KR900004066B1 - 생물학적으로 활성인 ws 6049의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
본 발명은 이하에서 WS 6049로 기재하는 생물학적 활성을 갖는 신규 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세히는 각종 병원성 미생물에 대한 항균활성 및 항종양 활성을 지니는 WS 6049-A 및 WS 6049-B 및 이들의 제조방법 및 이들을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 각종 병원성 미생물과 종양에 대한 활성을 지니며, 인체 및 동물에 있어서의 감염성 질환 및 각종 암 질환의 치료용으로서 유용한 새로운 WS 6049를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 발효에 의한 WS 6049의 제조방법을 제공하는 것이다 본 발명의 또 다른 목적은 활성성분으로서 WS 6049를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 및 이하의 설명에서 WS 6049"란 WS 6049-A 및 WS 6049-B를 포함하여 나타낸다.
본 발명의 WS 6049는 영양배지에서 악티노마두라 풀베라세우스(Actinomadura pulveraceus) sp. nov. 6049호와 같은 악티노마두라 속에 속하는 WS 6049생산 균주를 발효시킴으로써 제조할 수 있다.
WS 6049 제조에 사용되는 미생물의 특성 및 WS 6049의 제조방법에 관하여 이하에서 설명한다.
미생물
WS 6049의 제조에 이용될 수 있는 미생물은 악티노마두라속에 속하는 균주로서, 이중 악티노마두라 플베라세우스 sp.nov. 6049호가 일본국 와까야마 프리팩튜어의 와까야마시에서 수거한 토양시료로부터 새로이 분리되었다.
상기 새로이 분리된 미생물 배양체 악티노마두라 풀베라세우스 sp.nov.6049호는 부다페스트 협약하에 아메리칸 타입컬쳐콜렉숀(ATCC)의 스톡 컬쳐 콜렉숀에 기탁번호 ATCC 39100(기탁일 : 1982년 4월 12일)으로 기탁되어 있다. 또한 상기 균주는 1983년 6월 17일자로 한국종균협회(KFCC)에 수탁번호 KFCC-10043으로 기탁되어 있다. WS 6049의 제조에 있어서 본 명세서에 기술하는 특정 미생물은 단지 예에 지나지 않으며, 본 발명이 이들만을 이용하는 것으로 제한되지 않는다. 나아가, 본 발명은 X-선, 자외선, 질소 겨자기름등과 같은 통상적인 수단 및 유전공학 수단을 이용하여 상술한 미생들로부터 얻을 수 있는 인공 변이주, 뿐만 아니라 미생물의 자연적인 변이에 의해 수득되는 자연 변이주를 비롯하여 WS 6049를 생산할수 있는 모든 변이주의 이용도 포함한다. 악티노마두라 풀베라세우스 sp.nov.6049호는 다음과 같은 형태학, 배양상 및 생리학적 특성을 갖는다.
(1) 형태학적 특징 :
셔링과 고틀립이 발표한 방법을 이용하여 형태학적 특징을 관찰하였다(Shirling, E.B. 및 D.Gottlieb; 스트렙토마이세스종의 규명방법, Int. J.Syst.Bacteriol, 16 ; 3 13-340, 1966):
효모추출물-몰트추출물 한천, 무기염-전분 한천 및 오트밀 한천 배지상에서 21일간 30℃에서 성장시킨 배양물을 광학 및 전자 현미경을 사용하여 형태학적으로 관찰하였다. 성숙한 포자들은 5-20개가 주로 고리, 때로는 느슨한 나선형태의 사슬로서 발견된다. 포자들은 난형이며 사마귀 투성이의 표면을 갖고, 0.8-1.0 × 1.20 -1.2μ 크기이다.
(2) 배양특성 :
배양특성은 셔링과 고틀립 및 왁스만(Waksman, S.A. : 디악티노마이세츠, 2권, 속 및 종의 분류, 규명 및 설명, 윌리암 앤드 윌킨스사, 볼티모어,1961)이 발표한 10종의 배지상에서 관찰하였다. 배양은 30℃에서 21일간 행하였다.
이와같은 조사에서 색상명은 칼라 스탠다드(Color Standard, Nihon Shikisai CO.,Ltd.)를 기준으로 하였다. 표 1에 나타난대로, 효모추출물-몰트 추출물 한천, 오트밀 한천 및 무기염-전분한천 배지상에서 균주를 배양할 경우 콜로니는 청색계열에 속하였다. 가용성 색소는 생산되지 않았다.
