CN112782318A - 一种用hplc检测盐酸阿霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：将盐酸阿霉素样品配制成的待测样品溶液，以甲醇和水为流动相，在酸的存在下，采用C18反相色谱柱进行HPLC检测。本发明采用HPLC检测盐酸阿霉素，特别地采用了甲醇和水为流动相，在本发明所述流动相下出峰的峰形极佳，且检测过程简便，稳定性好，具有操作简便、检测时间短、灵敏度高、特异性强。
Description
技术领域
本发明属于药物化学分析技术领域，具体涉及一种用HPLC检测盐酸阿霉素的方法。
背景技术
阿霉素是蒽醌类化合物，广泛用于治疗白血病、乳腺癌等的治疗。虽然阿霉素已被证明是一种有效药物，但它的治疗指数低，长期用药或者剂量稍大便会引发一些严重的副作用，包括骨髓抑制和心脏毒性。许多的分析方法，包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱、电化学方法等，都被报道可用于阿霉素的检测。但是，这些方法都存在某些缺陷，比如昂贵的仪器和有毒的试剂，复杂的前处理过程，重现性差，以及响应时间长等。
CN109884011A公开了一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素荧光检测方法。其利用金纳米团簇与阿霉素的特异性相互作用后发生强烈光致电子转移，导致金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而实现阿霉素的测定。阿霉素测定的线性范围为0.05～2μmol/L，最低检测限为0.005μmol/L。该测试方法需要通过金纳米团簇的荧光发生猝灭这一原料进行测试，然而该测试原料昂贵，测试条件较为苛刻。
CN107589184A公开了一种PEG及PEG化阿霉素的分析检测方法，：使用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪进行分析检测，将含有PEG及PEG化药物的待测物通过液相色谱分离，测定生物样品中PEG及PEG化阿霉素在测定之前包括样品前处理和标准曲线制备步骤，取经由前处理后的上清液进行液相色谱-四极杆-飞行时间质谱分析，记录色谱图，将PEG、阿霉素和PEG化阿霉素峰面积代入标准曲线，求得PEG、阿霉素和PEG化阿霉素浓度。
因此，开发一种更为简单、准确、灵敏、快速测定阿霉素的检测方法是药物分析领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用HPLC检测盐酸阿霉素的方法。所述检测方法可以实现对盐酸阿霉素的分析，测试灵敏度高，特异性好，精确度好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：将盐酸阿霉素样品配制成的待测样品溶液，以甲醇和水为流动相，在酸的存在下，采用C18反相色谱柱进行HPLC检测。
本发明采用HPLC检测盐酸阿霉素，特别地采用了甲醇和水为流动相，在酸的存在下，采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，该流动相下出峰的峰形极佳，特别缩短了检测的时间，且检测过程简便，稳定性好，具有操作简便、检测时间短、灵敏度高、特异性强。
优选地，以所述流动相的体积为100％计，所述流动相按体积百分含量计包括：甲醇30-80％和水20-70％。
以所述流动相的体积为100％计，甲醇含量为30-80％，例如可以是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％等。
以所述流动相的体积为100％计，水含量为20-70％，例如可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％等。
优选地，所述流动相按体积百分含量计包括：甲醇70％和水30％，在此比例范围内，出峰的峰形最佳，进一步缩短检测的时间(可在2.5-3min内出峰)。
优选地，所述酸为磷酸。其中，加入磷酸相比其他酸更有利于去质子化，有利于避免拖尾、前延和裂分峰的出现。
优选地，以所述流动相的体积为100％计，所述磷酸的体积百分含量为0.05-0.07％，例如可以是0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等，优选为0.06％。
优选地，所述C18反相色谱柱为XB-ODS C18柱。
优选地，所述C18反相色谱柱的规格为(100-300)mm×(4-5)mm；
其中，“100-300”例如可以是100mm、150mm、200mm、220mm、250mm、280mm、300mm等；“4-5”例如可以是4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm等；
其中，(100-300)mm指的是色谱柱的柱长，(4-5)mm指的是色谱柱的内径。
优选地，所述C18反相色谱柱的规格为250mm×4.6mm。
优选地，所述C18反相色谱柱中填料的粒径为1-10μm，例如可以是1μm、2μm、4μm、6μm、8μm、10μm等，优选为5μm。
优选地，所述C18反相色谱柱的柱温为20-30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等，优选为25℃。
优选地，所述HPLC检测中流速为0.5-1.2mL/min，例如可以是0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min等，优选为1.0mL/min。
优选地，所述HPLC检测中进样的浓度为2-30μg/mL，例如可以是2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、24μg/mL、26μg/mL、28μg/mL、30μg/mL等。
优选地，所述HPLC检测中进样的体积为20-50μL，例如可以是20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL等，优选为20μL。
优选地，所述HPLC检测中检测波长为254-500nm，例如可以是254nm、300nm、350nm、400nm、450nm、480nm、500nm，优选为480nm。
优选地，所述待测样品溶液的制备方法为：将盐酸阿霉素样品置于烧杯中，加入流动相溶解并定容，得到标准储备液；将标准储备液稀释，得到不同浓度样品溶液。
优选地，所述流动相需进行微孔滤膜过滤和超声脱气。
优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.1-0.3μm，例如可以是0.1μm、0.12μm、0.14μm、0.16μm、0.17μm、0.2μm、0.22μm、0.24μm、0.26μm、0.28μm、0.3μm等。
优选地，所述超声脱气的功率为200-400W，例如可以是200W、220W、240W、260W、280W、300W、320W、340W、360W、380W、400W等，所述超声脱气的时间为10-30min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min、28min、30min等。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明采用HPLC检测盐酸阿霉素，特别地采用了甲醇和水为流动相，该流动相下出峰的峰形极佳，且检测过程简便，稳定性好，具有操作简便、检测时间短(可在2.5-3min内出峰)、灵敏度高、特异性强。
附图说明
图1为实施例1提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图2为实施例2提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图3为实施例3提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图4为实施例4提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图5为实施例5提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图6为实施例6提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图7为实施例7提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图8为实施例8提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图9为对比例1提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图10为对比例2提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图11为对比例3提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图12为对比例4提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图13为对比例5提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图14为对比例6提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图。
