkelser ble gjort den 3dje, 8nde, l5nde, 2lnde og<1> 30te dag etter innpodning.

Biokjemiske egenskaper

Gelatin: langsom og delvis hydrolyse.

Nitrater: ingen reduksjon til nitritter.

Utvikling av hydrogensulfid: positiv.

Melk: ingen peptonisering, ingen koagulering.

Stivelse: meget langsom og liten hydrolyse.

Maltose, xylose, mannose, mannitol, glycerol, glucose, saccharose, trahalose, raffinose og fructose utnyttes.

Lactose, adonitol, ramnose, sorbitol, arabinose, esculin og meso--■. i u u o inositol utnyttes ikke. Antibiotica: i flytende submers kultur gir den stoffer med anti-biotisk og antitumorvirkning.

Klassifisering av mutanten F. I. 106

Mutanten F.I. 106 har folgende taksionomiske stilling. Ifolge klassifiseringssystemet til PRIDHAM og medarb. (Appl. Microbiol,

1958, 6, s. 52) tilhorer mikroorganismen gruppen Rectinaculum apertum, "ROD" serie. Ifolge klassifiseringssystemet til BALDACCI (Giorn. Microbiol, 1958, 6, 10) tilhorer mikroorganismen serien Albosporeus. Ifolge systemet til WAKSMAN (The Actinomycetes, Vol. II, 1961, s.

129) tilhorer mikroorganismen serien Ruber. En sammenligning mellom mutantens F.I. 106 egenskaper og egenskapene til arter som tilhorer de nevnte systematiske grupper (taksa), har vist at ingen av de sistnevnte har egenskaper som tilsvarer egenskapene til mutanten F.I. 106. Tabell II gjengir sammenligningsdata for mikroorganismer som produserer lignende antibiotiske stoffer. Tabellen omfatter Streptomyces (Sj . cinereoruber, S. cinereoruber var. fructo-fermentans, S. caespitosus og S. antibioticus ennskjont disse ikke tilhorer de nevnte taksa. Der forekommer også en liste over ulikhetene for de arter som ikke produserer stoffer av den undersbkte type. Mikroorganismen er forskjellig fra S. albosporeus (WAKSMAN: The Actinomycetes, Vol. II, 1961, s. 171) da den sistnevnte ikke gir opp-løselige pigmenter, reduserer nitrater og ikke gir hydrogensulfid. Videre er mikroorganismen forskjellig fra S. cinnamomensis (WAKSMAN: The Actinomycetes, Vol. II, 1961, s.195) med hensyn til det vegetative mycels og luftmycelets farve, fra S. ruber (WAKSMAN: The Actinomycetes, Vol. II, 1961, s. 271) på grunn av at den sistnevnte koa-gulerer melk, ikke gir opploselige pigmenter og ikke bevirker utvikling av hydrogensulfid, fra S. rubescens (WAKSMAN: The Actinomycetes, Vol. II, 1961, s. 271) med hensyn til luftmycelets farve og fordi S. rubescens ikke danner opploselige pigmenter og ikke gir hydrogensulfid, og fra S. oidiosporous (WAKSMAN: The Actinomycetes, Vol. II, 1961, s. 251) ved at den sistnevnte ikke reduserer nitrater, ikke peptoniserer melk og ikke gir opploselige pigmenter. Det kan således sluttes at mutanten F.I. 106 av S. peucetius er forskjellig fra alle arter som gir lignende stoffer og fra alle arter som tilhorer de systematiske undergeneriske grupper som stammen selv tilhorer. Mutantstammen F.I. 106 er forskjellig fra hoved-stammen S. peucetius som gir daunomycin (norsk patent nr. 111521), ved at den danner et sterkere rodfarvet vegetativt m^cel og et luftmycel som av og til får en blågronn turkis farvetone, og ved at den gir antibioticumet adriamycin.

For S.A. 1165 og S.A. 220 se Asheshov og medarb. Antibiotics and Chemotherapy, 195<>>+, it, 380

For S.DOA 1205 se Brockmann, Chem. Ber., 1959, 2£, 1880

Mutanten F.I. 106 kan lagres ved lyofilisering under anvendelse av melk eller melkeserum som suspensjonsmedium eller ved å oppsamle og holde sporene i et sterilt substrat. Den kan også lagres ved suksessiv dyrkning på et fast medium inneholdende glucose eller et annet egent sukker og komplekse stoffer inneholdende nitrogen (gjærekstrakt, pepton eller hydrolysert kasein). Mediet kan også inneholde noen salter av hvilke magnesiumsulfat og kaliumsulfat er spesielt viktige.

Fremstillingen av antibioticumet utfores som regel ved å

dyrke mutanten F.I. 106 i et på forhånd sterilisert, flytende dyrkningsmedium under aerobe betingelser ved 25-37°C, fortrinnsvis ved 28°C, i 3-7 dager, fortrinnsvis 5 dager, og ved en pH som til å begynne med er 6,5-7,0 og ved slutten av gjæringen er 7,5-8,0.