세포벽 조성분석은 벡커 등(벡커, 비, 엠.피. 레체발리에르, 알.이.고돈 및 에이취.에이. 레체발리에르 : 전체세포가수분해들의 페이퍼 크로마토그라피에 의한 노카르디아와 스트렙토마이세스 사이의 신속한 구별 Appl.Microbiol. 12, 421-423, 1964) 및 야마구찌(Yamaguchi, T.형태학적으로 다른 악티노마이세츠의 세포벽 조성의 비교, J.Bacterio1, 89, 444-453, 1965)의 방법을 이용하여 실시하였다. 결과로서 균주 6049 호의 세포벽은 메조-디아미노피멜산을 함유하였다 전체 세포 가수 분해물에는 글루코스, 만노스 및 마두로스(3-0-메틸-D-갈락토스) 가 존재하는 것으로 나타났다.
(3) 생물학적 및 생리학적 특성
성장 온도 범위 및 최적온도를 구배 배양기(Toyo Kagaku Sangyo Co.,Ltd.,)를 이용하여 효모추출물-몰트추출물 한천 배지상에서 측정하였다. 성장 pH범위 및 최적 pH는 30℃에서 7일간 진탕하면서 효모추출물-몰트추출물내에서 액체배양하여 측정하였다. 젤라틴액화는 젤라틴 배지상에서 30℃에서 14일간 조사하였다. 전분 가수분해는 30℃에서 14일간 무기염-전분한천 플레이트상에서 배양한후, 전분-요오드반응을 이용하여 관찰하였다. 밀크펩톤화는 30℃에서 14일간 스킴밀크 배지에서 관찰하였다. 멜라노이드 색소생산은 티로신한천, 펩톤-효모추출물-철 한천 및 트립톤-효모추출물 배지상에서 관찰하였다. 이하의 표 2에서 나타내는 바와같이, 성장 온도범위는 21-41℃, 최적온도는 30-35℃이다. 전분가수분해, 밀크 펩톤화, 황화수소생산, 우레아제활성, 질산염환원 및 멜라닌생산은 음성이고, 반면 젤라틴 액화 및 밀크 응고는 양성이다.
탄소원의 이용은 프리드함과 고틀립(Pridham, T.G. 및 D.Gottlieb: 종 결정을 위한 일부 악티노마이세탈에 의한 탄소 화합물의 이용, J.Bacteriol 56 : 107-114, 1965)의 방법에 따라서 조사하였다. 결과는 30℃에서 14일간 배양한 후 측정하였다. 이하의 표 3에 나타내는 바와같이, 대부분의 모든 탄소원들이 확실치 않거나 또는 이용되지 아니하였다. 단지 디-크실로스, 디-글루코스 및 디-트레할로스만이 이용되었다. 상술한 세포벽 조성 및 전체적인 세포슈가 성분들로부터 균주 6049호가 악티노마두라 속의 종임이 나타난다.
상기 미생물을 악티노마투라종에 관하여 발표된 내용(노노무라, 에이취, 및 와이.오하라 : 토양내 악티노마이세츠의 분포, (XI) 악티노마두라 속의 일부 새로운 종, 레체발리에르 외, J.Ferment, Technol. 49 : 904-912, 1971 : 굳펠로우, 엠.쥐.알더슨 및 제이.라세이 : 악티노마두라와 관련된 악티노마이세츠의 뉴머리칼 택소노미, J. Gen. Microbiol. 112 : 95-111,1979 ; 도미타, 케이, 와이 호시노, 티.사사히라 및 에이취.가와구찌; BBM-928, 항종양 항생물 컴플렉스 2, 생산균에 대한 택소노미연구, 항생물지 33 : 1098-1102, 1980).
균주 6049호는 악티노마두라베루코소스포라를 닮은 것으로 간주된다. 그러나 균주 6049호는 다음과 같은 점들에서 상술한 종들과 구별되는 것으로 밝혀졌다. 표 4에 나타내는 바와같이, 디-프룩토스, 엘-아라비노스, 만니톨, 수크로스 및 글리세린의 이용이 다르다. 또한 질산염 환원 및 밀크 펩톤화에 있어서도 차이가 관찰된다. 균주 6049호의 기중체의 색은 무기염-전분 한천 배지상에서 흰색 계열에 속하지만, 에이. 베루코소스포라의 그것은 회색계열에 속하였다. 균주 6049호와 에이. 베루코소스 포라간의 배양 특성들의 직접적인 비교는 이하의 표 5에 나타내는 바와같다.
