CN103087124B - 一种制备阿霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备高纯度阿霉素的方法。该方法包括如下步骤：（1）将预提纯的阿霉素溶液经大孔吸附树脂层析，所述的层析体系采用酸性低浓度的有机溶剂水溶液预洗，再用酸性高浓度的有机溶剂水溶液洗脱；（2）上述的洗脱组分，经制备柱层析分离，即可得高纯度的阿霉素组分，如有需要可用现有技术中常规的浓缩和析晶方式将阿霉素从水溶液中分离出来。本发明的方法具有工艺简单、收率高、成本低、环境污染小等优势。制备的阿霉素含量达99.5%以上，单个杂质含量控制在0.10%以下，符合USP、EP标准。

Description

一种制备阿霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤抗生素的制备方法，具体而言，本发明涉及一种制备高纯度阿霉素的方法。

背景技术

阿霉素是蒽环类抗生素(如阿霉素、柔红霉素、表阿霉素)的一种，是最广泛应用的抗肿瘤药物之一。它能使DNA的双螺旋链解开，改变DNA的模板性质，阻止和干扰DNA聚合酶，抑制DNA的合成和RNA的合成，从而阻止细胞分裂(抑制核酸合成)。阿霉素主要用于治疗急慢性白血病、恶性淋巴瘤、胃癌、肺癌、膀胱癌、软组织肉瘤、乳腺癌、网状细胞肉瘤、恶性畸胎瘤等恶性肿瘤疾病。其结构如式Ⅰ所示。

1974年，美国专利US3,803,124公开了阿霉素可由发酵产物柔红霉素通过化学半合成而制得。意大利的法玛西雅厄普约翰公司在中国专利CN1147835A中公开了一种由柔红霉素通过酶法转化制备阿霉素的方法。目前，以柔红霉素为中间体半合成是工业化生产阿霉素的方法。但是，化学合成方法存在产品质量不稳定、环境污染大、生产成本高、不符合EHS要求等问题。专利CN102363755A公开了一种能够通过一步发酵法生产阿霉素的链霉菌(Streptomycessp.H323，保藏编号为CGMCCNO.4827)，其阿霉素发酵单位达到工业化生产要求。

目前，以柔红霉素为前体通过半合成或生物转化得到的阿霉素作为起始原料，进行分离纯化制备阿霉素的研究比较多。美国专利US4,861,870将半合成或生物转化得到的阿霉素作为起始原料，起始阿霉素色谱含量为70～80％，通过离子交换树脂吸附，用有机溶剂的酸水溶液洗脱，再通过大孔吸附树脂层析，然后用有机溶剂的微酸水溶液洗脱，最后通过结晶方式得到阿霉素成品。该方法制备的阿霉素成品，色谱含量仅为98％，单个杂质含量高达1.5％，远远达不到EP、USP标准(色谱含量要求99％以上，单个杂质含量低于0.10％)，且该工艺中的阿霉素原料来源要先通半合成或生物转化，工艺繁锁，成本高、周期长、收率低、不适宜产业化。所以，寻找一种简单而且能够制备高纯度阿霉素的纯化方法显得十分重要。

随着制药、生物化工等行业的迅速发展，制备型液相色谱分离技术得到越来越广泛的开发和应用，已成为分离和纯化复杂混合物的重要方法，尤其适用于制备组分复杂、副产物多、单个杂质难分离的生物发酵、生物转化产品。动态轴向压缩（DAC）制备技术具有多方面的优越性，因而得到了更为深入的研究和发展。DAC的核心技术是通过活塞的上下运动来装柱、维持柱压和卸柱，活塞周边配备了特殊设计的密封圈能容许活塞上下自由滑动，同进又能保持高的密封压。活塞运动和压力维持靠的是液压，液压动力比轴向压缩柱的弹簧动力更稳定，更均匀。这些技术使得它具有成本低、寿命长、柱效高、对称性和重复性好的特点，可以装填直径范围大（50mm～1000mm），且保持与分析柱相当的分离效果。但目前为止，尚未发现有任何文献报道采用制备色谱分离技术，特别是DAC制备技术分离纯化阿霉素产品。本发明在吸附色谱分离的基础上，进一步采用制备色谱技术，得到的阿霉素产品纯度高，符合EP和USP的标准，而且本发明工艺操作简单，生产成本低，收率高，完全适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备高纯度阿霉素的方法，该方法包括如下步骤：