Dyrkningsmediet består av en carbonkilde og en nitrogenkilde

og mineralsalter. Carbonkilden kan f.eks. være stivelse, dekstrin, glucose, glycerol, mannitt, maltose, maisstopevæske, brenneriopp-losninger, soyaolje eller soyamel. Nitrogenkilden kan foruten de ovennevnte komplekse stoffer som inneholder nitrogen, f.eks. være torket gjær, kjottpepton eller kasein. Gode resultater fås også

ved anvendelse av ammoniumsalter, som ammoniumnitrat, ammoniumsulfater eller diammoniumfosfater. Mineralsaltene vil variere avhengig av det anvendte medium. I et medium inneholdende komplekse stoffer,

som forskjellige melsorter og gjæringsrester, har tilsetning av kalsiumcarbonat og natrium- eller kaliumfosfater vist seg å være gunstig. I media inneholdende glucose, gjær eller ammoniumsalter er det nodvendig med storre tilsetninger av mineralsalter, som kalium-, magnesium-, jern-, sink-, mangan- og kobber salter. Gjæringen kan utfores i en Erlenmeyer-kolbe i et laboratorium eller tekniske gjæ<p->ingsapparater med forskjellig kapasitet.

Den tilstedeværende mengde av adriamycin i de erholdte gjærings-væsker kan beregnes ved hjelp av folgende metode: Kulturen filtreres gjennom 2 % "Hyflo Supercel". Den filtrerte væske reguleres till en pH av 8,6 med IN natriumhydroxydopplosning og ekstraheres to ganger med en 9:1 .kloroform:methanolblanding. Ekstrakten vaskes med vann og konsentreres til torrhet under vakuum. Den gjenværende rest tas opp med methylalkohol og kromatograferes over "Whatman" MM N° papir som er blitt pufret med M/15 fosfatpuffer ved en pH av 5A, under anvendelse av en blanding av propanol-ethylacetat-vann (7:1:2) som elueringsmiddel. Den rodfarvede del som tilsvarer Rf av adriamycin, elueres med en methanol-vannblanding (9:1), og mengden av tilstedeværende adriamycin i den filtrerte væske bestemmes spektrofotometrisk ved å undersbke en prove av eluatet med bølgelengden 495 my og ved å sammenligne denne med en prove av adriamycin hvis titer er kjent.

Den tilstedeværende mengde adriamycin i mycelet kan bestemmes som folger: Mycelet ekstraheres med en 4:1 aceton-0,lN stiovelsyreblanding. Ekstrakten nøytraliseres og konsentreres under redusert trykk inntil 1/5 av dens opprinnelige volum. Konsentratet reguleres til en pH av 8,6 med IN natriumhydroxydopplosning og ekstraheres så to ganger med en 9:1 blanding av kloroform og methanol. Ekstrakten vaskes med vann og konsentreres til tbrrhet under vakuum. Adriamycininnholdet i en prove av; den gjenværende rest bestemmes så ved hjelp av den ovenfor angitte metode.

For å isolere adriamycin kan antibioticumet ekstraheres med et opplbsningsmiddel enten fra dyrkningsvæsken i sin helhet uten å filtrere av. mycelmassen eller fra mycelet og dyrkningsvæsken som på forhånd er blitt adskilt ved filtrering. Ved å utfore ekstrak-sjonen separat foretrekkes det å gå frem som folger: Ved slutten av dyrkningen-settes et adsorberende siliciutiiholdig materiale, som "Supercel", til dyrkningsvæsken. Blandingen filtreres, og både filterkaken og filtratet behandles separat. Mesteparten av antibioticumet befinner seg i filterkaken som består av mycelet blandet med de adsorberende siliciumholdige materialer. Kaken omdannes til en grot og omrbres i et organisk opplbsningsmiddel. Av egnede opplbsningsmidler kan nevnes alkoholer som methanol, ethanol eller butanol, ketoner som aceton eller methylethylketon, halogenholdige hydrocarboner som kloroform eller methylendiklorid, eller vandige opplbsninger av organiske eller uorganiske syrer som eddiksyre, saltsyre eller svovelsyre. Det foretrekkes å anvende blandinger av organiske opplbsningsmifller, som alkoholer og vannblandbare ketoner, og vandige opplbsninger av uorganiske syrer. Det foretrekkes å anvende en blanding av aceton og 0,1N svovelsyre i et forhold av 7:1 - 3:1, fortrinnsvis 4:1. Antibioticumet kan ekstraheres med et med vann ublandbart organisk opplbsningsmiddel fra den filtrerte væske som er blitt gjort alkalisk inntil en pH av 8,5 - 9,0. Blandt egnede opplbsningsmidler kan nevnes alkoholer, ketoner og halogenholdige, lav-ere, alifatiske hydrocarboner, som amylalkohol, butylalkohol, methyl-isobutylketon, methylendiklorid, kloroform eller en blanding av to eller flere av disse. Ved en annen fremgangsmåte kan den filtrerte væske ekstraheres ved å lede væsken gjennom en kromatografikolonne inneholdende en kationisk, carboxylisk ionebytterharpiks, f.eks. "Amberlite" IK 50, i syreform hvorfra produktet kan elueres med en vandig methanolholdig oppliSsning av natriumklorid. De organiske ekstrakter fra væsken og mycelet oppsamlet, nøytraliseres, blandes med vann og konsentreres under redusert trykk. Det vandige konsentrat reguleres til en pH av 3 med IN saltsyre og ekstraheres så med kloroform. Ekstrakten inneholdende forskjellige forurensninger, fjernes mens det vandige lag reguleres til en pH av 8,5 - 9,0, og ekstraheres med en kloroform-methanolblanding (9:1). Ekstrakten vaskes med vann, tbrkes over vannfritt natriumsulfat og konsentreres så til et lite volum under redusert trykk. Ved tilsetning av diethylether fåes fra konsentratet et råprodukt som inneholder adriamycin i form av en fri base som hovedbestanddel.