图15为HPLC检测盐酸阿霉素的标准曲线图。
图16为HPLC检测盐酸阿霉素的浓度及信噪比S/N做回归曲线。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图1为实施例1提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图1所示，出峰时间保留时间2.5～3min，峰形极佳，色谱峰完全没有肩峰、拖尾等现象，基本呈现为高斯对称的峰。
实施例2
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：0.5mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图2为实施例2提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图2所示，当流速降至0.5mL/min时，出峰稍有拖尾，且出峰时间延长至5～6min。
实施例3
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：1.2mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图3为实施例3提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图3所示，当流速升至1.2mL/min时，保留时间2～2.5min，出峰稍有拖尾。
实施例4
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液50μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：1mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：50μL。
图4为实施例4提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图4所示，当进样量过高时，色谱峰变宽。
实施例5
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(6μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图5为实施例5提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图5所示，当进样浓度过低时，色谱峰拖尾明显，且出峰结束后出现基线不稳现象。
实施例6
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加流动相稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图6为实施例6提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图6所示，当在254nm下进行检测时发现色谱峰有肩峰和拖尾现象出现。
实施例7
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为50:50的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(50:50，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(50:50，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(50:50)；流速：1mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图7为实施例7提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图7所示，当甲醇-水的体积比为50:50时，色谱峰变宽，拖尾明显，不符合HPLC分离要求。
实施例8
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为80:20的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(80:20)，内含0.6‰磷酸溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(80:20)，内含0.6‰磷酸稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(80:20)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图8为实施例8提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图8所示，当甲醇-水的体积比为80:20时，色谱峰拖尾，且有鼓包现象，不符合HPLC出峰要求。
对比例1
本对比例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加流动相溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加流动相稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(70:30)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图9为对比例1提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图9所示，当不添加酸时，色谱峰较宽且出现裂分峰，无法对盐酸阿霉素的浓度进行检测。
对比例2
本对比例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将甲醇和超纯水以体积比为50:50的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(50:50)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(50:50)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(50:50)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图10为对比例2提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图10所示，当不添加酸时，色谱峰较宽，保留时间3～4min，拖尾明显。
对比例3
本对比例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将将甲醇和超纯水以体积比为3:7的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加甲醇-水(3:7)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加甲醇-水(3:7)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(3:7)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图11为对比例3提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图11所示，峰形杂乱，不符合HPLC出峰要求。
对比例4
本对比例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL乙腈，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将乙腈和超纯水以体积比为70:30的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加乙腈-水(70:30，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加乙腈-水(70:30，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(70:30)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图12为对比例4提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图12所示，当采用乙腈-水作为流动相时，发现色谱峰拖尾极为明显。
