KR840000934B1 - 항생물질 sf-2080a 및 sf-2080b의 제조방법 - Google Patents

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항생물질 SF-2080A 및 SF-2080B의 제조방법

제1도는 10mcg/ml 농도로 (Ⅰ)메탄올, (Ⅱ)산성메탄올(0.01N Hcl 메탄올 용액) 및 (Ⅲ)알카리성 메탄올(0.01N NaoH 메탄올 용액)중에, 측정한 항생물질 SF-2080A의 자외선 흡수 스펙트럼.

제2도는 KBr 정제법으로 측정한 항생물질 SF-2080A의 적외선 흡수 스펙트럼.

제3도는 10mcg/ml 농도로 (Ⅰ)메탄올, (Ⅱ)산성 메탄올(0.01N HCl 메탄올 용액) 및 (Ⅲ)알카리성 메탄올 (0.01N NaoH 메탄올 용액)중에서 측정한 항생물질 SF-2080B의 자외선 흡수 스펙트럼.

제4도는 KBr 정제법으로 측정한 항생물질 SF-2080B의 적외선 흡수 스펙트럼.

본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 SF-2080 물질-생성균주를 영양배지중에서 배양하고, 생성된 SF-2080물질을 배지로부터 회수함을 특징으로 하는 신규 항생물질 SF-2080A 및 SF-2080B의 제조방법에 관한 것이다.

스트렙토마이세스속등에 속하는 여러 미생물종을 탄소 및 질소동화원을 함유하는 영양 배지중에서 배양하면 항생물질을 생성할 수 있다는 사실은 이미 알려져 있다. 그러나 끊임없이, 보다 새롭고 유용한 항생물질이 요구되고 있다.

본 발명에서 사용되는 항생물질 SF-2080 생성군주로는(본 명세서에서 사용된 용어 "항생물질 SF-2080"은 SF-2080A 물질과 SF-2080B 물질을 모두 포함한다), 발효육즙으로부터 회수하기에 충분한 양의 항생물질 SF-2080을 생성할 수 있는 군주면 어느 것이나 사용할 수 있다. 이러한 군주의 예로는 일본국, 나가노-도, 나가노시의 기꾸마강 하상에서 채취한 토양샘플로부터 분리된 스트렙토마이세스종 SF-2080이 있다.

스트렙토마이세스종 SF-2080의 특징은 다음과 같다.

(Ⅰ) 형태학적 특징 :

기질균사체는 다수의 분지를 형성하며 파상으로 뻗는다. 균사의 직경은 0.5 내지 0.6마이크론이다. 일반적으로, 한천 배지 또는 액체배지중에서는 기질 균사체 분절증식은 관찰되지 않는다. 통상 사용되는 한천 배지상에서는 기중균사체가 전혀 생성되지 않는다. 포자, 포자낭, 유주자, 균핵, 분생자병속등은 아직 발견되지 않았다.

(Ⅱ) 배양 특징 :

스트렙토마이세스종 SF-2080의 배양특징은 이, 비, 쉬링과 디. 고트리브의 방법[E.B.shirling & D.Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 16,pp313-340(1966)]에 따라 관찰한다. 28℃에서 14일간 배양한 후 관찰을 행한다. 여러가지 배지에 대한 배양 특징은 표 1에 기재하였다.

[표 1]

(Ⅲ) 생리적 특징 :

(1) 성장온도 범위 : 효모맥아 한천상에서는 15 내지 45℃에서 성장하며, 25 내지 34℃에서 성장이 잘된다.

(2) 젤라틴 액화 : 약성(20℃에서 21일간 배양)

(3) 전분의 가수분해 : 양성(약함, 28℃에서 14일간 배양)

(4) 탈지유에 대한 작용 : 28℃에서 14일간 배양하면 펩톤화나 응고가 일어나지 않는다.

(5) 질산염의 환원 : 양성(28℃에서 14일간 배양)

(6) 내염성 : 1.5%에서는 성장하나, 3.0%에서는 성장하지 않는다.

(7) 멜라닌-양 색소의 생성 : 음성

(Ⅳ) 탄소원의 이용 :

효모 추출물(Difco) 0.5%, 탄산칼슘 0.1% 및 한천(Difco) 1.5%로 구성된 기본 배지를 사용하여 탄소원의 이용에 대한 실험을 행한다. 결과는 다음 표 2와 같다.

[표 2]

(Ⅴ) 세포벽의 조성

베커등의 분석방법[Becker, et al., Appl. Microbiol., Vol. 13, p236 (1965)]에 따라 세포벽 성분으로 함유되어 있는 LL-형태의 디아미노 피멜산을 확인한다.

