NO150785B - Fremgangsmaate for fremstilling av toerre stivelseholdige naeringsmidler - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt antibiotikum,

daunomycin, dettes aglykon og salter derav.

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt antibiotikum og derivater derav som er nyttig i terapien, særlig som krefthem-mende middel. Spesielt gjør foreliggende fremgangsmåte det mulig å fremstille et nytt antibiotikum som har en indikators egenskaper. Det er gitt navnet daunomycin, men i det etterfølgende betegnes det også som antibiotikum «F. I. 1762a.. Fremgangsmåten omfatter også fremstilling av salter og hydrolytiske avbygningsprodukter. Den biosyntetiske fremgangsmåte for fremstillingen beror på anvendelsen av en ny art av slekten Streptomyces, som er gitt navnet Streptomyces peucetius og som i det etterfølgende er betegnet som «Streptomyces F. I. 1762» eller kort «Streptomyces 1762». «Streptomyces F. I. 1762» er regist-rert ved Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey (England) under indeksnummer I.M.I. 101.335 og ved National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen (Skottland) under indeksnummer NCIB 9475 og ved Institute of Microbiology of the Rutgers University (U.S.A.) under indeksnummer IM.3863. Den ved oppfinnelsen anvendte nye mikroorganisme ble isolert fra en jordprøve tatt i nærheten av Bari i Italia. Den oppviser følgende morfologiske, makroskopiske, mikroskop-iske og biokjemiske egenskaper.

Mikroskopisk utseende.

Det vegetative mycel som dannes på

vanlige kulturmedia består av tynne (0,5—

0,9 mikron tykke), mer eller mindre for-grenede hyfer. Forgreningene bærer tyk-kere hyfer, (1,1—1,6 mikron tykke) koni-dioforer, som ofte er forenet i bunter og har hakef ormede ender. Konidiene er rundaktige med tverrmål på 1,8—3,3 mikron og er først anordnet i kjeder og derpå frie.

Under elektronmikroskopet viser konidiene seg å være omtrent runde med u-regelmessig omriss og med vortet overflate.

Makroskopisk utseende.

I tabell 1 er oppført de iakttatte egenskaper i de i tabellen angitte kulturmedia,

hvorved man lot mikroorganismene vokse ved 28°C og iakttok dem på den tredje,

åttende, femtende, enogtyvende og tredefte dag efter utført podning.

Biokjemiske egenskaper.

Gelatin: langsom og delvis hydrolyse. Nitrater: ingen reduksjon til nitriter. Dannelse av H2S: positiv.

Melk: ingen peotonisering, ingen koagulering.

Stivelse: meget langsom og sparsom hydrolyse.

Utnyttet: maltose, xylose, mannose, mannit, glycerin, glucose, saccharose, trehalose, raffinose, fruktose.

Ikke utnyttet: laktose, adonit, ramnose, sorbit, arabinose og esculin.

Antibiotika: daunomycin fremstilt i flytende rystekulturer.

Identifisering av stammen.

Beskrivelsen av den undersøkte mikroorganisme henfører den til slekten Streptomyces Waksman et Henrici (Bergey's Ma-nual of Determinative Bacteriology, 7. Opplag, 1957, S. 744—745). Av undersøkelse av artene kan følgende sluttes: Ved klassifiseirngssystemet ifølge Prid-ham og medarbeidere (Appl. Microbiol. 6, S. 52, 1958) tilhører mikroorganismen av-delingen Retinaculum apertum, serie RED. I klassifiseringssystemet ifølge Baldacci (Giom. di Microbiol. 6, S. 10, 1958) tilhører mikroorganismen serien Albosporeus og i det Waksman'ske system (The Actinomycetes, Vol. II, 1961, side 129) tilhører mikroorganismen serien Ruber.

En sammenligning mellom egenskape-

ne av mikroorganismen og egenskapene av de arter som tilhører de angitte systema-tiske grupper (Taxa) har vist at ingen av disse har slike egenskaper som svarer til dem for den undersøkte mikroorganisme.

Data for denne sammenligning er gjengitt i tabell II såvidt angår de arter som danner substanser som ligner dem som er undersøkt av oppfinneren. I tabellen er S. cinereoruber, S. cinereoruber var. fructo-fermentans, S. caespitosus og S. antibioti-cus tatt med, skjønt de ikke hører til de ovenfor angitte grupper.

I det følgende blir derimot anført for-skjellen fra de arter som ikke danner noen substanser av den undersøkte type. Den foreliggende mikroorganisme skiller seg fra arten S. albosporeus (Waksman: The Actinomycetes, Vol. II 1961, S. 171) forsåvidt som sistnevnte resduserer nitrater, ikke danner oppløselige pigmenter og ikke danner hydrogensulfid. Den skiller seg fra arten S. cinnamomensis (Waksman: The Actinomycetes, Vol. IX 1961, S. 195—195) og fra S. fradiae (Waksman: The Actino-myces, vol II, 1961, S. 211—212) ved farvene av det vegetative mycelium og av luftmyceliet. Det skiller seg fra arten S. ruber (Waksman: The Actinomycetes, Vol. II 1961 S. 271) ved at sistnevnte bringer melk til koagulering, ikke danner oppløselige pigmenter og ikke danner hydrogensulfid.