For å rense adriamycin for forskjellige vann- og lipoid-opplbselige pigmenter kan motstromsfordeling eller kolonnekromatogra-fi anvendes. I førstnevnte tilfelle kan en blanding av kloroform-methanol-M/15-fosfatbuffer (2:2:1) anvendes ved en pH av 5,4. Det fåes bedre resultater ved å anvende kromatografering over en kolonne av cellulose som er blitt pufret med et fosfat ved en pH av 5,4 og ved anvendelse av en blanding av propanol-ethylacetat-vann (7:1:2) som elueringsmiddel. De adriamycinholdige fraksjoner oppsamles og konsentreres etter tilsetning av vann. Det vandige konsentrat reguleres til en pH av 8,6 med IN natriumcarbonat og ekstraheres så med kloroform. Kloroformopplosningen tbrkes over vannfritt natriumsulfat og konsentreres så til et lite volum. Ved tilsetning av saltsyre inneholdende vannfri methanol fåes adriamycinhydrogenklorid.

Adriamycinhydrogenkloridet foreligger i form av tynne oransjerbde nåler som ved rekrystallisering fra vannfri ethylalkohol gir oransjerbde nåler som smelter.ved 204 - 205° C (ved spaltning). Det er optisk aktivt [a]jp =jp£* (c = 0,1 i methanol). En eie-rne nteranalyse av en renset adriamycinhydrogenkloridprbve gir folgende verdier: C 7. =54,36 H 7. = 5,43 N 7. = 2,37 Cl = 6,42. Molekylf ormelen tilsvarer C-27^29^11 •HCl, og molekylvekten er 579,98. Adriamycinhydrogenklorid er opplbselig i vann, methanol og vandige alkoholer, men uoppløselig i aceton, benzen, kloroform, diethylether og petroleumsether. Dets alkoholholdige opplbsninger sir karakter-istiske farver med metallsalter: carmosinrbdt med magnesiumsalter, carmosinrbdt med kalciumsalter og mbrkerbdt med blysalter. Ved alkalisk pH iakttaes et omslagspunkt til fiolett farve og utfelling av pigmenterte stoffer. Vandige opplbsninger av adriamycinhydrogenklorid har en guloransje farve ved en sur pH, en rbdoransje farve ved en nbytral pH og en fiolett-blå' farve 'ved en pH over 9. Spektrumet innenfor de ultrafiolette og synlige områder i methanol viser folgende maksimumsverdier: ved 233 m» (E \% cm = 673) ved 479 mu (E j;7°cm = 219)

ved 252 m» (E \ 7ecm = 450) ved 496 m» (E ]^ Qm =217)

ved 288 m» (E \ J' cm <=> 159> ved 529 m» (E \% cm <=><1>18)

Innenfor det infrarbde område forekommer bånd med folgende bølgelengder: (i v-) : 3,00, 3,44', 5,80, 6,17, 6,31, 6,55, 7,05, 7,78, 8,11, 8,24, 9,00, 9,35, 10,10, 10,98, 11,50, 12,68, 13,12, 14,60.

Adriamycin har strukturformelen I:

t

Antibioticumet er en base som er istand til å danne salter med uorganiske og organiske syrer. Den iakttatte farveforandring fra rbdt til blåfiolett ved pH'v9 skyldes dannelsen av salter ved de fenoliske hydroxylgrupper. Syrer bevirker; at den glycosidiske bind-ing spaltes. Ved f.eks. å oppvarme adriamycin til 100° C i 0,5N mineralsyrer i 1 time fåes et rbdfarvet aglycon som er uoppløselig i vann (adriamycinon), og en vannopplbselig, basisk, reduserende fraksjon (daunosamin). Adriamycinon har strukturformelen II:

Den tilsvarende molekylformel er C2j.Hj.gO9. Det smelter ved 223 - 224° C, £ajD=<+> 156° (c = 0,1 i dioxan).