상술한 바와같이 비교한 결과, 균주는 6049호는 악티노마두라속의 새로운 종인 것으로 간주된다. 악티노마두라 풀베라세우스 sp. nov.라는 이름은 효모추출물-몰트추출물 한천, 오트밀 한천 및 무기염-전분 한천배지상에서의 분말상의 기중 균사체인 균주 6049호를 가르킨다.
[표 1] 균주 6049호의 배양 특성
+ : 이용, ± : 이용여부가 불분명함, - : 이용안함
[표 2] 균주 6049호의 생리학적 특징
[표 3] 균주 6049호의 탄소원 이용
+ : 이용, ± : 이용여부가 불분명함, - : 이용않함
[표 4] 균주 6049호와 악티노마두라베루코소스포라 사이의 생리학적 특성 및 탄소이용의 차이점
++ : 양호한 이용
+ : 이용
± : 이용여부가 불분명함
- : 이용않함
[표 5a] 균주 6049호와 악티노마두라 베루코소스포라간의 직접비교
[표 5b]
1. 펩톤-효모추출물 -철한천배지
2. 영양한천배지
3. 감자- 덱스트로스한천배지
4. 수크로스-질산염한천배지
5. 티로신 한천배지
6. 효모추출물-몰트추출물한천배지
7. 오트밀 한천배지
8. 무기염-전분한천배지
9. 글루코스-아스파라긴 한천배지
WS 6049의 제조
본 발명의 WS 6049는 악티노마두라속에 속하는 WS 6049생산 균주(예, 악티노마두라 풀베라세우스 sp. nov. 6049호)를 호기성 조전하(예, 진탕배양, 침지배양등)에 동화 가능한 탄소 및 질소원을 함유하는 영양배지에서 성장시킴으로써 제조된다.
영양배지내에서의 바람직한 탄소원은 크실로스, 글루코스, 수크로스, 전분 등과 같은 탄수화물이다.
질소원으로서는 효모추출물, 펩톤, 글루텐 밀, 면실박, 대두밀, 옥수수 침지액, 건조효모, 밀배아, 뿐만아니라 암모늄염(예, 질산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등), 요소, 아미노산 등과 같은 무기 및 무기질소 화합물이 바람직하다.
탄소 및 질소원은 병용하는 것이 유리하기는 하나, 순수한 형태로 사용될 필요는 없는데 이는 미량의 성장인자 및 상당량의 무기 영양소를 함유하는 보다 덜 순수한 물질을 사용하는 것도 또한 적합하기 때문이다.
필요에 따라, 탄산칼슘, 인산나트륨 또는 칼륨, 염화나트륨 또는 칼륨, 마그네슘염, 구리염 등과 같은 무기염을 배지에 가할수도 있다. 필요하다면, 특히 배양배지에서 거품이 심각하게 형성되는 경우에 있어서, 액체 파라핀, 동물성 오일, 식물성 오일, 광유 또는 실리콘과 같은 거품제거제를 첨가할 수도 있다.
다른 항생물의 대량생산용으로 이용되는 바람직한 방법들에서와 마찬가지로 침지 호기성 배양 조건들이 WS 6049의 대량 생산용으로서 바람직하다. 소량제조시에는 플라스크 혹은 병에서의 진탕 또는 표면배양이 이용된다. 또한, 커다란 탱크내에서 성장시키고자 하는 경우에 있어서는, WS 6049생산 공정에 있어서의 성장 지연을 방지하기 위하여 생산탱크에 접종되는 미생물로서 성장력을 갖는 유형의 미생물을 이용하는 것이 바람직하다.
따라서, 비교적 소량의 배양 배지와 미생물 포자 또는 균사를 접종하고 상기 접종된 배지를 배양하여 먼저 성장력을 갖는 미생물의 접종물을 수득하고, 이어서, 배양된 성장력을 갖는 접종물을 무균적으로 큰 탱크로 옮기는 것이 적당하다. 성장력을 갖는 접종물이 수득되는 배지는 WS 6049 생산용으로 사용되는 배지와 실질적으로 동일하거나 또는 다르다. 배양 혼합물의 교반 및 통기는 다양한 방법으로 행할 수 있다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반장치를 이용하거나, 발효조를 회전 혹은 진탕하거나, 여러가지 펌핑기구를 사용하거나, 또는 배지에 멸균 공기를 통과시켜줌으로써 행할 수 있다. 통기는 발효혼합물에 멸균공기를 통과시켜서 수행할 수 있다.
