CN103464109A - 基于磁性纳米吸附剂测定体液中盐酸阿霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种三甲基十八烷基溴化铵(TSAB)修饰的Fe3O4磁性纳米吸附剂的制备方法,以及用该方法制得的吸附剂测定血浆和尿液中盐酸阿霉素的方法。本发明采用化学共沉淀法并通过层层组装制备得到TSAB-coated Fe3O4/SiO2,将其加入含有盐酸阿霉素的血浆和尿液样品中,用磷酸缓冲液调节pH至4~5,涡旋震荡3min后磁分离并弃去上清液,再加入洗脱剂洗脱,然后再次磁分离,收集上清液并采用高效液相色谱-荧光检测法进行分析。本方法制备的磁性吸附剂稳定性好,吸附量大,可重复使用,对血浆和尿液样品中蒽环类抗肿瘤抗生素如阿霉素等具有较强的萃取能力,能够实现样品中盐酸阿霉素的快速、有效分离和测定。
Description
技术领域
本发明涉及磁性纳米吸附剂的制备方法以及盐酸阿霉素的检测方法,具体是一种三甲基十八烷基溴化铵(TSAB)修饰的Fe3O4磁性纳米吸附剂的制备方法,以及用该方法制得的吸附剂测定血浆和尿液中盐酸阿霉素的方法。
背景技术
近年来,Fe3O4磁性纳米粒子及其复合体的合成和应用属于研究热点。它粒径小、比表面积大、偶联容量高且具有超顺磁性等特点,在外加磁场作用下可以定向聚集,因此在医学、化学、环境和生物等领域展现出广阔的应用前景。另外,Fe3O4磁性纳米粒子可以很容易进行表面修饰,使其具有如吸附等特殊的性质,基于修饰后的Fe3O4磁性纳米复合体发展成为新型的磁性固相萃取技术,它解决了液液萃取和固相萃取等方法繁琐耗时、复杂昂贵的缺点,通过磁性固相萃取法萃取体液样品中目标分析物简单省时,高效快捷,分离容易,且无需大量有机溶剂,可广泛用于复杂样品的预浓缩处理。
盐酸阿霉素是临床上常用的蒽环霉素类抗肿瘤抗生素之一,通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成,对多种肿瘤细胞如乳腺癌、肺癌、恶性淋巴癌和急性白血病等均具有杀灭作用,但是它在治疗中伴有的严重心脏毒性、抑制骨髓造血功能和毒副作用等使其应用受到了一定的限制。因此,测定体液中盐酸阿霉素,尤其是血浆和尿液样品中盐酸阿霉素的浓度对于用药安全具有重要意义。目前,文献报道的检测盐酸阿霉素的方法有荧光光谱法、超高效液相色谱法、液液萃取-高效液相色谱法和芯片毛细管电泳荧光检测法等。然而,体液样品中盐酸阿霉素检测的前处理比较复杂繁琐,因此,建立一种能够简单、快捷、有效的检测体液样品中盐酸阿霉素的方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性纳米吸附剂的制备方法,该吸附剂稳定性好,吸附量大,可重复使用,对人血浆和尿液样品中蒽环类抗肿瘤抗生素如阿霉素等具有较强的萃取能力,可用于测定人血浆和尿液样品中的盐酸阿霉素。
本发明的另一目的是提供一种利用所述方法制备的磁性纳米吸附剂测定人血浆或尿液样品中盐酸阿霉素的方法,该方法吸附效果好,分离容易,操作简便,能够实现复杂体液样品中盐酸阿霉素的快速有效分离。
本发明提供的一种磁性纳米吸附剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)Fe3O4/SiO2磁性纳米粒子的制备:可参照Dandan Song,Yanqin Gu,Lu Liang,ZhihuiAi,Lizhi Zhang and Hui Xu.Magnetic solid-phase extraction followed by high performance liquidchromatography for determination of hexanal and heptanal in human urine.Anal.Methods[J],2011,3,1418–1423文献制备。
(2)将步骤(1)制得的磁性纳米粒子,在超声作用下分散于二次水中,之后加入三甲基十八烷基溴化铵;所述的磁性纳米粒子、三甲基十八烷基溴化铵和二次水的质量比为1:0.5-0.9:120-160;在氮气保护下1000~1500rpm机械搅拌,40~80℃下反应0.5~1.5小时后磁分离,将所得固体用二次水洗涤至中性,再用无水乙醇洗涤2~3次;在50~80℃真空干燥8~12小时,研磨,即得TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂。
本发明提供的一种测定人血浆或尿液样品中盐酸阿霉素的方法,包括以下步骤:
(1)称取按权利要求1所述方法制备的磁性纳米吸附剂10mg置于比色管中,加入血浆或尿液样品1mL,并用pH4~5的磷酸缓冲液稀释至2mL;涡旋震荡至分散,振摇3~30min达吸附平衡,磁分离,弃去上清液;