Spektrumet innenfor de ultrafiolette og synlige områder viser maksimumsverdier ved folgende bølgelengder:

Folgende absorpsjonsbånd forekommer innenfor det infrarbde område (i iO:2,90, 3,42, 5,79, 6,18, 6,34, 6,92, 7,08, 7,26, 7,42, 7,80, 7,90, 8,05, 8,29, 8,43, 8,72, 8,93, 9,30, 9,88, 10,10, 10,86, 12,32, 12,75, 13,16, 13,70, 14,40. Massespektrumet til adriamycinon viser folgende topper: <m>/e 414 (M), 378 (M-2H20), 347 (M-2H2O-CH2OH). Pentaacetatet av adriamycinon (fremstilt ved behandling av adriamycinon med eddiksyreanhydrid og pyridin) har molekylf ormelen C31H2g014, smelter ved 164 - 166° C, [a]D = -94° (c = 0,1 kloroform) og viser folgende massespektrum: <m>/e 624 (M), 582 (M-CH2C0), 540 (M-2CH2CO), 480 (M-2CH2CO-CH3COOH), 420 (M-2CH2CO-2CH3COOH), 378 (M-3CH2CO-2CH3COOH), 347 (M-3CH2CO-2CH3COOH-CH2OH). Den vannopplbselige fraksjon (daunosamin) består av et reduserende aminosukker med strukturformelen III:

Daunosaminhydrogenklorid smelter ved 168° C (under spaltning), [a]D = -54,5° (i vann), N-benzoylderivatet smelter ved 154 - 156° C.

Kromatografi av adriamycinhydrogenklorid og dets aglycon sammenlignet med daunomycin og daunomycinon

Papirkromatografi: "Whatman"-papir nr. 1 pufret med M/15 fosfatpuffer ved pH 5,4, synkende utvikling i 16 timer ved værelsetempe-ratur.

Opplbsningsmiddel A: Butanol mettet med M/15 fosfatpuffer ved pH 5,4. Opplbsningsmiddel B: Propanol-ethylacetat-vann (7:1:2).

Tynnskiktskromatografi : Kiselgel G-skikt (Merck) pufret med 1 7» oxalsyre i vann. Kromatogrammet ble utfort med 10 cm ved værelse-temperatur.

System C: methylendiklorid-methanol (100:15).

System D: n-butanol-eddiksyre-vann (4:1:5) ovre fase.

System E: benzen-ethylacetat-petroleumsether som kokte ved 80 -

120° C (80:50:20).

System F: benzen-ethylformLat-maursyre (50:50:1).

Saltene av adriamycin kan fåes ved å omsette basen med ugiftige organiske og uorganiske syrer, som saltsyre, svovelsyre, eddiksyre , propioneyre, valeriansyre, palmitinsyre, oljesyre, sitron-syre, rav syre, mandelsyre, glutaminsyre eller pantothensyre. Noy-trale salter fåes ved å omsette den tilsvarende syre med den frie base som fåes ved å ekstrahere en vandig opplbsning av hydrogenklo-ridet ved en pH av 8,6 med organiske opplosningsmidler som er uopp-løselige i vann, f.eks. butanol og kloroform. Ved fordampning av det organiske opplbsningsmiddel fåes antibioticumet adriamycin i form av en fri base. Saltene kan også fåes ved dobbelt utbytting av saltene. Således fås f.eks.adriamycinpantothenat fra adriamycin-sulfåt med kalsiumpantothenat. Ennskjont antibioticumet adriamycin har en bemerkelsesverdig bactereostatisk virkning overfor flere mikroorganismer (se tabell 3), har det vist seg å være spesielt an-vendelig som antitumorstoff. Det har ingen interessant virkning overfor sopp og.gjær.

Antibioticumet oppviser en markert inhiberende virkning på ascitisk tumorvekst dersom det foreligger umiddelbar kontakt mellom antibioticumet og de neoplastiske celler. En god inhiberende virkning iakttas også i faste tumorer hvor virkningen er forskjellig avhengig av administreringsmåten og dosen. Adriamycinets antitumorvirkning gir bedre resultater med hensyn til effektivitet og varighet enn daunomycin ved disse forsok. Antibioticumet adriamycin og dets salter, dets hydrolytiske avbygningsprodukt og blandinger av to eller flere av disse kan anvendes som medisiner i farmasøytiske sammensetninger inneholdende adriamycin i blanding med en bærer som er egnet for parenteral eller lokal administrering. For parenteral administrering anvendes fortrinnsvis lyofiliserte preparater som skal opploses i det byeblikk de anvendes.

Farmacologi

Undersokelse av antibioticumet adriamycins antitumorvirkning

Antitumorvirkningen til antibioticumet adriamycin oppnådd fra Streptomyces F.I. 106 er blitt undersbkt i forbindelse med enkelte mus- og rottetumorer både i fast og ascitisk form.