상기 특성으로 볼때, 스트렙토마이세스종 SF-2080은 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목에 속하며 기질 균사체가 분절증식되지 않는 증온성균으로 방선균이고, 세포벽내에 LL-디아미노피 멜산을 함유한다.

그러나, 악티노마이세레스 속의 결정화에 필요한 포자, 포자낭, 유주자, 균핵 및 분생자병속과 같은 형태학적 특징이 아직 명백하게 밝혀지지 않았기 때문에 현재까지 SF-2080 균주가 속하는 균속을 완전히 결정할 수는 없다. 그러나 SF-2080균주가 세포벽중에 LL-디아미노피멜산을 함유하는 점을 고려한다면, SF-2080 균주는 스트렙토 마이세스속에 속하는 미확인 종일 가능성이 크며, 따라서 임시로 스트렙토마이세스종 SF-2080이라 칭한다.

이 균주는 스트렙토마이세스종 SF-2080으로써, Fermentaion Researeh Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Intrnational Trade and Industry of Japan에 기탁번호 FERM-p 5072로 기탁되었고(1979년 7월 4일), American Type Cultute Collection (ATCC)에는 기탁번호 ATCC 31672으로 기탁되었다(1980년 7월 28일).

SF-2080 균주는 다른 악티노마이세테스균주와 마찬가지로 그 특성이 쉽게 변화될 수 있다. 이러한 변화는 예를들어 자외선, X-선, 고주파 또는 방사선등의 조사 및 화학물질에 의한 인위적으로 야기시킬 수 있다. 그러므로 돌연 변이주는 물론 모든 변형균주는, 이들이 SF-2080A 물질 및/또는 SF-2080B 물질을 생성할 수 있다면 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 상술한 균주를 공지의 미생물에 의해 동화될 수 있는 영양소를 함유하는 배지중에서 배양한다. 이러한 영양소로는 악티노마이세테스 균주의 배양에 편리하게 사용되는 공지물질을 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원의 예로는 글루코즈, 글리세린, 슈크로즈, 전분, 덱스트린, 말토즈 시럽, 당밀, 대두유 등이 포함된다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는 콩가루, 밀배아, 면실박, 육즙, 펩톤, 효모 추출물, 건조효모, 옥수수침지액, 황산암모늄, 질산나트륨등이 포함된다. 또한 경우에 따라 탄산칼슘, 염화나트륨, 염화코발트, 인산염등과 같은 무기염뿐 아니라 미생물에 의한 항생물질 SF-2080의 생성을 증가시키는 유기및 무기물질을 적절히 첨가할 수도 있다.

항생물질 SF-2080생성 균주의 배양에는 대부분의 공지 항생물질 제조의 경우와 마찬가지로 액침 배양법이 가장 적합하다. 배양에 적합한 온도범위는 25 내지 34℃이며, 바람직하게는 28 내지 32℃에서 수행한다. SF-2080 물질의 생성은 진탕 배양 및 탱크배양에서 모두 2 내지 7일내에 최대로 되며, SF-2080 물질은 배양액중에 축적된다.

항생물질 SF-2080은 시험균주로 사르시나루테아(Sarcina lutea)를 사용하는 생물학적 검정법과 실리카 겔을 사용한 박층 크로마토그라피에 의해 확인한다.

SF-2080A 물질과 SF-2080B 물질은 각각 후술하는 바와같은 물리적 및 화학적 특성을 갖는다. 이러한 특성에 따라 각 항생물질을 추출및 정제할 수 있다.

다음과 같은 방법이 효율적으로 사용될 수 있다.

목적하는 항생물질을 함유하는 배양액으로부터 고체물질(즉, 균사체)을 여과제거하여 얻은 여액에 에틸 아세테이트와 같이 물과 쉽게 혼화되지 않은 유기용매를 가한다. 그후, 이들을 혼합하여 목적하는 물질을 추출한다. 반면에, 고체물질(즉, 균사체)에는 아세톤, 메탄올등과 같이 물과 쉽게 혼화하는 유기용매를 가하여 그들로부터 목적하는 물질을 추출한다. 유기용매를 증발시킨 후에 에틸아세테이트 등과 같은 유기용매로 목적하는 물질을 추출한다. 여액과 고체 물질(균사체)로부터의 추출물을 합하고 용매를 증발시켜 오일상 물질을 수득한다. 오일상 물질에 n-헥산등과 같이 용매를 가하여 불순물을 추출한다. 이렇게 하여 수득된 잔사를 메탄올등에 용해시키고 생성되너 용액을 담체로 실리카겔, 알루미나, 분자체용 겔여과 매질 등을 사용하여 칼럼크로마토그라피시켜 항생물질 SF-2080A 및/또는 SF-2080B를 분리한다. 이렇게 해서 분리된 SF-2080A 물질 및/또는 SF-2080B 물질은 소량의 메탄올에 용해시킨 후, 결정화하여 상응하는 결정을 수득한다. SF-2080A 물질 및/또는 SF-2080B 물질의 결정을 여러가지 용매계를 사용하는 박층 크로마토그라피로 분석하면, 단일 스포트를 나타낸다. 이것은 이들이 각각 순수한 생성물임을 나타내는 것이다.