Den skiller seg fra S. rubescens (Waksman: The Actinomycetes. Vol. II, 1961, S. 271) ved farven av luftmyceliet og ved at S. rubescens ikke danner noe oppløselig pigment og heller ikke hydrogensulfid. Den skiller seg fra S. oidiosporus (Waksman: The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 251) ved at den ikke reduserer nitrat og ikke peptoniserer melk. Dessuten danner S. oidiosporus ingen oppløselige pigmenter.

Det kan derav sluttes at den under-søkte mikroorganisme er forskjellig fra de hittil kjente arter, og den er derfor av oppfinnerne blitt betegnet med navnet Streptomyces peucetius n.sp.

Mikroorganismen Streptomyces 1762 kan oppbevares ved frysetørring, hvorved melk eller melkeserum anvendes som opp-slemningsmiddel. Man kan samle sporene og oppbevare dem på steril jord.

Dessuten kan den også oppbevares ved gjentatt dyrkning på et fast næringssubstrat som inneholder glucose eller et annet egnet sukker og nitrogenforbindelser (gjærekstrakt, pepton, kaseinhydrolysat). Næringssubstratet kan dessuten tilsettes noen salter hvorav magnesiumsulfat og kalsiumfosfat er særlig viktige. Fremstillingen av det nye antibiotikum utføres ved de vanlige i og for seg kjente metoder og består vesentlig deri at Streptomyces 1762 dyrkes i et flytende, på forhånd sterilisert næringssubstrat under aerobe betingelser ved en temperatur mellom 25 og 37°C, fortrinnsvis ved 28°C, over et tidsrom på 3 til 7 dager, fortrinnsvis 5 dager, ved en pH som til å begynne med er 6,5—7,0 og ved slutten av fermenteringen er 7,5—8,0. Næringssubstratet består av en karbon- og nitrogenkilde og anorganiske salter. Som karbonkilde kan stivelse, dekstrin, glucose, glycerin, mannit, maltose, maisstøpvæske, oppløselige destillasjonsresiduer, soyaolje og soyamel anvendes. Som nitrogenkilde kommer foruten de ovenfor nevnte nitro-genholdige substanser også tørrgjær, kjøtt-pepton og kasein på tale.

Gode resultater kan også oppnås ved

anvendelse av følgende ammoniumsalter: ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, diam-moniumfosfat.

Tilsetningen av mineralsaltene som be-gunstiger et godt gjæringsforløp, kan va-riere med det anvendte næringssubstrat. I et næringssubstrat som inneholder kom-plekse substanser som forskjellige mel og fermenteringsresiduer, har tilsetning av kalsiumkarbonat, natriumfosfat og kalium-fosfat vist seg gunstig. I et næringssubstrat som inneholder glucose og gjær eller ammoniumsalter, er tilsetninger av mineralsalter, som kalium-, magnesium-, jern-, sink-, mangan- og kobbersalter nødven-dige. Fermenteringen kan utføres i en Erlenmeyerkolbe eller i laboratoriefermen-teringsapparater.

Innholdet av antibiotikum F. I. 1762 bestemmes ved spektralfotometrisk avles-ning av vandig-alkoholiske uttrekk av ma-terialet ved pH 10 og ved en bølgelengde på 540—580 mn i sammenligning med en stan-dardprøve av F.I. 1762 med kjent innhold.

Ved isolering av antibiotikum F.I. 1762 skiller man myceliet fra kulturvæsken ved hjelp av et adsorberende kiselgur-holdig materiale, og man bearbeider såvel filterkaken som den filtrerte væske videre hver for seg.

Størstedelen av det således fremstilte antibiotikum befinner seg i filterkaken som består av en blanding av myceliet og adsorberende kiselgur-holdig materiale. Den nevnte kake rives opp i et organisk opp-løsningsmiddel, som methanol, ethanol, butanol og aceton, methylethylketon, kloroform, methylklorid eller vandige oppløs-ninger av organiske eller uorganiske syrer, som eddiksyre, saltsyre, svovelsyre, osv. Fortrinnsvis kan blandinger av organiske opp-løsningsmidler, som alkoholer og vandige ketoner med vandige oppløsningsmidler av uorganiske syrer anvendes. Ved anvendelse av blandinger av organiske oppløsnings-midler med vandige syrer nøytraliserer man uttrekkene og destillerer det organiske oppløsningsmiddel av i vakuum, hvorved man får en vandig suspensjon. Det bunnfall som faller ut under konsentreringen, filtreres fra og filtratet gjøres alkalisk til en pH-verdi mellom 8 og 9 og ekstraheres med et med vann ublandbart oppløsnings-middel, som butylalkohol, amylalkohol, kloroform, methylklorid, methylpropylke-ton, methylbutylketon, benzen, toluen og lignende. Etter ekstraheringen med organiske lavtkokende og med vann ikke blandbare oppløsningsmidler blir uttrekkene tilsatt vann og derpå blir oppløsningsmidlet avdestillert i vakuum. Derpå ekstraheres vannfasen som beskrevet ovenfor. Fra den organiske, med vann ikke blandbare opp-løsning kan den rå aktive substans utvin-nes ved konsentrering til lite volum med påfølgende utfelning med apolare oppløs-ningsmidler som ethylether, dipropylether, mettede hydrocarboner, hexan, cyclohexan, heptan eller petrolether. Den således fremstilte oppløsning inneholder også andre farvestoffer som kan ekstraheres med vandige uorganiske eller organiske baser og som man ved syring av den vandige opp-løsning får i fast tilstand.