（1）将预提纯的阿霉素溶液经大孔吸附树脂层析分离，所述大孔吸附树脂层析先采用酸性的低浓度的有机溶剂水溶液作为预洗液，预洗，再用酸性的高浓度的有机溶剂水溶液作为洗脱液，洗脱，收集阿霉素组分；

（2）将步骤（1）中得到的阿霉素组分用常规方法除去有机溶剂，再经过制备柱层析分离，所述制备柱层析采用酸性的有机溶剂的水溶液作为流动相，洗脱样品，分段收集含阿霉素的组分，即可得高纯度的阿霉素溶液；

（3）如有必要，将步骤（2）中得到的高纯度阿霉素溶液进行浓缩和析晶制得阿霉素晶体。

其中，步骤（1）所述预提纯的阿霉素溶液是通过以下方法制备得到的：

a).将阿霉素发酵液，用酸调pH值为酸性，过滤，得到预提纯的阿霉素溶液；该阿霉素发酵液可采用专利CN102363755A公开的方法，利用链霉菌（Streptomycessp.H323，保藏编号为CGMCCNO.4827）发酵制备得到；其中，阿霉素发酵液采用盐酸、硫酸或草酸调pH值为酸性，所述的pH值优选为0.5～3.0，更优选1.0～2.5；

或

b).将阿霉素粗品溶于水和/或有机溶剂，得到预提纯的阿霉素溶液，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、或它们的混合液；阿霉素粗品可采用专利US3803124公开的由柔红霉素化学半合成法制备得到的，或采用专利CN1147835A公开的由柔红霉素生物转化法制备得到。

其中，步骤（1）所述的大孔吸附树脂层析分离步骤包括吸附、预洗、洗脱三个过程。

在优选的实施方案中，其中所述的大孔吸附树脂优选聚苯乙烯类树脂，更优选HP20、XAD1180、XAD1600、H41、H60、CG161、HP20SS、HZ20SS、XAD-4、SP207或SP825树脂，更优选HP20、HZ20SS、XAD1180或SP207树脂。

在优选的实施方案中，其中所述的大孔吸附树脂层析分离的预洗过程采用酸性的低浓度的有机溶剂水溶液作为预洗液进行预洗，其中预洗液中有机溶剂的浓度优选为10～30%（V/V）。预洗过程以基本不洗出有效成分为准。

在优选的实施方案中，其中所述的大孔吸附树脂层析分离的洗脱过程使用酸性的高浓度的有机溶剂水溶液作为洗脱液进行洗脱，其中洗脱液中有机溶剂的浓度优选为40～70%（V/V）。

在优选的实施方案中，其中步骤（1）所述的预洗液和洗脱液中有机溶剂优选包括但不限于中等极性的有机溶剂，更优选甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇或乙腈，最优选乙醇或丙酮。

在优选的实施方案中，其中步骤（1）中所述的预洗液和洗脱液中的酸优选盐酸、硫酸、乙酸或磷酸，所述的预洗液和洗脱液的pH值优选为1.5～4.5，更优选2.0～3.5。

在优选的实施方案中，其中步骤（2）中所述的制备柱层析使用的制备柱优选为动态轴向压缩制备柱，其中动态轴向压缩制备柱的直径优选为50mm～1000mm，更优选直径为50mm、100mm、200mm、300mm、500mm、600mm或800mm各系列动态轴向压缩制备柱。