1) Ascitiske tumorer

Aktivitetsundersokelser er blitt utfort på mus med Ehrlich ascitisk carcinom og behandlet intraperitonealt med oppløsninger av antibioticumet med forskjellige konsentrasjoner i fem på hverandre folgende dager fra dagen etter at tumoren ble innpodet. Resultatene er sammenfattet i tabell 4 og viser at det undersokte antibioticum ved administrering i samme doser av 1,75 og 2,50 mg/kg/dag har en bemerkelsesverdig inhiberende virkning på veksten av den ascitiske tumor og at de behandlede dyrs gjennomsnittlige overlevningstid oket betraktelig.

Resultatene er blitt bekreftet ved suksessive forsbk hvor antibioticumet ble administrert i doser av 1,25 og 2,50 mg/kg/dag (tabell 5).

En sammenligning av de oppnådde resultater, under de samme eksperimentelle betingelser på mus med Ehrlich ascitisk carcinom, med antibioticaene daunomycin og adriamycin sammenlignet ned kontrollmus viser at det sistnevnte er et mer aktivt produkt. Det fremgår av tabell 6 at overlevningstiden for behandlede mus sammenlignet med kontrollmusene er hoyere med adriamycin for samme tilforte dose.

fabell 6

Forhold mellom den gjennomsnittlige overlevningstid for mus mad

Ehrlich ascitisk carcinom (hvert tall viser gjennomsnittet av de oppnådde resultater for grupper med 10 dyr pr. gruppe).

Adriamycinets antimitotiske virkning er blitt påvist ved forsbk utfort i forbindelse med mus med ascitiske tumorer i logaritmisk veksttrinn (5.dag). Disse dyr er blitt intraperitonalt behandlet med bare én administrering av adriamycin av 2 mg/kg. Undersbkelse av oppstrbk av det neoplastiske eksudat fjernet for og ved forskjellige tidsintervaller etter behandlingen (2, <>>+, 8, 2^, 32 og ^8 timer) har vist at antibioticumet te virke r en meget hurtig og fullstendig stopp av tumorens formeringsaktivitet som varer inntil den 32. time. ^8 timer etter behandlingen iakttas flere celler i mitosis, med stadig foranderlig morfologi.

2) Faste tumorer

Undersøkelser av virkningen på faste tumorer er blitt ut-

fort med sarcon l80 på mus og med Oberling-Guerin-Guerin myelom på rotter. a) Sarcom l80: Mus innpodet med et fragment av neoplastisk vev er blitt behandlet subkutant i 8 dager fra den dag tumoren ble innplan-tert. Antibioticumet er blitt administrert i opplbsninger med forskjellige konsentrasjoner tilsvarende de folgende doser i mg/kg/dag:

7, 5, 3,5, 2,5 og 1,75. Etter at forsbket hadde vart i 11 dager,

ble alle dyr avlivet og deres tumorer fjernet og veiet. Resultatene er gjengitt i tabellene 7 og 8.

Det fremgår av de to tabeller at adriamycin har bevirket en markert inhibering av tumorveksten ved alle de anvendte doser. Det inntrer en merkbar dbdelighet hos de behqndlede dyr bare ved anvendelse av en stbrre dose (7 mg/kg/dag). Forsbk som er blitt utfort parallelt ved de samme eksperimentelle betingelser med antibioticumet daunomycin (tabell 8), har gjort det mulig å trekke opp dosevirkningskurver for de to produkter og å gjennomføre en sammenligning av deres virkninger. Det fremgår klart at véd de samme eksperimentelle betingelser har adriamycin en stbrre virkning enn daunomycin på denne tumortype. Resultatet fremgår ennu klarere ved en betraktning av de inhiberende doser 50 (ID 50):

Daunomycin: ca. 3,3 mg/kg

Adriamycin: ca. 1,5 mg/kg

Forsbk med underakutt toksisitet utfort på friske mus med adriamycin administrert subkutant i 8 dager med doser varierende fra 10 til 1,25 mg/kg har gitt resultatene ifolge tabell 9:

Fra de ovenstående data kan det beregnes grafisk at den dbdelige dose 10 (LD 10) er 6,4 mg/kg. Fra kurven kan det også ut-ledes at adriamycins inhiberingsdose 90 (ID 90) er 5 mg/kg. Med disse data er det mulig å beregne, ifolge Skipper (Canser Chemo-therapy Report, 1962, 17_, 1) at adriamycins terapeutiske indeks er:

Under de samme eksperimentelle betingelser er daunomycins terapeutiske indeks 0,67. Fra det ovannevnte arbeide av Skipper fremgår det at under de samme eksperimentelle betingelser er den terapeutiske indeks til andre anti-tumorvirkende antibiotica (actino-mycin, mitomycin, actinobolin og actidion) under 1. b) Oberling- Guerin- Guerin myelom; Wistar-rotter innpodet med et fragment av tumorvev iblfi intravenbst behandlet i 8 dager regnet fra dagen etter innplantering av tumoren. 12 dager etter at eksperimentet var blitt påbegynt, ble de overlevende dyr avlivet og tumorene fjernet og vjeiet.