Det er dog fordelaktig å utføre en før-ste rensning av antibiotikumet hvorved man ekstraherer den organiske oppløsning med organiske eller uorganiske, fortynnede vandige syrer, som eddiksyre, saltsyre, svovelsyre, ved en pH mellom 2 og 5 eller med pufferoppløsninger i samme pH-område. For overføring av antibiotikumet i vannfasen er det fordelaktig til den organiske fase å tilsette noen volumdeler av et der-med blandbart oppløsningsmiddel med lavere polaritet, som ether, diethylether, di-isopropylether eller hexan, cyclohexan. heptan eller petrolether. I' den organiske fase blir der tilbake forskjellige andre farvestoffer hvis natur ennu ikke er un-dersøkt.

pH-verdien av den fremstilte vannfase innstilles på en verdi mellom 8 og 9 og ekstraheres igjen med organiske oppløsnings-midler, som butylalkohol, amylalkohol, kloroform, methylklorid, benzen og toluen. fenol og kresol.

Den fremstilte ekstrakt blir så konsentrert i vakuum til et lite volum og ved tilsetning av en organisk eller uorganisk syre og et oppløsningsmiddel med lavere polaritet, som methylether, diisopropyl-ether, cyklohexan, hexan, heptan eller petrolether kan. det rå antibiotikum felles ut som salt.

En god rensning av det erholdte råprodukt kan oppnåes ved motstrømsfor-deling mellom en vandig oppløsning, som en vandig syre eller en pufferoppløsning. og et med vann ublandbart oppløsnings-middel. Også kromatografi egner seg som rensningsprosess. Antibiotikumet kan også utfelles ved behandling av de vandige opp-løsninger av dets urene salter med pikrin-syre. Pikratet av antibiotikumet faller ut som rødgule fnokker som kan samles og tørres.

Pikratet er oppløselig i lavere alkoholer og halogenerte hydrocarboner, f. eks. kloroform, og i ketoner som f. eks. aceton og methyletylketon.

Ved behandling av de organiske opp-

løsninger av pikratet med en uorganisk syre faller saltet av antibiotikumet ut.

Antibiotikum F. I. 1762 krystalliserer som hydrokloridet i fine røde nåler. Hydrokloridet er oppløselig i vann, methanol og vandige alkoholer og uoppløselig i kloroform, aceton, benzen og apolare oppløs-ningsmidler. I fullkommen tørr tilstand smelter det ved 186—187°C. Hydrokloridet har følgende elementæranalyse: C = 55,01 pst., H = 6,31 pst., N = 2,46 pst., Cl = 6,20 pst.

Dets absorpsjonsspektrum i U.V.- og i det synlige område viser bånd ved følgende bølgelengder:

/ absolutt methanol:

i kons. svovelsyre:

ved 257, 303, 545 og 585 mf(.

I LR.-spektrum (se fig. 1) er bånd

synlige ved følgende bølgelengder:

De vandige oppløsninger er gulrøde og blir fiolette i det alkaliske område. Med magnesiumacetat gir de en karmosinrød farve.

Ved hydrolyse med fortynnede mine-ralsyrer spaltes antibiotikum F. I. 1762 i to reduserende sukkere og et nøytralt aglykon. Aglykonet danner glinsende røde krystaller som smelter ved 211—213°C og inneholder bare carbon, hydrogen og oxygen. Aglykonet har følgende elementæranalyse: C = 61,75 pst., H = 4,94 pst, O = 33,31 pst.

Spektret i det U.V.- og i de synlige område viser absorpsjonsmaksima ved følgen-de bølgelengder:

/ absolutt methanol:

i kons. svovelsyre:

ved 257, 303, 545, 585 mjx (vendepunkt

ved 390 m.[ i).

i vannfri piperidin:

ved 540, 570 og 610 mjj,.

I det I.R.-spektrum (se fig. 2) legger man merke til båndene ved de følgende bølgelengder (i jx):2,90, 3,42, 5,85, 6,18, 6,33, 6,90, 7,03, 7,24, 7,35, 7,75, 8,06, 8,25, 8,94, 9,37, 9,67, 10,10, 10,59, 10,91, 11,68, 11,99, 12,35, 12,63, 13,18, 14,40.