在优选的实施方案中，其中所述的制备柱层析使用的制备柱的填料优选C18、C8、C3、聚苯乙烯类或聚甲基丙烯酸酯类，更优选C18或C8。

在优选的实施方案中，其中所述制备柱的填料颗粒的粒径优选5μm、10μm、或50μm。

在优选的实施方案中，其中所述制备柱层析优选采用酸性的有机溶剂的水溶液作为流动相洗脱样品。其中流动相中有机溶剂的浓度优选为40～60%（V/V）；其中所述的流动相中有机溶剂优选包括但不限于中等极性的有机溶剂，更优选甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮，最优选为甲醇、乙腈；其中所述的流动相中的酸优选乙酸、盐酸或磷酸；其中所述的流动相的pH值优选为2.5～3.5。

在优选的实施方案中，其中步骤（2）中所述制备柱层析，其中进入制备柱的阿霉素的浓度为10～100mg/ml，优选50～80mg/ml。

在优选的实施方案中，其中步骤（2）中所述制备柱层析，其中制备柱的进料量为5～50g阿霉素/Kg填料，优选10～20g阿霉素/Kg填料。

本发明测定阿霉素含量及色谱纯度的方法采用高效液相色谱法，具体方法如下：

色谱柱：C18柱，5μm，4.6×250mm；

流动相：缓冲液:乙腈:甲醇=500:500:60；

缓冲液：取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml溶于500ml超纯水中；

流速：1.35ml/min；

检测波长：254mn；

进样量：10μl。

采用本发明所述的工艺制备得到的阿霉素产品，经高效液相色谱法检测，阿霉素的色谱含量可达99.5%以上，单个杂质的色谱含量在0.10%以下，产品符合EP、USP标准。

相对现有技术，本发明具有以下优点：

阿霉素发酵液成分复杂、副产物多、单个杂质分离难度大，本发明先采用吸附色谱柱分离，接着采用制备色谱柱进一步分离纯化，特别是采用动态轴向压缩（DAC）制备分离技术，很好的结解决了这个难题。现有技术，如美国专利US4,861,870公开的阿霉素提纯方法，制备得到的阿霉素纯度只有98%左右，杂质含量高达1.5%，不符合EP、USP的标准，而采用本发明的方法，制备得到的阿霉素色谱含量在99.5%以上，单杂含量在0.10%以下，满足EP、USP的标准，而且本发明的方法工艺操作简单，生产成本低，收率高，非常适合工业化生产。

附图说明：

图1：实施例1阿霉素发酵液的HPLC色谱图

图2：实施例10制备得到的阿霉素洗脱液的HPLC色谱图

图3：实施例18阿霉素过制备柱后收集的目标组分的HPLC色谱图

图4：实施例12制备得到的高纯度阿霉素的¹HNMR图谱

图5：实施例12制备得到的高纯度阿霉素的¹³CNMR图谱

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

具体实施方式

实施例1

阿霉素发酵液2000升，加1N的盐酸调pH为1.0进行酸化，酸化3小时后，板框过滤，得预提纯的溶液1650升，经HPLC检测，含阿霉素1000g，色谱含量为16%。预提纯的溶液用100升HP20树脂吸附，吸附完毕后，用300升10%（V/V）的乙醇水溶液，并用盐酸调pH值为2.0作为预洗液，预洗，再用400升50%（V/V）的乙醇水溶液，用盐酸调pH值为2.0作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液300升。所得洗脱液中含阿霉素800g，色谱含量为79%。

实施例2

阿霉素发酵液2000升，加草酸调pH为2.5进行酸化，酸化3小时后，离心机过滤，得预提纯的溶液1700升，经HPLC检测，含阿霉素850g，色谱含量为18%。预提纯的溶液用80升XAD1180树脂吸附，吸附完毕后，用240升20%（V/V）的丙酮水溶液，并用乙酸调pH为3.5作为预洗液，预洗，再用320升40%（V/V）的丙酮水溶液，并用乙酸调pH为3.5作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液240升。所得洗脱液中含阿霉素680g，色谱含量为80%。

实施例3

阿霉素发酵液2000升，加1N盐酸调pH为3.0进行酸化，酸化3小时后，陶瓷膜过滤，再经纳滤，得预提纯的溶液3000升，经HPLC检测，含阿霉素800g，色谱含量为15%。预提纯的溶液用80升H41树脂吸附，吸附完毕后，用240升30%（V/V）的甲醇水溶液，并用硫酸调pH为1.5作为预洗液，预洗，再用320升70%(V/V)的甲醇水溶液，并用硫酸调pH为1.5作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液250升。所得洗脱液中含阿霉素600g，色谱含量为74%。