对比例5
本对比例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL乙腈，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将乙腈和超纯水以体积比为80:20的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加乙腈-水(80:20，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加乙腈-水(80:20，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(80:20)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图13为对比例5提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图13所示，当采用乙腈-水作为流动相时，发现色谱峰拖尾极为明显，且有鼓包现象。
对比例6
本对比例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL乙腈，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；将乙腈和超纯水以体积比为50:50的比例混合，得到流动相；
(2)将10.00mg盐酸阿霉素样品置10mL量瓶中加乙腈-水(50:50，内含0.6‰磷酸)溶解，使成1mg/mL的储备液。精密吸取该贮备液100μL，置10mL量瓶中，加乙腈-水(50:50，内含0.6‰磷酸)稀释，使成工作液(10μg/mL)，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用；
(3)取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪进行HPLC检测，记录色谱图，其中，色谱柱：Ultimate XB-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(50:50)；流速：1.0mL/min；检测波长：480nm；柱温：室温(25℃)；进样量：20μL。
图14为对比例6提供的HPLC检测盐酸阿霉素的谱图，如图14所示，当采用乙腈-水作为流动相时，峰形杂乱，不符合HPLC出峰要求。
试验例1
标准曲线的制备
本实施例提供一种HPLC检测盐酸阿霉素的方法，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：
(1)取100mL超纯水，0.2μm微孔滤膜(水相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；取100mL甲醇，0.2μm微孔滤膜(有机相)过滤，置瓶中，300W的功率下超声脱气20min；
(2)分别量取50mL甲醇与50mL水于250mL烧杯中，再加入0.6‰磷酸60μL，搅拌均匀备用。精密称取DOX(Doxorubicin，阿霉素)标准品0.0125g，置小烧杯中加流动相(Met：Wat＝7:3，其中加入0.6‰Pho)溶解，转移至10mL量瓶中，定容至刻度线使成储备液1，记为DOX1。精密DOX1吸取1mL，置25mL量瓶中，加流动相稀释定容至刻度线，使成储备液2(50μg/mL)，记为DOX2精密精密DOX2一定量(如下表1所示)，置5mL容量瓶中，稀释定容至刻度线即得不同浓度标准品溶液，锡箔纸包裹置4℃冷藏备用。
表1
(3)取上述标准品溶液1mL，0.2μm微孔滤膜过滤，置进样瓶中。照色谱条件测定，记录色谱图，每个样品平行测定3次，取峰面积平均值。
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，excel作图，观察线性关系，如图15所示，y＝29.491x+0.0005，R2＝0.9882，线性关系优异，可定量检测盐酸阿霉素的浓度。
试验例2
回收率测定
(1)实验目的：回收率测定多用于含量测定方法的建立，多以回收率估计分析的误差和操作过程的损失，以评价方法的可靠性。
(2)分别精密量取8μg/mL(80％)、10μg/mL(100％)、12μg/mL(120％)DOX，配制成低、中、高三种含量,微孔滤膜过滤。分别在480nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算浓度，与加入量相比计算回收率。计算结果见下表2。
表2
由表2的测试结果可知，以回收率估计分析的误差和操作过程的损失，进一步证明了本发明所述检测方法的可靠性。
试验例3
精密度的测定
通过进样6个浓度完全相同的标准溶液，对实施例1提供的方法进行精密度的考察，精密度以相对标准偏差RSD表示，相对标准偏差RSD越低，精密度越高，相对标准偏差RSD的具体测试方法为：相对标准偏差(RSD)＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)；具体计算结果如下表3所示：
表3
由表3的测试结果可知，本发明采用HPLC检测盐酸阿霉素，以多次测定结果互相接近的程度，精密度优异。
试验例4
检出限及测定下限
测试方法：配制浓度梯度为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.25μg/mL的阿霉素对照品溶液，按流动相：甲醇-水(70:30)，检测波长：480nm；流速：1mL/min；柱温：25℃检测，每个浓度样品进样3次，记录色谱图。取峰高的平均值为S，以离该线最大的噪音峰高的1/2的平均值作为噪音值N，以浓度及信噪比S/N做回归曲线。
其中，图16为以浓度及信噪比S/N做回归曲线，y＝346.74x-1.9594，R2＝0.9991；由曲线计算可知，检测限(S/N＝3)为0.014μg/mL，定量限(S/N＝10)为0.034μg/mL。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述用HPLC检测盐酸阿霉素的方法包括以下步骤：将盐酸阿霉素样品配制成的待测样品溶液，以甲醇和水为流动相，在酸的存在下，采用C18反相色谱柱进行HPLC检测。
2.根据权利要求1所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，以所述流动相的体积为100％计，所述流动相按体积百分含量计包括：甲醇30-80％和水20-70％。
3.根据权利要求1或2所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述酸为磷酸；
优选地，以所述流动相的体积为100％计，所述磷酸的体积百分含量为0.05-0.07％，优选为0.06％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述C18反相色谱柱为XB-ODS C18柱。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述C18反相色谱柱的规格为(100-300)mm×(4-5)mm，优选为250mm×4.6mm；
优选地，所述C18反相色谱柱中填料的粒径为1-10μm，优选为5μm；
优选地，所述C18反相色谱柱的柱温为20-30℃。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述HPLC检测中流速为0.5-1.2mL/min，优选为1.0mL/min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述HPLC检测中进样的浓度为2-30μg/mL；
优选地，所述HPLC检测中进样的体积为20-50μL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述HPLC检测中检测波长为254-500nm，优选为480nm。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备方法为：将盐酸阿霉素样品置于烧杯中，加入流动相溶解并定容，得到标准储备液；将标准储备液稀释，得到不同浓度样品溶液。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，其特征在于，所述流动相需进行微孔滤膜过滤和超声脱气；
优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.1-0.3μm；
优选地，所述超声脱气的功率为200-400W，所述超声脱气的时间为10-30min。
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