Aglykonet av antibiotikumet er opp-løselig i methanol, ethanol og kloroform, mindre oppløselig i butanol og aceton, nes-ten uoppløselig i benzen, alifatiske estere, og ethyleter og uoppløselige i vann og petrolether. Aglykonet forekommer dessuten i det rå antibiotikum. Dets tilstedeværelse kan påvises ved papirkromatografi (frem-kaller: n-butanol mettet med vandig fos-fatpuffer ved pH 5,2). Antibiotikum 1762 viser en R.F.-verdi på 0,21, dets aglykon en R.F.-verdi på 0,85. Antibiotikum F.I. 1762 tilhører den gruppe av antibiotika hvortil også rondomycin A. B og y (H. Brockmann og medarb. Chem. Ber. 88, 1955, s. 1762, Naturwissenschaften 48 — 1961, s. 716), cynerubin (Chem. Ber. 92, 1959, s. 1868), pyrromycin (Chem. Abstrs. 54, 1960, s. 1470) og rutilantin (Tetrahedron Letters 16, 1959, s. 17) hører. Antibiotikum F.I. 1762 skiller seg fra de ovennevnte produkter ved sine kjemisk-fysikalske egenskaper, særlig ved sitt I.R.- og U.V.-spektrum, og i sitt kroma-tografiske forholdende.

Saltene av antibiotikum F.I. 1762 av-ledes av organiske og uorganiske, ikke gif-tige syrer, som saltsyre, svovelsyre, eddiksyre, propionsyre, valeriansyre, palmitin-syre, oljesyre, sitronsyre, mandelsyre, glut-aminsyre og pantotensyre. De nøytrale salter dannes ved omsetning av den tilsvarende syre med den fri base som på sin side fåes ved alkalisering av en vandig oppløs-ning av hydrokloridet til pH 8,6, og derpå følgende ekstraksjon med vannublandbare organiske oppløsningsmidler, som butanol og kloroform. Ved avdestillasjon av det organiske oppløsningsmiddel får man antibiotikumet som den fri base, som smelter ved 208—209°C. Fremstillingen av saltene kan også utføres ved dobbeltomsetning av saltene: f. eks. får man ved omsetning av F.I. 1762-sulfat med kalsiumpantotenat av F.I. 1762. Foruten sin bemerkelsesverdige bakteriostatiske virkning mot tallrike mik-roorganismer, har antibiotikum F.I. 1762 særlig vist seg nyttig som tumorhemmende middel.

Det antibiotiske daunomycins spekt-rum omfatter Gram + og Gram -4- bakte-rier, sopper og protozoer som angitt neden-for:

Det oppviser en bemerkelsesverdig hemmende virkning mot veksten av asoi-tiske former av svulster, hvor en umiddel-bar kontakt mellom antibiotikumet og de neoplastiske celler foreligger. God hemmende virkning er også påvist ved de faste svulster, hvorved virkningen er betinget av administrasjonsmåten, idet de beste resultater fåes ved intravenøs administrasjon i doser mellom 2 og 3 mg/kg/dag.

I følgende tabell er den akutte giftig-het av daunomycin gjengitt som LD,0:

Akutt toksisitet — LD50-verdi (mg/kg)

Antibiotikum F.I. 1762 og dets salter, hydrolytiske avbygningsprodukter derav og blandinger av disse, kan anvendes som legemidler. Disse inneholder de virksomme forbindelser i blanding med gunstige far-masøytiske fyllmidler, som er egnet for oral, parenteral eller lokal anvendelse.

Følgende eksempler tjener til å belyse oppfinnelsen.

Eksempel 1.

To 300 ml Erlenmeyer-kolber inneholdt hver 60 ml av følgende vegetative næringssubstrat:

Sterilisasjon i 20 minutter ved 120°C. Etter sterilisasjonen lå pH på 7,2.

Hver kolbe ble podet med y5 av en suspensjon i sterilt vann og myceliet av en 10 dager kultur av Streptomyces 1762, som var dyrket i reagensglass på følgende næringssubstrat:

Man inkuberer dem i 48 timer ved 28 °C på et rysteapparat med 220 omdr./min og en eksentrisitet på 60 mm.

2 ml av en slik inkubert vegetativ kultur tjener til podning av 300 ml Erlen-meyerkolber, som hver inneholder 60 ml av følgende produktive næringssubstrat:

Sterilisering i 20 minutter ved 120°C. Glucosen ble sterilisert for seg i 20 minutter ved 110°C. Det ble inkubert ved 28°C og en omrøringshastighet på 220 omdr./ min. Etter 120 timers fermentering fikk man det høyeste innhold av F.I. 1762 (60 (ig/ml).

Eksempel 2.