实施例4

阿霉素发酵液2000升，加1N的硫酸调pH为0.5进行酸化，酸化3小时后，板框过滤，得预提纯的溶液1800升，经HPLC检测，含阿霉素750g，色谱含量为19%。预提纯的溶液用60升H60树脂吸附，吸附完毕后，用180升25%（V/V）的异丙醇水溶液，并用磷酸调pH为4.5作为预洗液，预洗，再用240升55%（V/V）的异丙醇水溶液，并用磷酸调pH为4.5作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液200升。所得洗脱液中含阿霉素580g，色谱含量为74.5%。

实施例5

阿霉素发酵液2000升，加草酸调pH为2.0进行酸化，酸化3小时后，板框过滤，得预提纯的溶液1850L，经HPLC检测，含阿霉素900g，色谱含量为17%。预提纯的溶液用80升CG161树脂吸附，吸附完毕后，用240升30%（V/V）的乙腈水溶液，并用盐酸调pH为4.0作为预洗液，预洗，再用320升60%（V/V）的乙腈水溶液，并用盐酸调pH为4.0作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液260升。所得洗脱液中含阿霉素700g，色谱含量为76%。

实施例6

阿霉素发酵液2000升，加1N的盐酸调pH为1.0进行酸化，酸化3小时后，板框过滤，得预提纯的溶液1750升，经HPLC检测，含阿霉素880g，色谱含量为20%。预提纯的溶液用80升XAD1600树脂吸附，吸附完毕后，用240升20%（V/V）的丙酮水溶液，并用乙酸调pH为3.0作为预洗液，预洗，再用300升45%（V/V）的丙酮水溶液，并用乙酸调pH为3.0作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液200升。所得洗脱液中含阿霉素660g，色谱含量为76.5%。

实施例7

阿霉素发酵液2000升，加草酸调pH为2.5进行酸化，酸化3小时后，离心机过滤，得预提纯的溶液1800升，经HPLC检测，含阿霉素1050g，色谱含量为18%。预提纯的溶液用100升XAD-4树脂吸附，吸附完毕后，用300升30%（V/V）的甲醇水溶液，并用磷酸调pH为1.8作为预洗液，预洗，再用450升65%（V/V）的甲醇水溶液，并用磷酸调pH为1.8作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液350升。所得洗脱液中含阿霉素790g，色谱含量为75%。

实施例8

阿霉素发酵液2000升，加1N盐酸调pH为3.0进行酸化，酸化3小时后，陶瓷膜过滤，再经纳滤，得预提纯的溶液3500升，经HPLC检测，含阿霉素950g，色谱含量为17%。预提纯的溶液用100升HP20SS树脂吸附，吸附完毕后，用300升30%（V/V）的异丙醇水溶液，并用乙酸调pH为3.8作为预洗液，预洗，再用400升60%（V/V）的异丙醇水溶液，并用乙酸调pH为3.8作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液300升。所得洗脱液中含阿霉素710g，色谱含量为77%。

实施例9

阿霉素发酵液2000升，加1N的硫酸调pH为0.5进行酸化，酸化3小时后，板框过滤，得预提纯的溶液1600升，经HPLC检测，含阿霉素780g，色谱含量为15%。预提纯的溶液用80升SP825树脂吸附，吸附完毕后，用240升30%（V/V）的乙腈水溶液，并用硫酸调pH为2.8作为预洗液，预洗，再用320升65%（V/V）的乙腈水溶液，并用硫酸调pH为2.8作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液240升。所得洗脱液中含阿霉素585g，色谱含量为73%。