발효는 통상적으로 약 20℃-40℃, 바람직하기로는 25-30℃에서 약 50-100시간동인 실시한다. 발효가 완결되면, 항생물질의 회수 및 정제용으로 통상적으로 이용되는 각종 방법들, 예를들면 적당한 용매 또는 그와 같은 용매들의 혼합물을 사용하는 용매추출, 크로마토그래피 또는 적당한 용매 또는 그와같은 용매들의 혼합물로부터의 재결정을 실시하여 배양브로쓰로부터 WS 6049를 회수한다.
본 발명에 따르면 일반적으로 WS 6049는 배양된 균사내에서 주로 발견된다. 따라서, 배양 브로쓰를 여과 또는 원심분리로 분리하여서 균사 케이크를 수득하고, 이어서 생성된 균사케이크를 아세톤, 에렬아세테이트등과 같은 적당한 유기용매, 또는 이들 용매들의 혼합물로 추출함으로써 WS 6049가 회수된다.
추출물을 통상적인 방법으로 처리하여, 예를들면 추출물을 보다 소량으로 증발 또는 증류 농축시키고, 생성된 활성물질, 즉 WS 6049를 함유하는 잔류물을 통상적인 정제방법으로, 예를들면 적당한 용매 또는 그러한 용매들의 혼합물로부터 재결정하거나 크로마토 그래피하여 정제시킴으로써 WS 6049가 수득된다.
WS 6049-A 및 WS 6049-B는, 발효에 의해 생산된 상술한 2가지 생성물 둘 다를 함유하는 물질을 클로로포름 등과 같은 적당한 유기용매내에 용해시키고, 이어서 생성된 용액을 예를 들면, 클로로포름, 아세톤 등과 같은 적당한 유기용매 또는 그러한 용매들의 혼합물을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그레피를 실시함으로써 분리할 수 있으며, 분리된 WS 6049-A 및 WS 6049-B를 다시 통상적인 방법, 예를들면 고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 보다 정제시킬 수 있다.
WS 6049의 물리적 및 화학적 특성
상술한 방법에 따라 수득된 WS 6049, 즉 WS 6049-A 및 WS 6049-B는 다음과 같은 물리적 및 화학적 특성을 지닌다.
WS - 6049 - A
1) 형태 및 색:무색분말
2) 발색반응
양성 : 드라겐도르프 반응, 에리히 반응 및 세륨설페이트반응
음성 : 닌히드린 반응
3) 용해성:
가용성 : 메탄올, 아세톤, 클로로포름
난용성 : 디에틸 에테르
불용성 : 헥산, 물
4) 융점:150℃ (분해)
6)자외선 흡수스펙트럼
7) 적외선 흡수 스펙트럼 :
=3450,3350,3250,2960,2920,1725,1675,1610,1595,1520,1465,1450,1405,1370,1350,1310,1250,1180,1155,1115,1075,1020,985,955,905,850cm-1
8)성분분석
C : 52.03, H; 5.71, N ; 4.15, S ; 9.86(%)
9) 박층 크로마토그라피
10) 분자량 :
FD 메스 : m/z 1333(M++Na)
FABQ MS ; m/z 1311(M++1)
겔투과 크로마토그라피 : 1100-1200
11)13C NMR 스펙트럼(CDCl3) spectrum(CDCl3) : δ(ppm):13.9,14.6,16.7,17.6,19.9,22.8,29.1,34.0,35.2,39.6,42.3,52.7,55.8,56.1,56.2,56.2,60.3,61.7,64.7,66.7,68.4,69.0,69.3,69.8,70.5,72.0,75.9,76.1,77.2,77.3,83.2,86.3,88.5,90.7,97.3,98.6,98.9,99.6,99.7,103.9,107.8,112.7,123.2,125.0,130.0,131.1,136.8,144.2,146.6,154.0,154.6,160.9,166.6,192.4 (첨부하는 그래프 1 참조)
12)1H NMR 스펙트럼(CDCl3)