Man gikk frem som i eksempel 1 med den forskjell at podningskulturen ble ut-viklet på følgende faste næringssubstrat: 200 g skrellede poteter ble kokt i 20 minutter i 500 ml vann, volumet av potetgrøten ble innstilt på sin opprinnelige verdi og filtrert gjennom gas. Der ble tilsatt 2 pst. glucose, 0,1 pst. gjærekstrakt og 2 pst. agar og volumet ble innstilt på 1000 ml. Det ble derpå sterilisert i 20 minutter ved 120°C. pH-verdien lå ved 6,8—7. Den høyeste produksjon (70 (xg/ml) ble nådd etter 140

timer.

Eksempel 3.

Der ble arbeidet som i eksempel 2 med den forskjell at de vegetative og produktive næringssubstrater hadde følgende sammensetning:

Vegetativt næringssubstrat:

Etter 20 minutters sterilisering ved 120°C var pH-verdien 7.

Prdouktiv næringssubstrat:

Etter sterilisering på vanlig vis lå pH

ved 7.

Det høyeste innhold av F.I. 1762 (65 ug/ml) ble nådd etter 130 timer.

Eksempel 4.

Med en kultur av Streptomyces 1762 på et fast næringssubstrat, som beskrevet i eksempel 2, podet man 500 ml av det i eksempel 1 beskrevne vegetative flytende næringssubstrat, som anbragt i en 2000 ml glasskolbe.

Det ble inkubert i 48 timer ved 28°C på et rysteapparat med 120 omdr./min og en eksentrisitet på 70 mm. 120 ml av den således dannede kulturvæske tjente til podning av 3000 ml av det samme flytende næringssubstrat som var anbragt i et 5 liters fermenteringskar av nøytralglass. Dette fermenteringskar var. forsynt med en skruerører, et luftfordelingsrør som endte under røreren, en bølgebryter, podnings-rør, åpninger for utslipning av luft, anord-ning for kontroll av temperaturen, såvel som et apparat for trinnvis og kontinuerlig tilsetning under sterile betingelser. Utvik-lingen foregikk ved 28°C med en lufttilfør-sel på 3 liter pr. minutt og ved en rørehas-tighet på 400 omdr./min.

Etter 2 4timer ble 300 ml av den således utviklede kulturvæske anvendt til podning av 6 liter av det produktive næringssubstrat hvis sammensetning er beskrevet i eksempel 1 og som var anbragt i et 10 liters fermenteringskar av nøytralglass. Under fermenteringen som ble utført ved en rørehastighet på 330 omdr./min og med en lufttilførsel på 5 liter pr. minutt, ble skumdannelsen kontrollert ved tilsetning av små mengder silikonholdig skumdem-pende middel. Den etter 150 timers fermentering oppnådde høyeste produksjon tilsvarte en konsentrasjon av 60 ^g/ml av F.I. 1762.

Eksempel 5.

Fremgangsmåten adskilte seg fra den i eksempel 4 ved at det produktive næringssubstrat ble podet med 600 ml av den vegetative kultur i stedet for med 300 ml.

Det høyeste innhold av F.I. 1762 ble nådd etter 140 timer (70 (.ig/ml).

Eksempel 6.

50 liter av en kulturvæske fremstilt som i eksempel 4, ble filtrert fra myceliet ved hjelp av et kiselgur-holdig absorpsjons-middel, hvorved man fikk en filterkake og et filtrat som ble ekstrahert hver for seg. Filterkaken ble oppslemmet i aceton-0,4n vandig svovelsyre og omrørt i 2 timer. Opp-slemningen ble filtrert og man gjentok operasjonen med filterkaken to ganger til. Den fremstilte ekstrakt ble nøytralisert og acetonet avdampet i vakuum. Den dannede suspensjon ble så filtrert og den dannede faste masse ble flere ganger rystet med syret vann ved en pH på 3 og igjen filtrert. Filtratet ble innstilt på pH 8,6 og ekstrahert fullstendig med n-butanol. De forenede butanolekstrakter ble konsentrert i vakuum til lite volum. Denne oppløsning ble tilsatt 2 volumdeler ethylether og ekstrahert med 0,1 n saltsyre. Operasjonen ble gjentatt flere ganger inntil den sure vandige fase antok en rødgul farve. De forenede vannekstrakter ble innstilt på pH

8,6 og ekstrahert tre ganger med kloroform. De forenede kloroformuttrekk ble tørret over vannfritt natriumsulfat, tilsatt noen dråper methanolisk vannfritt hydrogenklorid inntil oppløsningen ble klar og derpå konsentrert til lite volum. Under konsentreringen falt røde, nålformige krystaller av produktet ut, som ble frafiltrert. Ved analyse viste det således utvunne produkt (0,3 g) seg å være hydrokloridet av antibiotikumet. Etter konsentrasjon av mor-luten ble denne tilsatt ethylether, hvorved man fikk nok 0,13 g rått F.I. 1762.