实施例10

阿霉素发酵液2000升，加草酸调pH为2.0进行酸化，酸化3小时后，板框过滤，得预提纯的溶液1750L，经HPLC检测，含阿霉素1100g，色谱含量为18%。预提纯的溶液用100升HZ20SS树脂吸附，吸附完毕后，用300升25%（V/V）的乙醇水溶液，并用乙酸调pH为2.5作为预洗液，预洗，再用400升55%（V/V）的，并用乙酸调pH为2.5作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液300升。所得洗脱液中含阿霉素880g，色谱含量为81%。

实施例11

阿霉素发酵液2000升，加1N盐酸调pH为3.0进行酸化，酸化3小时后，陶瓷膜过滤，再经纳滤，得预提纯的溶液1800升，经HPLC检测，含阿霉素1150g，色谱含量为19%。预提纯的溶液用100升SP207树脂吸附，吸附完毕后，用300升30%（V/V）的丙酮水溶液，并用盐酸调pH为3.2作为预洗液，预洗，再用380升60%（V/V）丙酮水溶液，并用盐酸调pH为3.2作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液250升。所得洗脱液中含阿霉素920g，色谱含量为80%。

实施例12

按实施例1的方法处理得到的洗脱液250升，洗脱液中含阿霉素700g，色谱含量为79%。减压浓缩洗脱液得到14升浓缩液，浓缩液浓度为50mg/ml。浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC300，填料采用Kromasil10μmC18，装柱总量13Kg，装柱高度25cm，单次上样量15g/Kg填料，即195g阿霉素（进样速度760mg/s，进样时间4.3min），采用60%（V/V）的甲醇水溶液，并用乙酸调pH为2.5作为流动相，洗脱流速2500ml/min，按照每针接样试验，总结出接样方式为：每个主峰从电压上升到150mv后的4min开始收集目标组分，直至电压降到100mv结束，共收集合格的目标组分250L，经HPLC检测，含阿霉素420g，单个最大杂质色谱含量0.07%，阿霉素色谱含量99.7%。收集的目标组分减压浓缩至2.1升，浓缩液浓度200mg/ml，加8.4升丙酮（4倍体积）搅拌析晶2h，过滤、干燥，得固体的高纯度阿霉素402g。

实施例13

按实施例2的方法处理得到的洗脱液180升，洗脱液中含阿霉素500g，色谱含量为80%。减压浓缩洗脱液得到6.2升浓缩液，浓缩液浓度为80mg/ml。浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC200，填料采用Kromasil10μmC18，装柱总量6Kg，装柱高度25cm，单次上样量10g/Kg填料，即60g阿霉素(进样速度250mg/s，进样时间4.0min)，采用55%（V/V）的乙腈水溶液，并用盐酸调pH为3.0作为流动相，洗脱流速1200ml/min，共收集合格的目标组分150升，经HPLC检测，含阿霉素300g，单个最大杂质色谱含量0.08%，阿霉素色谱含量99.6%。收集的目标组分减压浓缩至1.5升，浓缩液浓度200mg/ml，加6升异丙醇（4倍体积）搅拌析晶2h，过滤、干燥，得固体的高纯度阿霉素240g。

实施例14

按实施例3的方法处理得到的洗脱液100升，洗脱液中含阿霉素250g，色谱含量为74%。减压浓缩洗脱液得到8.3升浓缩液，浓缩液浓度为30mg/ml。浓缩液过制备柱，制备柱柱型号DAC100，填料采用Bakerbond10μmC18，装柱总量1.5Kg，装柱高度25cm，单次上样量5g/Kg填料，即7.5g阿霉素(进样速度30mg/s，进样时间4.2min)，采用40%（V/V）的丙酮水溶液，并用磷酸调pH为3.5作为流动相，洗脱流速300ml/min，共收集合格的目标组分80升，经HPLC检测，含阿霉素140g，单个最大杂质色谱含量0.07%，阿霉素色谱含量99.7%。收集的目标组分减压浓缩至700毫升，浓缩液浓度200mg/ml，加2.8升乙醇（4倍体积）搅拌析晶2h，过滤、干燥，得固体的高纯度阿霉素115g。