δ(ppm):8.75(1H,s),7.48(1H,s),6.6(1H,d,d),6.2(1H,d,J=1.6Hz),6.18(1H,br.s),5.93(1H,d,J = 9.6Hz), 5.83(1H, d.d, J = 9.6, 1.6Hz), 5.7(1H, d,J=2Hz ), 5.5(1H, m), 5.48(1H, d, J = 2.3Hz), 5.43(1H, br.s), 4.97(1H,d), 4.7(2H,m ), 4.56(1H, d, J=2.3Hz), 4.23(1H,s),4.2 to 3.6(10 to 14H), 3.97(3H,s), 3.88( 3H,s),3.79(3H,s),3.5(2H,m),3.43(3H,s),2.77(1H,s),2.7(2H,m),2.52(3H,s),2.5(1H,m),2.4to2.25(3H,m),2.17(1H,s),2.12(3H,s),2.07(1H,m),1.77(2H,s),1.5(2H,m),1.41(3H,d,J=6Hz),1.35(3H,d,J=6Hz),1.32(3H,dJ=6Hz),1.2(4H,m), (첨부하는 그래프 2 참조)
WS 6049-B
1) 형태 및 색 : 무색분말
2) 발색반응
양성 : 드라겐도르프반응, 에리히반응 및 세륨설페이트반응
음성 : 닌히드린반응
3) 용해성
가용성 : 메탄올, 아세톤, 클로로포름
난용성 : 디에틸에테르
불용성 : 헥산
4) 융점 : 145℃ (분해)
6)자외선흡수스펙트럼
7)적외선 흡수스펙트럼 :
=3450, 3350, 3250, 2990, 2920, 1725, 1675, 1610, 1595, 1520, 1465, 1450, 1405, 1370, 1350, 1310, 1250, 1180, 1155, 1070, 1020, 985, 955, 905, 880, 850cm-1
8)원소분석
C ; 51.58, H ; 5.75, N ; 4.27, S ; 9.80(%)
9)박층 크로마토그라피
10) 분자량 : 겔투과 크로마토그라피 : 1100-1200
11)13C NMR 스펙트럼(CDCl3) ·
δ(ppm):13.8,16.7,17.6,19.8,22.7,29.l,33.9,34.1,35.2,39.5,52.8,55.8,56.1,56.3,61.0,61.5,64.6,66.7,68.4,69.0,69.3,69.8,70.4,71.9,75.9,76.2,76.7,77.2,77.3,77.6,83.2,86.6,88.3,90.7,97.3,98.6,99.0,99.6,99.7,103.9,107.8,112.7,123.2,124, 9,129.8,131.0,136.8,144.2,146.3,154.0,154.6,160.9,166.6,192.4,as,(첨부하는 그래프 3참조):
12)1H NMR 스펙트럼(CDCl3)
δ(ppm:11.75(1H,s),8.57(1H,s),7.48(1H,s),6.6(1H,d,d.),6.24(1H,d,J=1.3Hz),6.18(1H,br.s),5.93(lH,d,J=9.2Hz),5.83(1H,d.d,J=9Hzand1.3Hz),5.70(1H,br.d),5.5(1H,m),5.47(1H,d,J=2.3Hz),5.42(1H,br.s),4.98(1H,d,J=9Hz),4.70 to4.6(2H,m),4.56(1H,d,J=2.3Hz),4.24(1H,s),4.15to3.4(12to18H),3.97(3H,s),3.88(3H,s),3.79(3H,s),3.42(3H,s),2.52(3H,s),2.6 to 2.4(2H,m),2.4 to 2.2(7 to 8H),2.l2(3H,s),2.2to2.0(2H,m),1.5(2H,m),1.4(3H,d,J=6Hz),1.35(3H,d,J=6Hz),1.33(3H,d,J=6Hz) : (첨부하는 그래프 4참조).
WS 6049의 생물학적 특성
WS 6049의 생물화적 특성들은 다음과 같이 설명되어진다.
1) WS 6049의 항종양 활성:
WS 6049의 항종양 활성은 생쥐에서의 실험적인 종양계에서 측정하였다. 임파구 백혈병 P-388을 생쥐 1마리당 1×106세포의 접종 크기로 BDF1생쥐에 복강내 주입하였다. 종양세포를 주입하고 24시간후, 등급을 나눈 투여량의 항생물질을 생쥐에게 복강내 투여하였다. 상기 처리는 1,2,3 및 4일째날에 행하였다.