Ovennevnte filtrat ble innstilt på pH 8,6 og ekstrahert med n-butanol. Denne ekstraksjon ble gjennomført to ganger. De forenede organiske ekstrakter som ble konsentrert til lite volum og tilsatt 2 volumdeler ethylether, ble igjen ekstrahert med 0,1 n saltsyre. De forenede vandige uttrekk "ole innstilt på pH 8,6 og ekstrahert tre ganger med kloroform. Kloroformoppløs-ningen ble tørret over vannfritt natriumsulfat og tilsatt noen dråper methanolisk, vannfritt hydrogenklorid og konsentrert til lite volum. Fra den konsentrerte oppløs-ning ble ved tilsetning av ethylether 0,35 g F. I. 1762 utfelt i form av det rå hydroklorid som samtidig inneholdt aglykonet. Ved anvendelse av svovelsyre i methanol i stedet for hydrogenklorid fikk man antibiotikum F. I. 1762 som sulfat.

Eksempel 7.

45 liter av en kulturvæske, fremstilt ifølge eksempel 4, ble frafiltrert fra myceliet ved hjelp av vanlig adsorberende kiselgur-holdige materialer. Filterkaken ble oppslemmet i n-butanol, ekstrahert tre ganger med dette oppløsningsmiddel og derpå kastet. Uttrekkene ble konsentrert i vakuum til lite volum, tilsatt 3 volumdeler ether og ekstrahert flere ganger med 5 pst.-ig vandig eddiksyre. Vannuttrekkene

ble innstilt på pH 8,6 og derpå ekstrahert med kloroform. Kloroformuttrekket ble tørret over natriumsulfat og konsentrert i vakuum til lite volum, hvorpå noen dråper vannfri methanolisk hydroklorid ble tilsatt og det ble felt med ether. Den erholdte faste masse besto av rått hydroklorid av antibiotikum F.I. 1762. Ved anvendelse av svovelsyre i stedet for saltsyre fikk man det tilsvarende sulfat.

Kloroform-ether-oppløsningen inneholdt fremdeles mange farvestoffer som

kan ekstraheres med ln natronlut, og hvis natur hittil ikke har vært undersøkt.'

Eksempel 8.

Til 12 liter av en kulturvæske fremstilt ifølge eksempel 4, ble tilsatt de vanlige adsorberende kiselgurholdige materialer og det hele filtrert. Filterkaken ble omrørt tre ganger, hver gang med 3 liter av en opp-løsning av aceton/0,5 n saltsyre (forhold: 3 deler aceton og 2 deler syre). Det ble derpå nøytralisert og acetonet avdestillert i vakuum. Den resulterende vandige opp-løsning ble filtrert, pH ble innstilt på 8,6 og ekstrahert tilstrekkelig med butanol inntil butanolen ble farvet rød. Ekstrakten ble konsentrert i vakuum til lite volum, tilsatt 1 volumdel petrolether og ekstrahert med 0,1 n saltsyre.

De forenede vannuttrekk ble innstilt på pH 8,6 og ekstrahert igjen med kloroform inntil denne ble rødfarvet. De forenede kloroformuttrekk ble tørret over vannfritt natriumsulfat og konsentrert til lite volum. Der ble tilsat noen dråper methanolisk vannfri hydroklorid og råproduktet ble utfelt med ethylether. Man fikk 1,2 g rått hydrogenklorid av F.I. 1762. Ved anvendelse av svovelsyre i stedet for saltsyre fikk man det tilsvarende sulfat.

Eksempel 9.

1 gram rått F.I. 1762 ble underkastet motstrømsfordeling i et Craig-apparat med 40 rør idet der ble anvendt oppløsnings-middelsystemet n-butanol/fosfatpuffer ved pH 5,2.

Hvert rør ble fylt med 25 ml pr. fase. Etter det nødvendige antall overføringer bestemte man ved spektrofotometrisk un-dersøkelse av innholdet i de forskjellige rør ved 500 va.[ i, to grupper som hadde et høyt innhold av substans: den ene tilsvarte rørene 7—21 og den annen rørene 32—39. De mellomliggende rør viste likeså tilstedeværelse av farvestoffer og ble satt til side. Innholdet av rørene 7—21 ble forenet, den organiske fase fraskilt og vannfasen inn-tsilt på pH 8,5 med 1 n natronlut. Vannfasen ble så ekstrahert to ganger med n-butanol, de organiske uttrekk ble forenet og konsentrert til lite volum under ned-satt trykk, hvoretter 3 volum ether ble tilsatt og oppløsningen ble ekstrahert med fortynnet saltsyre i små porsjoner inntil fasen ble farvet. Vannfasen ble så innstilt på pH 8,6 og ekstrahert med kloroform. Kloroformuttrekket ble tørret og tilsatt noen dråper vannfri, methanolisk hydrogenklorid inntil oppløsningen ble klar, og ble derpå konsentrert i vakuum ved lavere temperatur (under 35°C). Ved konsentra-sjonen talt produktet F.I. 1762 ut som hydrokloridet i krystallinsk form. Utbyt-tet var 0,125 g. Ved anvendelse av svovelsyre i stedet lor saltsyre fikk man det tilsvarende sulfat. Farvestoffet i rørene 32— 39 viste seg ved papirkromatografi å være aglykonet av F.I. 1762. Ved forening av de øvre faser, tilsetning av samme volum ether og ekstraksjon med 1 n natronlut iakttok man et farveomslag fra rødt til blå-fiolett og fikk samtidig overgang av farvestoffet i den vandige oppløsning. Ekstraheringen med natronlut ble utført to ganger. De alkaliske uttrekk ble syret med saltsyre hvorved et rødt produkt falt ut som, etter omkrystallisering av n-butanol, vea kromatografisk analyse, ved spektrofotometrisk analyse i U.V., i det synlige område og i I.R. og ifølge smeltepunktet viste seg å være aglykonet av antibiotikum F.I. 1762.