상술한 방법에 따라 수득된 SF-2080A 물질및 SF-2080B 물질 각각의 물리적 및 화학적 성질은 다음과 같다.

[표 3]

한천희석법으로 측정한, 여러가지 미생물에 대한 SF-2080A 물질과 SF-2080B 물질의 최소 억제농도는 다음 표 4에 기재하였다. SF-2080A 물질은 일반적으로, 시험된 모든 세균균주에 대하여 유효하였으나, SF-2080B 물질은 한정된 종류의 균주에 대하여만 매우 효과가 높고 다른 균주에 대하여는 활성이 적거나 효과가 없다.

SF-2080A 물질과 SF-2080B 물질 각각의 급성독성은 생쥐에게 복강내투여하여 측정한다. SF-2080A 물질을 30mg/kg의 용량으로 투여하면 생쥐가 모두 사망하였으며 10mg/kg의 용량으로 투여하면 생쥐가 모두 가생존하였다. 한편 SF-2080B 물질은 100mg/kg의 용량에서 생쥐들의 2/3가 생존하였다. 그러므로 SF-2080A 물질및 SF-2080B 물질은 약제, 농약, 수의약, 소독약등으로 유효하며 또는 이러한 약품으로 전환될 수 있는 물질로서 유효하다.

[표 4]

또한, SF-2080A 물질은 항균활성을 나타낼 뿐아니라 진균의 생장을 억제한다. 평판희석법에 따른 각 시험균주에 대한 최소생장억제농도(MIC)는 다음과 같다.

[표 5]

표 5의 결과로 SF-2080A 물질이 항진균제로 또한 유용함을 알수 있다.

SF-2080A 물질은 예를들면 연고제나 액제로 감염부위에 피복하여 사용할 수 있다. 피부침투제를 첨가하여 제조된 액체 제제의 예로는 다음과 같은 것이 있다.

[표 6]

표 6에 기재된 조성을 갖는 액체 제제를 사용하여, 등이 트리코파이톤 아스테로이데스(Trichophyton asteroides) 균주에 의해 감염된 기니아피크의 감염 처리 시험을 수행한다. 이 시험에서 대조용 약제로 피롤니트린과 클로트리마졸을 사용하여 비교한 결과, 본 발명의 SF-2080A 물질이 육안검사 및 양성 배양율에 대한 시험(초기 감염되어 치료된 부분에 대한 배양시험을 하며, 여기에서는 감염 미생물의 현저한 감소를 관찰한다)에서 모두 탁월한 치료학적 효과를 나타냄을 알 수 있다.

SF-2080A 물질과 SF-2080B 물질의 물리적 및 화학적 성질과 생물학적 특징을 공지의 항생물질과 비교한 결과, 이들이 각각 신규한 항생 물질임을 알게 되었다.

다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않은 여러가지 변형 및 변화가 수행될 수 있다.

[실시예 1]

용성 전분 1 중량%, 글루코즈 1중량%, 펩톤 0.5중량%, 효모 추출물 0.3중량%, 콩가루 0.2중량%, 육즙 0.2중량% 및 탄산칼슘 0.1중량%로 이루어진 조성의 액체 배지를 제조한다. 그후, 이렇게 해서 제조된 액체 배지 20ml씩을 각각 100ml 삼각플라스크에 넣고 멸균시킨다. 액체 배지에 스트렙토마이세스종 SF-2080(FERM-p 5072, ATCC 31673)을 접종하고 28℃에서 5일 동안 진탕기 상에서 배양하여 1차종 배양물을 제조한다. 상기와 같은 공정을 용량을 서서히 증가시켜 반복 수행하여 2차종 배양물(즉, 1차종 배양물을 500ml 삼각 플라스크에 넣은 액체배치 80ml에 접종하고 28℃에서 2일동안 배양하여 2차 배양물을 제조한다) 및 3차종 배양물(즉, 2차종 배양물을 5l 삼각 플라스크에 넣은 액체배지 800ml에 접종하고 28℃에서 2일동안 배양하여 3차종 배양물을 제조한다)을 수득한다.