WS 6049를 생리식염수(염분 0.9%)에 현탁시킨다. 비교동물에게는 생리식염수 용맥만을 피하투여 하였다. 주사량은 모든 실험에서 0.2ml이다. 치료반응으로서 평균 생존시간을 측정하였고, 결과는 T/C%로 나타낸다(처리 그룹의 생존시간/비교그룹의 생존시간×100). 독성은 종양주입후 0과 4일 사이의 체중감소로 측정하였다.
결과는 이하의 표 6 및 7에 나타내는 바와 같다.
WS 6049-A 및 WS 6049-B는 백혈병 P-338에 대하여 강한 활성을 갖는다. 스케줄에 따라 0.025-12.0μg/kg사이의 양을 투여함으로써 생쥐의 생존기간이 현저히 증가하였다.
[표 6] P-338 생쥐 백혈병
종양위치 : 복강내(1×1O6세포/생쥐, 일 0)
투약경로 : 복강내(1,2,3 및 4일)
그룹당 다섯마리
* : 30일째 되는날에 생존하는 생쥐의 수/전체생쥐의 수
[표 7] P-388 생쥐 백혈병
종양위치 : 복강내(1×106)
투여경로 : 복강내(1, 2, 3 및 4일)
그룹당 다섯마리
2) WS 6049-A 및 WS 6049-B의 항균활성 .
WS 6049-A 및 WS 6049-B의 항균활성은 박테리아용 부용배지 및 진균 및 효모용 사부로 배지에서 연속 브로쓰 희석법으로 측정하였다. 최소 억제 농도(MIC)는 37℃에서 하룻밤(박테리아), 28℃에서 48-72시간(진균 및 효모)배양한후 μg/ml 단위로 표시하였다. WS 6049-A 및 WS 6049-B의 항균 스펙트럼은 이하의 표 8에 나타내는 바와같다.
수득된 결과로부터, 항생물질, WS 6049가 광범위한 항균활성을 지니며, 현재까지 알려진 것들중 가장 강력한 항생물질인 것으로 추론된다.
[표 8] WS 6049-A 및 WS 6049-B의 항균스팩트럼
3) WS 6049-A 및 WS 6049-B의 급성독성
복강내 주사에 의한 ddy생쥐에서의 WS 6049-A 및 B의 급성독성은 둘다 0.05mg/kg이다.
본 발명의 약학 조성물은 예를들면 고체, 반고체 또는 액체형태의 약학 제제형태로 사용될 수 있으며, 상기 제제는 외용, 장용 또는 비경구용으로 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와 함께 활성성분으로서 WS 6049를 함유한다. 활성성분은 정제, 펠릿, 캡슐, 좌제, 용액, 에멀전, 현탁액 및 기타 다른 사용하기에 적합한 형태용의 통상적인 비독성, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있다. 사용 가능한 담체는 물, 글루코스, 락토스, 아카시아고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 마그네슘 트리실러케이트, 활석, 옥수수전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자전분, 요소 및 고체, 반고체 또는 액체형태의 제제 제조용으로 적합한 기타 다른 담체이며, 또한 보조제, 안정화제, 농조화 및 착색제 및 향료를 사용할 수도 있다. 활성화합물은 질병의 경과 또는 증상에 따라 목적하는 항균활성을 발휘하기에 층분한 양으로 약학 조성물에 함유된다.
상기 조성물을 인체에 투여하고자하는 경우 정맥내, 근육내, 또는 경구투여 하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 목적화합물의 투여량 또는 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 각각의 환자 개인의 연령 및 증상에 따라 다르고 또한 그에 좌우되나, 일반적으로 질병의 치료목적으로 인체 또는 동물 체중 1kg당 활성성분 약 0.01-50μg이 1일 투여량이며, 평균 1회 투여량으로서는 일반적으로 약 0.1μg,1μg,10μg,50μg,100μg 및 200μg이 투여된다
이하의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것들이다.
[실시예 1]
2% 전분, 0.5%글루코스 1%면실박, 1%건조효모, 0.5%옥수수 침지액 및 0.2%탄산칼슘(pH 7.0)을 함유하는 수성배지(160ml)를 3개의 500m1 삼각플라스크에 각각 붓고 120℃에서 30분간 멸균시킨다. 악티노마두라 풀베라세우스 sp.nov.6049호(ATCC 39100 KFCC 10043)경사배양물 1루우프를 각각의 배지에 접종시키고 220rpm으로 4일간 3-인치 트로우가 장치된 회전 진탕기에서 30℃로 배양하였다. 생성된 배양물을 4%수크로스, 0.5%건조효모, 0.1%K2HPO4, 0.1%MgSO4,7H2O, 0.1%NaCl, 0.2%(NH4)2SO4, 0.2%탄산칼슘,0.0001%FeSO4,7H2O,0.0001%MnCl2,4H2O, 0.0001%ZnSO47H2O 및 0.00005%NaI를 함유하는 30리터 발효조내의 수성배지(20리터)에 접종시키고,120℃에서 30분 멸균한후, 20리터/분의 통기 및 300rpm의 교반하에 30 ℃에서 4일간 배양하였다.