Eksempel 10.

2 g av det råprodukt som inneholdt 10 pst. av antibiotikum F.I. 1762 og dettes aglykon (bestemt på grunnlag av intensi-teten av adsorpsjonsmaksima i det synlige område), ble oppløst i 150 ml vann og innstilt på en nøytral pH. Det uoppløselige ble frafiltrert og den vandige oppløsning ble ekstrahert flere ganger med ether. Ether-ekstraktene ble forenet og konsentrert i vakuum til lite volum. Man fikk 20 mg av en fast rød masse som ved papirkromatografi viste seg å være aglykonet til antibiotikum F.I. 1762. Vannfasen ble tilsatt 40 ml vandig mettet pikrinsyreoppløsning. Det falt ut et rødgult bunnfall som ble fra-sentrifugert. Den faste masse ble tørret over vannfritt kalsiumklorid og igjen opp-løst i aceton, hvorpå noen dråper vannfri saltsyre i aceton ble tilsatt, hvorved et bunnfall av et rødoransje produkt straks falt ut. Den faste masse (120 mg) ble sam-let og tørret. Ved omkrystallisasjon fra n-propanol fikk man 30 mg av et krystallinsk nålformig produkt som. viste seg å være hydrokloridet av antibiotikum F.I. 1762.

Eksempel 11.

Ved omsetning av sulfatet av antibiotikum F.I. 1762 med en oppløsning av kalsiumpantotenat fikk man ved"dén dobbelte omsetning pantotenatet av antibiotikum F.I. 1762.

Eksempel 12.

50 mg av hydrokloridet av F.I. 1762 ble løst i 10 ml svovelsyre og holdt ved 100°C i 20 minutter. Røde fnokker skiltes ut. Etter avkjøling ble der ekstrahert med n-butanol, hvorved farvestoffet gikk over i den organiske fase. Den vandige fase ble nøytrali-sert med bariumhydroxyd, filtrert og inndampet i vakuum. Residuet inneholdt minst to reduserende sukkere, som ved papirkromatografi med oppløsningsmidlet n-butanol/eddiksyre/vann (4:1:5) (øvre fase) hadde følgende R-f-verdier: 0,245 og 0,30. De rødfarvede butanoluttrekk ble vas-ket med vann og inndampet til lite volum i vakuum. Etter avkjøling og henstand falt der ut glinsende røde nålformige krystaller av antibiotikumaglykonet. Smelte-punkt: 211—213°C.

Ved papirkromatografi med et oppløs-ningsmiddel som består av petrolether mettet med methanol, viste aglykonet av F.I. 1762 en Rf-verdi på 0,41.

Farmakologi.

Undersøkelse av den tumorhemmende virkning av antibiotikum F. I. 1762.

Undersøkelsen av den tumorhemmende virkning av antibiotikum F.I. 1762 ble ut-ført ved hjelp av et tumor-«spektrum» av faste og ascites-former på mus og rotter.

1) Ascites- tumorer.

Virkningen ble undersøkt ved innpodning på mus av Ehrlich's Ascites-Carcinom og ved innpodning på rotter av Hepatom A H 130 og Oberling-Guérin Myelom.

a) Ehrlich' s Ascites- Carcinom.

Mus ble innpodet i.p. med en tumorcellesuspensjon. Samtidig ble der begynt med tilførsel av forskjellige konsentrasjo-ner av antibiotikumet daglig i løpet av 5 dager.

Tabell III gjengir resultatene. Det fremgår at det undersøkte antibiotikum i doseringsområdet fra 1,25—1,75 mg/kg/ dag utøver en bemerkelsesverdig hemmende innflytelse på vekten av Ascites-tumorer og dessuten forlenger overlevelsestiden av de behandlede dyr.

I en annen undersøkelsesrekke ble resultatene med 1,75 mg/kg/dag i løpet av 4 dager bekreftet (tabell IV).

b) Hepatom A H 130.

Wistar-rotter som var innpodet med

Ascites-Hepatom A H 130 ble behandlet daglig på fem etter hverandre følgende dager med antibiotikumet i doser på 2 og 1 mg/kg/dag.

