CN109206309A - 一种盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法。采用以下步骤：（1）破坏试验：称取盐酸多柔比星原料药，加入氢氧化钠溶液，室温放置24小时，加入流动相溶液，混合，过滤；（2）半制备液相色谱法分离制备杂质收集杂质1和杂质2，馏分均通过HPLC进行跟踪监测；（3）纯化：步骤（2）收集的杂质1和杂质2在HPLC跟踪监测确认后，合并浓缩，固相萃取纯化，合并纯化后的杂质1和杂质2甲醇洗脱液，蒸干，得到杂质1和杂质2。本发明通过半制备液相色谱、固相萃取、高效液相色谱、高分辨质谱等多种技术，对这两种杂质进行了分离、制备、浓缩、纯化、检测和鉴定，填补了该环节技术空白，对于盐酸多柔比星的质量控制具有重要的意义。

Description

一种盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及药物分析和药物制剂领域，具体涉及一种盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法。

技术背景

盐酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride），化学名(8S, 10S)-10-[(3-氨基-2、3、6-三去氧基-α-L-来苏己吡喃基)-氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮盐酸盐，分子式为C₂₇H₂₉NO₁₁·HCl，CAS号为25316-40-9。盐酸多柔比星是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，主要适用于急性白血病。盐酸多柔比星结构式如下：

盐酸多柔比星

目前盐酸多柔比星的商用制剂为注射用盐酸多柔比星(冻干)，由意大利辉瑞制药公司在全球销售，包括中国。在对盐酸多柔比星的质量研究中发现了两个未知杂质峰，，超过了法规要求限度，影响了产品的质量，需要进行质量控制。

发明内容

为解决目前盐酸多柔比星质量控制中存在的问题，本发明通过半制备液相色谱、固相萃取、高效液相色谱、高分辨质谱等多种技术，对这两种杂质进行了分离、制备、浓缩、纯化、检测和鉴定，这两种杂质可以在多柔比星制剂质量检测中作为杂质对照品。

本发明的技术方案为：

一种盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法，盐酸多柔比星分离纯化出的杂质1和杂质2的结构式分别为：

杂质1结构式

杂质2结构式。

一种上述盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法，所述分离纯化方法采用以下步骤：

（1）破坏试验：称取盐酸多柔比星原料药，加入氢氧化钠溶液，室温放置24小时，然后加入流动相溶液，混合均匀，过滤；

（2）半制备液相色谱法分离制备杂质：在半制备液相色谱仪工作站中，收集杂质1和杂质2，收集的杂质1和杂质2馏分均通过HPLC进行跟踪监测；

（3）纯化：步骤（2）收集的杂质1和杂质2在HPLC跟踪监测确认后，合并浓缩，固相萃取纯化，合并纯化后的杂质1和杂质2甲醇洗脱液，蒸干，得到杂质1和杂质2，低温保存。

优选地，步骤(1)所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.01mol/L，所述盐酸多柔比星原料药与氢氧化钠溶液的质量体积比为0.5g：500mL；所述盐酸多柔比星原料药与流动相溶液的质量体积比为0.5：375mL。

优选地，步骤（1）所述的流动相溶液为乙腈–含十二烷基硫酸钠的磷酸溶液；其中所述乙腈和含十二烷基硫酸钠的磷酸溶液的体积比为40:60；所述流动相的制备方法为取2.88g十二烷基硫酸钠和2.25g磷酸，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调pH值为1.5。

优选地，步骤（2）所述的半制备液相色谱条件为：

仪器：Agilent1200半制备液相色谱仪；色谱柱：Agilent C₁₈柱（Agilent Eclipse XDBC₁₈, 9.4×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液为40:60，等度洗脱；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：2mL/min；进样量：400μL；所述流动相的制备方法为取2.88g十二烷基硫酸钠和2.25g磷酸，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调pH值至1.5。

优选地，步骤（2）所述的HPLC进行跟踪监测的色谱条件为：仪器：ThermoUltiMate3000双三元液相色谱系统；色谱柱：Agilent C₁₈柱（Agilent ZORBAX SB-C₁₈, 4.6×250mm, 5µm）；流动相：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液（取2.88g十二烷基硫酸钠和2.25g磷酸，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调pH值至1.5）= 40:60，等度洗脱；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：1mL/min；进样量：20μL。