Det fremgår av tabell 10 at antibioticumet er virksomt også overfor denne type av tumorer. Ved disse eksperimentelle betingelser er adriamycins ID 50 ca. 2 mg/kg.

Eksempel 1

To 300 ml Erlenmeyer-kolber ble satt istand, idet hver kolbe inneholdt 60 ml av det folgende dyrkningsmedium for den vegetative fase: pepton 0,6 7., tbrret gjær 0,3 7., hydratisert kalcium-nitrat 0,05 °U og ledningsvann inntil 100 7.. Sterilisering ble utfbrt ved oppvarming i en autoklav til 120° C i 20 minutter. Etter steriliseringen var pH 7,2. Hver flaske ble innpodet med en mengde mycel av mutanten F.I. 106 tilsvarende 1/5 av en suspensjon i sterilt vann av mycelet av en 10 dager gammel kultur dyrket i et stort reagens-glass på folgende medium: saccharose 2 7o,' tbrket gjær 0,1 7o, dikaliumfosfat 0,2 7», natriumnitrat 0,2 7., magnesiumsulfat 0,2 7.,

agar 2 7. og ledningsvann inntil 100 7„. Flaskene ble inkubert ved 28° C i 48 timer på en roterende rystemaskin med et utslag av 30 mm og en rotasjonshastighet av 220 omdr. pr. minutt. 2 ml av et således dyrket vegetativt medium ble benyttet for podning av 300 ml Erlenmeyer-kolber med 60 ml av folgende medium for den produktive fase: glucose 6 70, tbrket gjær 2,5 7o, natriumklorid 0,2 /' a, dikaliumf osf at 0,1 7o, kalciumcarbonat 0,2 7», magnesiumsulfat 0,01 7o, toverdig jernsulfat 0,001 7», sinksulfat 0,001 7», kobbersulfat 0,001 7. og ledningsvann inntil 100 70. Glucosen var på forhånd blitt separat sterilisert ved 110° C i 20 minutter. Den erholdte pH var 7. Kolbene steriliseres ved 120 C i 20 minutter og inkuberes ved 28° C under de samme omrbiingsbetingeIser som for det vegetative medium. Den hbyeste konsentrasjon av antibioticumet ble nådd etter gjæring i 6 dager. Den fremstilte adriamycinmengde tilsvarte da en konsentrasjon av 15 vig/ml.

Eksempel 2

Det ble gjennomfbrt et forsbk på samme måte som i eksempel 1, bortsett fra at innpodningskulturen ble dyrket på folgende faste

medium, fremstilt som folger: 200 g skrellede poteter ble kokt i 20 minutter i 500 ml vann. Volumet ble bragt opp til dets opprinnelige verdi og filtrert gjennom gas. 2 7« glucose, 0,1 70"Difco-gjærekstrakt og 2 % agar ble tilsatt. Volamet ble bragt opp til 1000 ml. Den erholdte blanding ble sterilisert ved 120° C i 20 minutter og ved en pH av 6,8 - 7,0. Den hbyeste konsentrasjon av adriamycin var 12 vig/tnl og ble nådd etter 140 timer.

Eksempel 3

Det ble benyttet samme fremgangsmåte som i eksempel 2, bortsett fra at de vegetative og produktive media hadde folgende sammensetninger: Ve<g>etativt medium: stivelse 3 7», kalciumcarbonat 0,4 7», opploselige brennerirester 0,3 7«, ammoniumsulfat 0,1 7o, casein 0,5 7», dikaliumfosfat 0,01 7o og ledningsvann inntil 100 7„. Etter sterilisering i en autoklav ved 120° C i 20 minutter var pH 7.

Produktivt medium: stivelse 5 7», kalciumcarbonat 0,8 7o, maisstbpe-væske 0,6 7», casein 0,5 7., ammoniumsulf at 0,1 7. og dikaliumf os fat 0,01 %. Etter steriliseringen var pH 7. Steriliseringen ble utfort på samme måte som for den vegetative fase. Den hbyeste produksjon var 6,5 Mg/ml og ble nådd etter 7 dager.