实施例15

按实施例4的方法处理得到的洗脱液300升，洗脱液中含阿霉素1000g，色谱含量为74.5%。减压浓缩洗脱液得到10升浓缩液，浓缩液浓度为100mg/ml，浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC300，填料采用Kromasil10μmC8，装柱总量13Kg，装柱高度25cm，单次上样量50g/Kg填料，即650g阿霉素（进样速度2550mg/s，进样时间4.2min），采用50%（V/V）的乙醇水溶液，并用乙酸调pH为3.0作为流动相，洗脱流速2500ml/min，共收集合格的目标组分200升，经HPLC检测，含阿霉素550g，单个最大杂质色谱含量0.09%，阿霉素色谱含量99.5%。收集的目标组分减压浓缩至2.75升，浓缩液浓度200mg/ml，加11升乙腈（4倍体积）搅拌析晶2h，过滤、干燥，得固体的高纯度阿霉素500g。

实施例16

按实施例5的方法处理得到的洗脱液150升，洗脱液中含阿霉素400g，色谱含量为76%。减压浓缩洗脱液得到40升浓缩液，浓缩液浓度为10mg/ml。浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC200，填料采用Kromasil10μmC18，装柱总量6Kg，装柱高度25cm，单次上样量20g/Kg填料，即120g阿霉素（进样速度500mg/s，进样时间4.0min），采用50%（V/V）的异丙醇水溶液，并用磷酸调pH为3.0作为流动相，洗脱流速1200ml/min，共收集合格的目标组分120升，经HPLC检测，含阿霉素220g，单个最大杂质色谱含量0.08%，阿霉素色谱含量99.6%。收集的目标组分减压浓缩至1.1升，浓缩液浓度200mg/ml，加4.4升甲醇（4倍体积）搅拌析晶2h，过滤、干燥，得固体的高纯度阿霉素200g。

实施例17

按实施例6的方法处理得到的洗脱液120升，洗脱液中含阿霉素300g，色谱含量为76.5%。减压浓缩洗脱液得到500毫升浓缩液，浓缩液浓度为60mg/ml。浓缩液过制备柱，制备柱柱型号DAC100，填料采用Bakerbond10μmC18，装柱总量1.5Kg，装柱高度25cm，单次上样量30g/Kg填料，即45g阿霉素（进样速度180mg/s，进样时间4.2min），采用55%（V/V）的乙腈水溶液，并用盐酸调pH为3.5作为流动相，洗脱流速300ml/min，共收集合格的目标组分100升，经HPLC检测，含阿霉素165g，单个最大杂质色谱含量0.08%，阿霉素色谱含量99.6%。收集的目标组分减压浓缩至825毫升，浓缩液浓度200mg/ml，加3.3升丙酮（4倍体积）搅拌析晶2h，过滤、干燥，得固体的高纯度阿霉素145g。

实施例18

按实施例10的方法处理得到的洗脱液320升，洗脱液中含阿霉素1100g，色谱含量为81%。减压浓缩洗脱液得到55升浓缩液，浓缩液浓度为20mg/ml，浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC300，填料采用Kromasil10μmC8，装柱总量13Kg，装柱高度25cm，单次上样量20g/Kg填料，即260g阿霉素（进样速度1050mg/s，进样时间4.2min），采用45%（V/V）的丙酮水溶液，并用盐酸调pH为2.5作为流动相，洗脱流速2500ml/min，共收集合格的目标组分300升，经HPLC检测，含阿霉素880g，单个最大杂质色谱含量0.05%，阿霉素色谱含量99.8%。

实施例19

按实施例11的方法处理得到的洗脱液200升，洗脱液中含阿霉素600g，色谱含量为80%。减压浓缩洗脱液得到12升浓缩液，浓缩液浓度为50mg/ml。浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC200，填料采用Kromasil10μmC18，装柱总量6Kg，装柱高度25cm，单次上样量30g/Kg填料，即180g阿霉素（进样速度750mg/s，进样时间4.0min），采用55%（V/V）的甲醇水溶液，并用磷酸调pH为2.5作为流动相。洗脱流速1200ml/min，共收集合格的目标组分150升，经HPLC检测，含阿霉素360g，单个最大杂质色谱含量0.04%，阿霉素色谱含量99.9%。