优选地，步骤（3）所述的浓缩样品的方法为：采用旋转蒸发仪浓缩样品，水浴锅温度控制在30℃，旋转蒸发仪初始压强设置为150 mbar，使其逐渐下降到20mbar。

优选地，步骤（3）所述的蒸干样品的方法为：采用旋转蒸发仪30℃下蒸干样品，将样品倒出后剩余残渣以少量甲醇溶解，转移至离心管中，置于离心浓缩仪中浓缩至干燥。

一种上述的盐酸多柔比星制剂杂质的鉴定方法，采用以下步骤：

（1）采用Orbitrap高分辨质谱仪，得到质量数和准确碎片离子信息；

（2）理论同位素与实测同位素分布比较，得到杂质1和杂质2的分子式；

（3）使用结构解析软件对母离子进行模拟碎裂，与实测的二级质谱图进行匹配；

（4）分析杂质1和杂质2的质谱裂解机理，得到杂质1和杂质2的质量数和化学物结构。

一种上述盐酸多柔比星制剂杂质的应用，所述杂质在盐酸多柔比星制剂质量检测中作为杂质对照品。

有益效果

本发明通过半制备液相色谱、固相萃取、高效液相色谱、高分辨质谱等多种技术，对这两种杂质进行了分离、制备、浓缩、纯化、检测和鉴定，填补了该环节技术空白，对于盐酸多柔比星的质量控制具有重要的意义。

附图说明

图1 半制备液相色谱图；

图2 盐酸多柔比星破坏样品HPLC色谱图；

图3 半制备液相收集的杂质1 HPLC监测色谱图；

图4 半制备液相收集的杂质2 HPLC监测色谱图；

图5杂质1 SPE甲醇洗脱液HPLC监测图；

图6杂质2 SPE甲醇洗脱液HPLC监测图；

图7 原研制剂的杂质1一级质谱图；

图8 原研制剂的杂质1二级质谱图；

图9 原研制剂的杂质2一级质谱图；

图10原研制剂的杂质2二级质谱图；

图11 原料药的杂质1 一级质谱图；

图12 原料药的杂质1二级质谱图；

图13 原料药的杂质2一级质谱图；

图14 原料药的杂质2二级质谱图；

图15 杂质1元素组成分析和分子式推断；

图16 杂质2元素组成分析和分子式推断；

图17 杂质1理论同位素分布；

图18 杂质2理论同位素分布；

图19 杂质1实测同位素分布；

图20 杂质2实测同位素分布；

图21 杂质1结构；

图22 杂质2结构；

图23 杂质1 二级质谱图及碎片结构预测；

图24杂质2 二级质谱图及碎片结构预测；

图25 杂质1理论和实测的前体离子及碎片离子的质量数偏差；

图26 杂质2理论和实测的前体离子及碎片离子的质量数偏差；

图27 杂质1碎片离子[M+H]⁺ 377.0656裂解机理；

图28杂质1碎片离子[M+H]⁺ 367.0812裂解机理；

图29杂质1碎片离子[M+H]⁺ 349.0707裂解机理；

图30杂质1碎片离子[M+H]⁺321.0757裂解机理；

图31杂质2碎片离子[M+H]⁺365.0656裂解机理；

图32杂质2碎片离子[M+H]⁺350.0421裂解机理；

图33杂质2碎片离子[M+H]⁺337.0707裂解机理；

图34杂质2碎片离子[M+H]⁺321.0757裂解机理；

图35杂质2碎片离子[M+H]⁺309.0757裂解机理；

图36杂质2碎片离子[M+H]⁺217.0495裂解机理。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明技术方案，在围绕本发明所描述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。

实施例1

1. 仪器与试药

仪器：Agilent1200半制备液相色谱仪（Agilent，美国）；Thermo UltiMate3000双三元液相色谱系统（Thermo，美国）；Orbitrap Fusion Tribrid 高分辨质谱仪（Thermo，美国）；Buchi R210旋转蒸发仪（Buchi，瑞士）；Agilent SPE固相萃取装置（Agilent，美国）；Labconco Centrivap离心浓缩仪（Labconco，美国）；Milli-Q Advantage A10超纯水系统（Millipore，美国）