Eksempel h

En kultur av mutanten F.I. 106 på et fast medium som benyttet

i eksempel 2, ble innpodet i 500 ml av det væskeformede medium til den vegetative fase ifolge eksempel 1 i en 2000 ml "Pyrex" glass-kolbe. Den erholdte blanding ble inkubert ved 28°C i h8 timer på.,

en roterende rystemaskin med et utslag av 3,5 mm og en omdreinings-hastighet av 120 omdr. pr. minutt. 100 ml av den således erholdte dyrkningsvæske ble så innpodet i 300 ml av det samme flytende medium i et 5 liters noytralt gjæringsapparat av glass med en skrueomrbrer, et innlbpsrbr for innforing av luftbobler under skrueomroreren, en væskestrbmbryter, et innpodningsrbr, et luftavlopsrbr , temperatur - kontrollutstyr og en anordning for periodevise eller kontinuerlige tilsetninger under sterile betingelser. Veksten ble utfort ved 28°C under tilfor sel av luft i en mengde av 3 liter pr. minutt og omroring med ^t-00 omdr. pr. minutt. Etter 2h timer ble 300 ml av den således dyrkede kultur innpodet i 6 liter av det produktive medium ifolge eksempel 1 i et 10 liters noytralt gjæringsapparat av glass som beskrevet ovenfor. Gjæringen ble utfort ved en omrbringshastig-het av 350 omdr. pr. minutt og med en tilfor sel av luft i en mengde av 5 liter pr. minutt, idet skumningen ble holdt under kontroll ved tilsetning av små mengder silicon-antiskumningsmiddel. Den hbyeste produksjon som ble oppnådd i lbpet av 150 timers gjæring, tilsvarte en 6 /ig/ml konsentrasjon av adriamycin.

Eksempel 5

Med en kultur oppnådd som beskrevet i eksempel 1 ble en

2000.ml's kolbe innpodet med 500 ml av et medium med folgende sammensetning: pepton 0,6 %, kornformet tbrket gjær 0,5 % og 0,05 % kalcium-nitrat i ledningsvann. Mediet ble omrbrt på en roterende rystemaskin i k8 timer ved 28°C. Ved hjelp av den således erholdte kultur.-ble 50 liter av mediumet i et 80 liters gjæringsapparat innpodet. Dette medium ble omrbrt med 230 omdr. pr. minutt og tilfort luft i en mengde av 0,7 liter/liter av mediumet pr. minutt ved 27 C. Etter k - 5 timer ble dyrkningsvæsken anvendt for podning av 500 liter av dyrkningsmediumet i et ca. 800 liters gjæringsapparat. Gjærings-mediumet hadde folgende sammensetning: glucose 7 %, ertemel 6,65 %, kalciumcarbonat 0,2 %, natriumklorid 0,2 %, dikaliumfosfat

0,1 7o, magnesiumsulfatheptahydrat 0,02 7«, toverdig jernsulfathepta-hydrat 0,00068 7», mangansul f atheptahydrat 0,001 7„, kobbersulfat 0,002 % og ledningsvann inntil 100 7». Mediumet ble sterilisert ved 120° C i 30 minutter, avkjblt til 27° C og, etter innpodning, omrbrt med 250 omdr. pr. minutt og tilfort luft i en mengde av 0,4 liter/ liter medium/minutt. Etter 145 timer inneholdt dyrkningsvæsken 6,5 ug/ml adriamycin.

Eksempel 6

60 liter av dyrkningsvæsken fra gjæringen ifolge eksempel

4 ble filtrert gjennom "Super-cel", og det ble oppnådd en kake og et filtrat som ble separat ekstrahert. Kaken ble suspen-dert i aceton fortynnet med 0,1N vandig svovelsyre (4:1) og omrbrt i 2 timer. Væsken ble filtrert, og kaken ble dessuten omrbrt to ganger. De erholdte ekstrakter ble bragt sammen, nøytralisert og acetonet for-dampet under vakuum. Konsentratet som inneholdt ca. 0,25 g adriamycin ble gjort sur til en pH av 3 med IN saltsyre og så ekstrahert med kloroform som fjernet en del av forurensningene. Den vandige fase ble innstilt på en pH av 8,6 med IN natriumhydroxyd og ekstrahert med en klorof orm-methanol blanding (9:1). Fremgangsmåten ble gjentatt inntil den vandige fase var farvelbs. Methanol-kloroformekstraktene ble vasket med vann ved en pH av 8,6, tbrket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert til et lite volum under redusert trykk. Adriamycin ble utfelt som fri base ved tilsetning av diethylether. 1,50 g råprodukt ble oppnådd som inneholdt ca. 0,2 g adriamycin. Den filtrerte væske ble innstilt på en pH av 8,6 med IN natriumhydroxyd og ekstrahert med en kloroform-methanolblanding (9:1). Fremgangsmåten ble gjentatt to ganger. Methanol-klorof ormekstraktene ble vasket med vann ved en pH av 8,6 og ekstrahert påny med 0,01N saltsyre inntil den vandige fase fikk en rod farve. Kloroformfasen ble fjernet. Den vandige fase ble filtrert, innstilt på en pH av 8,6 med IN natriumhydroxyd og ekstrahert med en kloroform-methanolblanding (9:1). Ekstrakten som på dette trinn foruten forskjellige forurensninger også inneholdt 0,15 g adriamycin, ble vasket med vann ved en pH av 8,6, tbrket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert til et lite volum under redusert trykk. Ved tilsetning av 10 volumdeler diethylether ble 1,00 g råprodukt inneholdende 0,12 g adriamycin utfelt. En samlet mengde av 0,320 g adriamycin i form av en urenset base ble oppnådd.