수득된 배양 브로쓰를 규조토(lkg)를 사용하여 여과한다. 수득된 균사에 10리터의 에틸아세테이트를 가하고 10분간 교반하였다. 추출공정을 2회 실시하고, 추출물들을 혼합하였다. 추출물을 10리터의 1%중 탄산나트륨 및 10리터의 10%염화나트륨으로 세척하였다. 이어서 추출물을 진공중에서 1리터 부피로 농축하였다. 무수 소디움설페이트로 탈수시킨후, 에틸아세테이트 용액을 다시 진공농축시키고, 수득된 오일성 물질에 대하여 실리카겔(70ml)를 사용한 컬럼크로마토그라피를 실시하였다.200m1클로로포름으로 컬럼을 세척하고 클로로포름-메탄올(40 : 1) 혼합물로 용출시켰다. 활성물을 함유하는 분획들(500ml)을 진공농축시켜 조분말(140ml) 을 수득하였다.
상기 분말을 2ml클로로포롬에 용해시키고, 실리카겔(20ml) 컬럼에 가하였다. 컬럼을 클로로포름-아세톤(8 : 1)혼합물로 세척하고, 클로로포름-아세톤(4 : 1)혼합물로 WS 6049-A를 용출시켰다. WS 6049-B는 콜로로포름-아세톤(2 : 1)혼합물로 용출시켰다.WS 6049-A 및 WS 6049-B를 함유하는 각각의 분획들을 진공농축시켜 WS 6049-A(17mg) 및 WS 6049-B(15mg)의 조분말을 각각 수득하였다.
이들 각각에 대하여 따로이 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 실시하였다. HPLC는 워터스 모델 유 6케이 주입기가 부착된 워터스모델 6000에이 펌프를 사용하여 실시하였다. 크로마토그라피는 좌외선 검출기, 워터스모델 440을 사용하여 254nm에서 모니터하였다.μ포타실(메르크, 디름슈타트)을 채운 강관(7.9mm내경, 300mm길이)을 사용하여,3ml/분의 유출률로 실시하였다. 이동상으로스는 헥산, 클로로포름 및 메탄올(25 : l0: 2)의 혼합물을 사용하였다.
상술한 HPLC결과 분획 A(유지시간 : 18분) 및 분획 B(유지시간 : 26분)가 수득되었다. 분획 A로부터 12mg의 WS 6049-A무색분말과 분획 B로부터 8mg의 WS 6049-B무색분말이 수득되었다.
Claims (1)
- 호기성 조건들하에 수성영양배지내에서 WS 6049를 생산할 수 있는 악티노마두라 풀베라세우스 sp.nov.6049호(ATCC 39100, KFCC 10043) 균주를 배양하고, 이어서 WS 6049-A 및 WS 6049B를 회수함을 특징으로하는, 하기 특성들을 갖는 WS 6049-A 및 WS 6049-B로부터 선택된 WS 6049의 제조방법.i) WS 6049-A의 특성 :1) 형태 및 색 : 무색분말2) 발색반응 :양성 : 드라겐도르프반응, 에리히반응 및 세륨설페이트반응음성 : 닌히드린반응3)용해성 :가용성 : 메탄올, 아세톤, 콜로로포름난용성 : 디에틸에테르불용성 : 헥산, 물4) 융점 150℃(분해)6) 자외선 흡수 스팩트럼7) 적외선흡수 스팩트럼=3450,3350,3250,2960,2920,1725,1675,1610,1595,1520,1465,1450,1405,1370,1350,1310,1250,1180,1155,1115,1075,'1020,985,955,905,850cm-l8) 원소분석 : C ; 52.03, H ; 5:71, N : 4.15, S ; 9.86(%)9) 박층 크로마토그래피10) 분자량FD메스 : m/z l333(M++Na)FABQ MS : m/z 1311(M++1)겔투과 크로마토그래피 : 1100-120011)13C NMR 스펙트럼(CDCl3)δ(ppm):13.9,14.6,16.7,17.6,19.9,22.8,29.1,34.0,35.2,39.6,42.3,52.7,55.8.56.1,56.2,2.56,2.60,3.61.7,64.7,66.7,68.4,69.0,69.3,69.8,70.5,72.0,75.9,76.1,77.2,77.3,83.2,86.3,88.5,90.7,97.3,98.6,98.9,99.6,99.7,103.9,107.8,112.7,123.2,125.0,130.0,131.1,136.8,144.2,146.6,154.0,154.6,160.9,166.6,192.4,(명세서내의 