试剂耗材：Waters Oasis WAX 阴离子交换SPE柱（60mg/3ml）（Waters，美国）；乙腈购自Honeywell（美国）；分析纯磷酸（≧85.0%）、十二烷基硫酸钠（≧86.0%）均购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。盐酸多柔比星原料药（纯度：99.5%，道中道(菏泽)药业有限公司，菏泽，中国）。

破坏试验

准确称取0.5g盐酸多柔比星原料药，置500ml具塞锥形瓶中，加入75ml 0.01mol/L的NaOH溶液，室温放置24小时，然后加入375ml流动相溶液：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液（取28.8g十二烷基硫酸钠和22.5g磷酸，加水溶解并稀释至10 000ml，以磷酸调pH值至1.5）= 40:60，混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤。

半制备液相色谱法分离制备杂质。

在Agilent1200半制备液相色谱仪工作站中，设置馏分收集器，按照时间窗口收集馏分，使其自动收集图1中的杂质1和杂质2。收集的杂质样品保存在-40℃冰箱中。

半制备液相色谱条件：

仪器：Agilent1200半制备液相色谱仪；色谱柱：Agilent C₁₈柱（Agilent Eclipse XDBC₁₈, 9.4×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液（取28.8g十二烷基硫酸钠和22.5g磷酸，加水溶解并稀释至10 000ml，以磷酸调pH值至1.5）= 40:60，等度洗脱；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：2mL/min；进样量：400μL。

监测

研究过程中进行HPLC跟踪监测，确保杂质1和杂质2的存在。采用一台ThermoUltiMate3000双三元液相色谱系统为整个试验中的杂质1和杂质2提供色谱法监测。

每次制备液相进样收集的杂质1和杂质2馏分均通过HPLC进行跟踪监测，确保馏分收集准确、时间窗口合适，杂质出峰良好。破坏后的样品、杂质1和杂质2的HPLC色谱图如图2-图4所示。

HPLC色谱条件为：

仪器：Thermo UltiMate3000双三元液相色谱系统；色谱柱：Agilent C₁₈柱（AgilentZORBAX SB-C₁₈, 4.6×250mm, 5µm）；流动相：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液（取2.88g十二烷基硫酸钠和2.25g磷酸，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调pH值至1.5）= 40:60，等度洗脱；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：1mL/min；进样量：20μL。

浓缩和纯化

每批收集的杂质1和杂质2在HPLC跟踪监测和确认后，分别合并杂质1和杂质2，以旋转蒸发仪浓缩样品。水浴锅温度控制在30℃，旋转蒸发仪初始压强设置为150 mbar，然后手动设置压强值，在保证不出现爆沸的情况下，使其逐渐下降到20mbar。约浓缩至原体积的1/5时，停止旋蒸，转移浓缩样品溶液至小烧杯中，准备进行固相萃取(SPE)纯化。取固相萃取完的浓缩样品溶液进行HPLC跟踪监测。

使用Waters Oasis WAX 阴离子交换SPE柱（60mg/3ml）进行固相萃取。将固相萃取小柱连接到真空过柱装置，使用前依次用3ml甲醇和3ml水活化。将上述浓缩样品溶液上柱，用12ml水洗涤柱子并彻底抽干，最后用0.5ml的甲醇洗脱小柱上的成分。流速控制在0.5ml/min。洗脱液以HPLC跟踪监测和确认，色谱图见图5-6所示。留取部分甲醇洗脱液以供高分辨质谱分析。

分别合并所有的杂质1和杂质2甲醇洗脱液，使用旋转蒸发仪在30℃下蒸干样品，残渣以少量甲醇溶解，转移至离心管中，置于离心浓缩仪中浓缩至干，得到杂质1和杂质2的固体。密封好，将其置于干燥器中，存放在-40℃冰箱中。