그후, 말토즈 시럽 2중량%, 대두유 0.15중량%, 콩가루 1중량%, 알콜박즙 0.25중량%, 포르마메디아(Fomamedia : 상품명, 텍사스의 Traders oil Mill Co. 제품) 0.5중량%, 황산제일철 0.0005중량%, 염화 닉켈 0.00005중량%, 염화코발트 0.00005중량% 및 탄산칼슘 0.1중량%로 이루어진 조성의 배지 35l를 50l스테인레스스틸 발효 탱크에 넣고 멸균한 후, 3차 종배양물 800ml로 접종한다. 배양은 통기및 교반하면서 28℃에서 수행한다. 통기량 및 회전수는 각각 35l/분 및 300rpm이다.

120시간 후, 배양을 중지시키고 배양물을 여과하여 고체 분획과 여액으로 분리한다. 여액 25l에 에틸아세테이트 20l를 가하고 교반하여 유효성분을 추출한다. 그후, 에틸아세테이트층을 분리한다. 한편, 고체 분획에는 50% 아세톤 수용액 10l를 가하고 교반하여 유효성분을 추출한다. 그후, 고체 성분은 여과 제거한다. 여액을 감압하에서 농축시켜 아세톤을 증발시킨 다음, 에틸아세테이트 2.5l를 가하고 교반하여 유효성분을 추출한다. 그후, 에틸아세테이트층을 분리하여 처음 여액으로부터의 에틸 아세테이트 추출층과 합한다. 생성된 혼합물을 감압하에서 농축시켜 타르상 물질 약 30ml를 수득한다.

상기에서 수득된 타르상 물질에 n-헥산을 가하면, 목적하는 물질은 실제로 m-헥산에 불용이며 따라서 침전으로 남게된다. 상등액을 제거한 후, 침전을 클로로포름으로 미리 충전시킨 와고겔(Wako Gel) C-100(Wako Pure Chemical Industries Ltd. 제품) 700ml 칼럼에 적용시키고 클로로포름으로 용출시켜 활성분획을 얻는다. 이들 활성 분획을 농축하여 오일상 생성물 800mg을 수득한다.

이렇게 해서 수득한 오일상 생성물을 메탄올 약 5ml에 용해시켜, 세파덱스(Sephadex) LH-20(스웨덴의 Pharmacia Co. 제품) 600ml 칼럼에 적용시키고 메탄올로 용출시켜 30ml씩의 분획을 분리한다. SF-2080A 물질은 분획 18내지 21에서 용출되며, SF-2080B 물질은 분획 25내지 30에서 용출된다. 분획 22내지 24를 합해서 농축한 후 다시 세파덱스 LH-20을 사용하여 크로마토그라피에 의해 분리한다.

이렇게 하여, SF-2080A 물질 230mg과 SF-2080B 물질 200mg이 수득된다. 이들을 각각 소량의 메탄올에 용해시키고 결정으로 침전시켜 SF-2080A 물질 90mg과 SF-2080B 물질 80mg을 수득한다.

[실시예 2]

백색의 하틀리(Hartly) 기니아피그(그룹당 기니아피그 4마리) 등의 4부위(양측에서 각각 2부위씩, 4×6cm)에서 털을 깎고 트리코파이톤 아스테로이데스 부유용액(액체 Sabouraud's 배지 : 생세포수 : 2×10⁷/ml)을 각 부위당 0.5ml의 양으로 발라감염시킨다. 감염시킨지 2일 후, SF-2080A 물질 1%용액(참조 표 6) 0.25ml를 양측의 한부위에만 1일에 1번씩 8일간 계속해서 발라준다.

피롤니트린 1% 용액및 클로트리마졸 1% 용액을 사용하여 상기와 같은 방법을 수행한다. 이렇게 해서 처리된 기니아피그를 처리하지 않은 그룹과 비교한다.

표 7에서 볼 수 있는 바와같이 육안관찰한 결과 SF-2080A 물질은 피부의 비후, 발적및 각화의 모든면에서 최상의 치료효과를 나타낸다.

[표 7]

8일간 처리한 후, 3개의 피부조각을 각감염부위로부터 채취하여 사우보라우드 한천 평판상에서 7일간 배양하고 감염된 미생물의 양성 배양율을 측정한다.

SF-2080A 물질-투여그룹에서는, 피롤니트린-투여그룹, 클로트리마졸-투여그룹 및 비처리그룹과 비교하여 배양 양성율이 현저히 감소되었음을 관찰할 수 있다(표 8 참조).

[표 8]

본 발명을 특정한 실예를 참고로 하여 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 여러가지 변화와 변형이 이루어질 수 있음은 당분야의 기술자에게는 자명한 사실이다.

Claims (1)

1. 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 항생물질 SF-2080A 및 SF-2080B-생성균주를 영양배지 중에서 배양하며, 배양액으로부터 항생물질 SF-2080A 및 항생물질 SF-2080B를 각각 회수함을 특징으로하여 구조식(Ⅰ)의 항생물질 SF-2080A 및 구조식(Ⅱ)의 항생물질 SF-2080B를 제조하는 방법.

   

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