实施例20

参考专利US3803124公开的由柔红霉素化学半合成法制备得到的阿霉素粗品1500g溶于100升无离子水，得到预提纯的阿霉素溶液，经HPLC检测，含阿霉素1000g，色谱纯度78%（V/V）。

预提纯的阿霉素溶液用100升H41树脂吸附，吸附完毕后，用300升30%（V/V）的甲醇水溶液，并用盐酸调pH为2.5作为预洗液，预洗，再用300升70%(V/V)的甲醇水溶液，并用盐酸调pH为2.5作为洗脱液，洗脱，收集合格洗脱液200升。所得洗脱液中含阿霉素800g，色谱含量为97%。

减压浓缩洗脱液得到20升浓缩液，浓缩液浓度为40mg/ml，浓缩液过制备柱，制备柱柱型号为DAC300，填料采用Kromasil10μmC8，装柱总量13Kg，装柱高度25cm，单次上样量30g/Kg填料，即290g阿霉素（进样速度1100mg/s，进样时间4.4min），采用45%（V/V）的丙酮水溶液，并用盐酸调pH为2.5作为流动相，洗脱流速2500ml/min，共收集合格的目标组分300升，经HPLC检测，含阿霉素640g，单个最大杂质色谱含量0.05%，阿霉素色谱含量99.7%。

Claims (10)

1.一种制备阿霉素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将预提纯的阿霉素溶液经大孔吸附树脂层析分离，所述大孔吸附树脂层析先采用酸性低浓度的有机溶剂水溶液作为预洗液，预洗，再用酸性高浓度的有机溶剂水溶液作为洗脱液，洗脱，收集阿霉素组分；

其中，所述预洗液中有机溶剂的浓度为10～30％(V/V)；所述洗脱液中有机溶剂浓度为40～70％(V/V)；所述预洗液和洗脱液中的酸选自盐酸、硫酸、乙酸或磷酸；所述预洗液和洗脱液的pH值为1.5～4.5；所述预洗液和洗脱液中有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇或乙腈；

(2)将步骤(1)中得到的阿霉素组分用常规方法除去有机溶剂，再经过制备柱层析分离，所述制备柱层析采用酸性有机溶剂的水溶液作为流动相，洗脱样品，分段收集含阿霉素的组分，即可得阿霉素溶液；

其中，所述制备柱层析使用的制备柱为动态轴向压缩制备柱，其中动态轴向压缩制备柱的直径为50mm～1000mm，所述的制备柱层析使用的制备柱的填料为C18、C8、C3、聚苯乙烯类或聚甲基丙烯酸酯类；

其中，所述流动相中有机溶剂的浓度为40～60％(V/V)；

其中，所述流动相中的酸选自乙酸、盐酸或磷酸；所述流动相的pH值为2.5～3.5；所述流动相中有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇或丙酮。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)所述预提纯的阿霉素溶液是通过以下方法制备得到的：

a).将阿霉素发酵液，用酸调pH值为酸性，过滤，得到预提纯的阿霉素溶液；或

b).将阿霉素粗品溶于水和/或有机溶剂，得到预提纯的阿霉素溶液，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、或它们的混合液。

3.根据权利要求2的方法，其中方法a)中调pH值采用的酸选自盐酸、硫酸或草酸；所述pH值为0.5～3.0。

4.根据权利要求3的方法，其中所述pH值为1.0～2.5。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述大孔吸附树脂为聚苯乙烯类树脂。

6.根据权利要求5的方法，其中所述大孔吸附树脂为HP20、XAD1180、XAD1600、H41、H60、CG161、HP20SS、HZ20SS、XAD-4、SP207或SP825树脂。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，所述预洗液和洗脱液的pH值为2.0～3.5。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，所述动态轴向压缩制备柱的直径为50mm、100mm、200mm、300mm、500mm、600mm或800mm。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述制备柱层析，其中进入制备柱的阿霉素的浓度为10～100mg/ml。

10.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述制备柱层析，其中制备柱的进料量为5～50g阿霉素/Kg填料。