鉴定

通过蠕动泵，将留取的杂质1和杂质2甲醇洗脱液注入到Orbitrap Fusion Tribrid高分辨质谱中进行分析。

质谱条件为：

H-ESI正离子模式，喷雾电压3800V，鞘气20arb，辅助气5arb，扫尾气0arb，离子传输管温度320℃，喷雾器温度50℃，一级质谱和二级质谱扫描分辨率均为120000 (FWHM at 200m/z)。一级质谱扫描范围为m/z 100-800，射频透镜电压RF Lens%设为60，自动增益控制AGCTarget设为2.0e5，最大注入时间Max IT设为100ms，微扫描Microscan设为1。二级质谱扫描，隔离窗口Isolation window设为0.8，RF Lens%设为60，AGC Target设为5.0e4，Max IT设为100ms，微扫描Microscan设为1。

具体解析过程如下：

采用Orbitrap高分辨质谱仪，通过对样品的高精度一级、二级质谱扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息，原研制剂、原料药的杂质1和杂质2的质谱图如图7-图14所示。通过比对高分辨一级、二级质谱图可以发现，原研制剂和原料药的杂质1是同一物质，二者的杂质2亦是同一物质。杂质1的准确质量数为395.0759，杂质2的准确质量数为383.0759。由于多柔比星分子结构中仅含C、H、O、N四种元素，因此其破坏后的杂质中也应只有这四种元素。使用ThermoXcalibur软件计算[M+H]⁺ 395.0759和[M+H]⁺ 383.0759分别对应的可能的分子式，如图15-图16所示。图中的分子式从上到下，按照质量偏差从小到大排列，排名越靠上，其质量偏差越小，可能性也就越大。由于主成分结构中仅有一个N原子，杂质1首先排除C₂₀H₉O₃N₇，杂质2首先排除C₁₉ H₉O₃N₇，因此杂质1的首选分子式为C₂₁H₁₅O₈，杂质2的首选分子式为C₂₀H₁₅O₈。由于图中分子式是根据[M+H]⁺质量数计算得到，实际的分子式须扣除一个H原子，因此杂质1和杂质2的首选分子式应分别为C₂₁H₁₄O₈和C₂₀H₁₄O₈。

（1）计算C₂₁H₁₄O₈和C₂₀H₁₄O₈的理论同位素分布（图17-图18），与杂质1和杂质2的实测同位素分布比较（图19-图20）。杂质1的单一同位素离子准确质量数理论值分别为[M+H]⁺ 395.0761, 396.0795, 397.0829，实测值分别为[M+H]⁺ 395.0759, 396.0793, 397.0820，由此计算同位素离子理论和实测值的质量数偏差分别为0.51ppm、0.50ppm和2.27ppm（可信区间为5ppm）。而杂质1的同位素离子丰度比理论值为100：23：3，实测值为100：23：4；杂质2的单一同位素离子准确质量数理论值分别为[M+H]⁺ 383.0761, 384.0795, 385.0829，实测值分别为[M+H]⁺ 383.0759, 384.0793, 385.0816，由此计算同位素离子理论和实测值的质量数偏差分别为0.52ppm、0.52ppm和3.38ppm（可信区间为5ppm）。而杂质2的同位素离子丰度比理论值为100：23：3，实测值为100：22：3。综合以上分析，多柔比星这两个杂质无论是单一同位素离子质量数还是同位素离子丰度比，理论值和实测值都能高度匹配，表明这两个分子式具有较大的可能性。因此选定这两个分子式作进一步研究。

（2）查询数据库网站http://www.chemicalbook.com/、http://www.chemspider.com/中收载的C₂₁H₁₄O₈和C₂₀H₁₄O₈所对应的结构式。结合主成分结构式判断，上述两个数据库网站能查到的C₂₁H₁₄O₈和C₂₀H₁₄O₈所对应的结构式均非多柔比星破坏得到，因此这两个杂质极有可能是新化合物。由于主成分结构中的取代基相对单一，我们根据杂质1和杂质2的分子式，推断出其结构式，如图21-图22所示。

（3）使用结构解析软件对母离子进行模拟碎裂，预测碎片结构，然后与实测的二级质谱图进行匹配，二级质谱碎片离子结构匹配图见23-图24所示，理论和实测的前体离子及碎片离子的质量数偏差见图25-图26所示。由图中可以看出，结构解析软件预测的碎片离子结构和实测的二级质谱图高度匹配，主要的碎片离子均能匹配成功，表明图21-图22结构式很可能即是杂质1和杂质2的结构。