Den gjennomsnittlige overlevelsestid på ubehandlede kontrolldyr var 11,8 dager, de behandlede dyr derimot levet ennu alle på den 50. dag av forsøket. Ingen av disse dyr viste tegn på en tumor.

c) Ascites- Myelom.

Til forsøket ble Wistar-rotter infisert

i.p. med en tumorcellesuspensjon og behandlet etter følgende skjema: Den første gruppe fikk 2 mg/kg/dag tre ganger med 2 dagers mellomrom.

Den annen gruppe ble behandlet daglig i fem på hverandre følgende dager med 1 mg/kg/dag.

Som resultat fant man en sinkning av tumorveksten og en forlengelse av den gjennomsnittlige overlevelsestid sammen-lignet med kontrollen (tabell V).

2) Faste tumorer.

Virkningen på faste tumorer ble un-dersøkt på mus innpodet med Ehrlich's Adenocarcinom og med Sarkom 180 og rotter innpodet med Walker's og med Oberling-Guérin-Guérin's Myelom.

a) EhrlicWs Adenocarcinom.

Mus som hadde en transplantert tumor

ble fra 1. dag etter transplanteringen, daglig behandlet i 6 dager med en oppløsning

av antibiotikum. På den 8. forsøksdag ble dyrene drept, tumorene fjernet, tørret og deretter veiet. Resultatene fremgår av tabell VI.

Det ble fastslått at antibiotikumet ved en dose på 6 mg/kg/dag oppviste en hemning av tumorveksten på 41,1 pst.

b) Sarkom 180.

Noen mus som hadde innpodet et stykke av det neoplastiske vev ble fra en dag etter innpodningen i syv på hverandre følgende dager behandlet intraperitonalt.

Antibiotikumet ble gitt i doser på 2 mg/kg/dag. På den 10. forsøksdag ble mu-sene drept og tumoren og milten tatt ut.

Resultatene i tabell VII viser at også ved denne forsøksanordning hadde behandlingen med antibiotikumet bevirket en bemerkelsesverdig hemning av tumorveksten og en betraktelig reduksjon av volumet av milten.

c) Walker' s Carcinosarkom.

De med denne tumor innpodede rotter

ble behandlet intravenøst åtte ganger i lø-

pet av 10 dager. På den 11. forsøksdag ble de overlevende, dyr drept og tumorene tatt ut. Resultatene er sammenfattet i tabell

VIII.

Også på denne tumorart hadde antibiotikumet utøvet en bemerkelsesverdig hemmende virkning, særlig i en dose på 2 mg/kg/dag, som innført intravenøst ble tålt godt. En annen undersøkelse ble ut-ført med rotter infisert med den samme tumor for å bestemme virkningen av antibiotikumet på de overlevende dyr.

Ved denne forsøksrekke ble rottene

behandlet åtte ganger intravenøst i løpet av 12 dager med 3 mg/kg/dag.

De i tabell IX gjengitte resultater be-krefter den hemmende virkning av antibiotikumet på veksten av tumoren og viser at den gjennomsnittlige overlevelsestid for rottene ved denne behandling er steget med 50,8 pst.

Nedsettelsen av tumorveksten er betraktelig under behandlingen og vedvarer også inntil den 20. dag etter avslutningen av behandlingen.

d) Oberling- Guérin- Guérin' s Myelom. Rotter som var innpodet med et stykke av tumorvevet, ble fra dagen etter innpodningen daglig i 10 dager behandlet intravenøst. På den 13. forsøksdag ble de overlevende dyr drept, tumoren ble uttatt og veiet. Resultatene ble bekreftet i et annet forsøk hvori dyrene ble behandlet intra-venøst syv ganger i løpet av 14 dager med en oppløsning av antibiotikumet (2,5 mg/ kg/dag).

Det fremgår av tabell X og XI at det

undersøkte antibiotikum også er virksomme mot denne tumortype, idet doser på 2

mg og 2,5 mg/kg/dag gitt intravenøst har

vist de beste resultater med henblikk på

såvel antitumoral virkning som at antibiotikumet tåles.

Claims (1)

1. Fremgansgmåte ved fremstilling av et

   nytt antibiotikum, daunomycin, såvel som dettes aglykon og salter av disse, karakterisert ved at Streptomyces peucetius som ved Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey (England) har fått indeksnummer I.M.I. 101.335 og ved National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen (Skottland) har fått indeksnummer NCIB 9475 og ved Institute of Microbiology of the Rutgers University (U.S.A.) har fått indeksnummer IM 3868, dyrkes under aerobe betingelser i et flytende, omrørt næringssubstrat, som inneholder en karbonkilde, en nitrogenkilde og mineralsalter, i et temperaturområde mellom ca. 25 og 37°C, fortrinnsvis ved 28°C, i et tidsrom på ca. 3—7 dager, fortrinnsvis 5 dager, og at det dannede nye antibiotikum på i og for seg kjent vis isoleres og renses og eventuelt overføres i sine salter med uorganiske eller organiske syrer eller i sitt aglykon ved syrehydrolyse.