그래프 1참조)12)1H NMR 스펙트럼(CDCl3)δ(ppm):8.57(1H,s),7.48(1H,s),6.6(1H,d,d.),6.2(1H,d,J=1.6Hz),6.18(1H,br.s),5.93(1H,d,J=9.6Hz),5.83(1H,d.d,J=9.6,1.6Hz),5.7(1H,d,J=2Hz),5.5(1H,m),5.48(1H,d,J=2.3Hz),5.43(1H,br.s),4.97(1H,d),4.7(2H,m),4.56(1H,d,J=2.3Hz),4.23(1H,s),4.2to3.6(10to14H),3.97(3H,s),3.88(3H,s),3.79(3H,s),3.5(2H,m),3.43(3H,s),2.77(1H,S),2.7(2H,m),2.52(3H,s),2.5(1H,m),2.4to2.25(3H,m),2.17(1H,s),2.12(3H,s),2.07(1H,m),1.77(2H,s),1.5(2H,m),1.41(3H,d,J=6Hz),1.35(3H,d,J=6Hz),1.2(4H,m),(명세서내의 그래프 2참조)ii) WS 6049-B의 특성1) 형태 및 색 : 무색분말2) 발색반응:양성 : 드라겐도르프반응, 에리히반응 및 세륨설페이트반응음성 : 닌히드린반응3)용해성:가용성 : 메탄올, 아세톤, 클로로포름난용성 : 디에틸에테르불용성 : 헥산4) 융점:145℃ (분해)6) 자외선 흡수 스펙트럼7) 적외선흡수 스펙트럼=3450,3350,3250,2990,2920,1725,1675,1610,1595,1520,1465,1450,1405,1370,1350,1310,1250,1180,1155,1115,1070,1020,985,955,905,880,850cm-18)원소분석 : C : 51.58, H: 5.75, N : 4.27, S : 9.80(%)9)박층 크로마토그래피10) 분자량겔투과 크로마토그래피 : 1100-120011)13CNMR스펙트럼(CDCl3)δ(ppm):13.8,16.7,17.6,19.8,22.7,29.1,33.9,34.1,35.2,39.5,52.8,55.8,56.1,56.3,61.0,61.5,64.6,66.7,68.4,69.0,69.3,69.8,70.4,71.9,75.9,76.2,76.7,77.2,77.3,77.6,83.2,86.6,88.3,90.7,97.3,98.6,99.0,99.6,99.7,103.9,107.8,112.7,123.2,124.9,129.8,131.0,136.8,144.2,146.3,154.0,154.6,160.9,166.6,192.4,(명세서내의 그래프 3참조)12)1H NMR 스펙트럼(CDCl3)δ(ppm):1.75(1H,s),8.57(1H,s),7.48(1H,s),6.6(1H,d.d),6.24(1H,d,J=1.3Hz),6.l8(1H,br.s),5.93(1H,d,J=9.2Hz),5.83(1H,d.d,J=9.6Hz and 1.3Hz),5.70(1H,br.d),5.5(1H,m),5.47(1H,d,J=2.3Hz),5.42(1H,br.s),4.98(1H,d,J=9Hz),4.7 to 4.6(2H,m),4.56(1H,d,J=2.3Hz),4.24(1H,s),4.15 to 3.4(12 to 18H),3.97(3H,s),3.88(3H,s),3.79(3H,s),3.42(3H,s),2.52(3H,s),2.6 to 2.4(2H,m),2.4 to 2.2(7 to 8H),2.12(3H,s),2.2 to 2.0(2H,m),1.5(2H,m),1.4(3H,d,J=6Hz),1.35(3H.d,J=6Hz),1.33(3H,d,J=6Hz), (명세서내의 그래프 4참조)
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