（4）分析杂质1和杂质2的质谱裂解机理，进一步推断化学物结构。图27-图36给出了杂质1和杂质2的详细裂解机理，裂解方式合理，裂解后产生的碎片离子质量数和实测值一致，由此证明图21-22结构式即是杂质1和杂质2的结构。表1总结了杂质1和杂质2的前体离子和二级碎片离子的准确质量数及其结构式。

表1 多柔比星杂质1和杂质2的前体离子和碎片离子的准确质量数及其结构式

本发明通过半制备液相色谱、固相萃取、高效液相色谱、高分辨质谱等多种技术，对这两种杂质进行了分离、制备、浓缩、纯化、检测和鉴定，填补了该环节技术空白，在盐酸多柔比星的质量控制中取得了重要的意义。

Claims (10)

1.一种盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法，其特征在于，盐酸多柔比星分离纯化出的杂质1和杂质2的结构式分别为：

杂质1结构式；

杂质2结构式。

2.一种权利要求1所述的盐酸多柔比星杂质的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法采用以下步骤：

（1）破坏试验：称取盐酸多柔比星原料药，加入氢氧化钠溶液，室温放置24小时，然后加入流动相溶液，混合均匀，过滤；

（2）半制备液相色谱法分离制备杂质：在半制备液相色谱仪工作站中，收集杂质1和杂质2，收集的杂质1和杂质2馏分均通过HPLC进行跟踪监测；

（3）纯化：步骤（2）收集的杂质1和杂质2在HPLC跟踪监测确认后，合并浓缩，固相萃取纯化，合并纯化后的杂质1和杂质2甲醇洗脱液，蒸干，得到杂质1和杂质2，低温保存。

3.根据权利2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.01mol/L，所述盐酸多柔比星原料药与氢氧化钠溶液的质量体积比为0.5g：500mL；所述盐酸多柔比星原料药与流动相溶液的质量体积比为0.5：375mL。

4.根据权利2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）所述的流动相溶液为乙腈–含十二烷基硫酸钠的磷酸溶液；其中所述乙腈和含十二烷基硫酸钠的磷酸溶液的体积比为40:60；所述流动相的制备方法为取2.88g十二烷基硫酸钠和2.25g磷酸，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调pH值为1.5。

5.根据权利2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）所述的半制备液相色谱条件为：

仪器：Agilent1200半制备液相色谱仪；色谱柱：Agilent C₁₈柱（Agilent Eclipse XDBC₁₈, 9.4×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液为40:60，等度洗脱；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：2mL/min；进样量：400μL；所述流动相的制备方法为取2.88g十二烷基硫酸钠和2.25g磷酸，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调pH值至1.5。

6.根据权利2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）所述的HPLC进行跟踪监测的色谱条件为：仪器：Thermo UltiMate3000双三元液相色谱系统；色谱柱：Agilent C₁₈柱（Agilent ZORBAX SB-C₁₈, 4.6×250mm, 5µm）；流动相：乙腈–含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸溶液的体积比为40:60，等度洗脱；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：1mL/min；进样量：20μL。

7.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）所述的浓缩样品的方法为：采用旋转蒸发仪浓缩样品，水浴锅温度控制在30℃，旋转蒸发仪初始压强设置为150mbar，使其逐渐下降到20mbar。

8.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）所述的蒸干样品的方法为：采用旋转蒸发仪30℃下蒸干样品，将样品倒出后剩余残渣以少量甲醇溶解，转移至离心管中，置于离心浓缩仪中浓缩至干燥。

9.一种权利要求1所述的盐酸多柔比星制剂杂质的鉴定方法，其特征在于，采用以下步骤：

（1）采用Orbitrap高分辨质谱仪，得到质量数和准确碎片离子信息；

（2）理论同位素与实测同位素分布比较，得到杂质1和杂质2的分子式；

（3）使用结构解析软件对母离子进行模拟碎裂，与实测的二级质谱图进行匹配；

（4）分析杂质1和杂质2的质谱裂解机理，得到杂质1和杂质2的质量数和化学物结构。

10.一种权利要求1所述的盐酸多柔比星制剂杂质的应用，其特征在于，所述杂质在盐酸多柔比星制剂质量检测中作为杂质对照品。