Eksempel 7

0,500 g råprodukt inneholdende ca. 15 7. adriamycin ble

opplost i 10 cm 3 M/15 bufferfosfat ved en pH av 5,4. Oppløsningen ble absorbert på 10 g cellulosepulver ("Whatman" CF 11). Blandingen ble om natten vakuumtbrket over vannfritt kalciumklorid, anbragt i en glasskromatografikolonne (100 cm hby og med en diameter av 4 cm) inneholdende 225 g cellulosepulver ("Whatman" CF 11) som på forhånd var blitt pufret med M/15 bufferfosfat ved en pH av 5,4, og tbrket under vakuum over vannfritt kalciumklorid. Eluering ble utfort med en blanding av propanol-ethylacetat-vann (7:1:2), og fraksjoner av 25 ml ble oppsamlet med en automatisk oppsamler. De forskjellige fraksjoner ble undersbkt ved kromatografi over "Whatman" papir nr. 1 pufret ved en pH av 5,4 og ved anvendelse av den samme blanding som elueringsmiddel som ble anvendt for å eluere kolonnen. Frak-sjonene 40 - 60 inneholdt adriamycin og ble forenet og konsentrert til 50 ml. Salter ble utfelt og filtrert. 200 ml vann ble satt til filtratet, og pH regulert til 7 med IN natriumhydroxyd. Den erholdte opplbsning ble konsentrert under redusert trykk til 50 ml. Konsentratet ble regulert til en pH av 8,6 og ekstrahert med kloroform. Fremgangsmåten ble gjentatt tre ganger. Kloroformekstraktene ble

så kombinert, vasket med vann med en-pH av 8,6 og så med rent vann. Ekstraktene ble avvannet over vannfritt natriumsulfat, filtrert og filtratet konsentrert til 5 ml under redusert trykk. 0,15 ml av en IN opplbsning av vannfritt hydrogenklorid i methanol ble tilsatt og åvkjblt. Etter et par minutter ble et krystallinsk bunnfall av adriamycin-hydrogenklorid dannet, og bunnfallet ble filtrert og vasket med kald kloroform og vannfri di ethylether. Det ble oppnådd 50 mg av produktet som ble rekrystallisert fra ethanol. På denne måte ble oppnådd 35 mg av et rent produkt som smeltet ved 204 - 2C5° C. Fra moderluten ble ytterligere 15 mg av et amorft produkt med 90 7. renhet utvunnet.

Eksempel 8

0,077 g adriamycinhydrogenklorid ble opplost i 4 ml 0,5N saltsyre og oppvarmet i 1 time ved 100° C. Det ble oppnådd et mbrkerbdt, amorft bunnfall som ble oppsamlet ved filtrering etter avkjbl-ing. Produktet ble vasket med vann inntil vaskevannet var noytralt og vakuumtbrket over kaliumhydroxyd over natten og i 6 timer over fosforpentoxyd ved 56° C. Det ble oppnådd 47 mg aglycon av adriamycin som smeltet ved 223 - 224° C, [a] = + 156° (dioxan) med formelen C2^H^g0g. Etter utfelning av ^aglyconet inneholdt den nærmest farvelbse vandige syreopplbsning en forbindelse som reduserte

Fehling's opplbsning og som ga positiv reaksjon med ninhydrin. Opp-løsningen ble nbytralisert (pH 6) ved å ledes gjennom en "Dowex" ionebytterharpiks 1 x 8 (i form av bicarbonat). Harpiksen ble filtrert og filtratet lyofilisert. Det hvite residuum besto av et aminosukker som hadde samme egenskaper som daunosaminhydrogenklorid. Aminosukkeret skilte seg ikke fra daunosamin ved papirkromatografi med de blandede opplbsningsmidler: butanol-eddiksyre-vann (4:1:1)

og (4:1:5), butanol-pyridin-vann (6:4:3), og ved tynnskikts "Alusil"^ kromatografi ved anvendelse av et opplbsningsmiddel bestående av en blanding av propanol-ethylacetat-vann-257o vandig ammoniakk (6:1:3:1). Produktet kunne påvises med ninhydrinreagens og med anilinfthalater over papir, og med anisaldehyd og svovelsyre på tynne skikt.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt antibioticum, kalt adriamycin og med formelen

   eller dets aglycon eller dets syreaddisjonssalter, karakterisert ved at mikroorganismen Streptomyces peucetius var. caesius dyrkes under aerobe betingelser i et flytende næringsmedium inneholdende en carbonkilde, en nitrogenkilde og mineralsalter ved en temperatur av 25 - 37°C i 3 - 7 dager, hvoretter adriamycin isoleres og renses som sådant eller overfores til sine salter med uorganiske eller organiske syrer eller omdannes til sitt aglycon ved syrehydrolyse.