(2)加入1.5~3.0mL乙醇,涡旋震荡0.5~1min以进行洗脱,磁分离,收集洗脱液;
(3)将洗脱液用50~80℃氮气吹干,所得固体加1mL二次水溶解,过滤,收集滤液;
(4)采用高效液相色谱-荧光检测法对滤液进样分析,将其峰面积值Y代入线性方程Y=13.33X-5.1008即可得样品中盐酸阿霉素的浓度X;色谱条件为色谱柱:Agilent EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:0.5%甲酸水溶液-乙腈(70:30V/V);波长:498nm/577nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。
与现有技术相比本发明的优点:
(1)本发明提供的磁性纳米吸附剂制备过程简单,快捷,耗时短,产率高,且无需使用有毒物质,条件温和,操作安全;制得的TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂的粒径为~25nm,结合了Fe3O4磁性纳米粒子特有的礠响应性和TSAB对盐酸阿霉素的高吸附性等优点,稳定性好,吸附量大,且可重复使用,分离容易,操作简单,能够实现从复杂体液样品中快速、高效萃取盐酸阿霉素的目的,避免了常规萃取方法如液-液萃取、固相萃取等方法耗时、复杂,且需要使用大量有毒有害试剂等缺点;
(2)本发明使用高效液相色谱-荧光检测法,线性范围广,灵敏度高,检测限和定量限分别为5.05ng mL-1和16.82ng mL-1,血浆和尿液样品高、中、低三种浓度的回收率分别在95.17%-107.33%和98.20%-101.55%范围之间,RSD小于7.44%,本方法准确简单,专属性强,可用于血浆和尿液样品中盐酸阿霉素的测定。
附图说明
图1为MNPs的透射电镜图,图中a:Fe3O4;b:TSAB-coated Fe3O4/SiO2。
图2为MNPs的红外光谱图,图中a:Fe3O4;b:TSAB-coated Fe3O4/SiO2。
图3为盐酸阿霉素标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1:TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂的制备
(1)称取0.994g FeCl2·4H2O和2.365g FeCl3·6H2O置于250mL三颈瓶中,加入0.4mL浓盐酸、120mL二次水成混合液,加热至70℃,在氮气保护条件下,1000~1500rpm机械搅拌并缓慢滴加25%氨水调节pH至9-10,继续反应2小时,得黑色混悬液;
(2)将2.0mL原硅酸四乙酯(TEOS)加入步骤(1)所得混悬液中,继续反应1.0小时,得棕黑色混悬液;
(3)将0.697g三甲基十八烷基溴化铵(TSAB)加入步骤(2)所得混悬液中,继续反应1.0小时,得棕色混悬液;
(4)将步骤(3)所得混悬液放置至室温,然后磁分离,将所得固体用二次水洗涤至中性,再用无水乙醇洗涤2~3次;
(5)将步骤(4)所得固体在60℃真空干燥8小时,研磨,即得产物。
实施例2:TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂的制备
(1)称取0.994g FeCl2·4H2O和2.365g FeCl3·6H2O置于250mL三颈瓶中,加入0.4mL浓盐酸、140mL二次水成混合液,加热至70℃,在氮气保护条件下,1000~1500rpm机械搅拌并缓慢滴加25%氨水调节pH至9-10,继续反应2小时,得黑色混悬液;
(2)将2.0mL原硅酸四乙酯(TEOS)加入步骤(1)所得混悬液中,继续反应1.0小时,得棕黑色混悬液;
(3)将0.876g三甲基十八烷基溴化铵(TSAB)加入步骤(2)所得混悬液中,继续反应1.0小时,得棕色混悬液;
(4)将步骤(3)所得混悬液放置至室温,然后磁分离,将所得固体用二次水洗涤至中性,再用无水乙醇洗涤2~3次;
(5)将步骤(4)所得固体在60℃真空干燥8小时,研磨,即得产物。
实施例3:TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂的制备
(1)称取0.994g FeCl2·4H2O和2.365g FeCl3·6H2O置于250mL三颈瓶中,加入0.4mL浓盐酸、160mL二次水成混合液,加热至70℃,在氮气保护条件下,1000~1500rpm机械搅拌并缓慢滴加25%氨水调节pH至9-10,继续反应2小时,得黑色混悬液;
(2)将2.0mL原硅酸四乙酯(TEOS)加入步骤(1)所得混悬液中,继续反应1.0小时,得棕黑色混悬液;
(3)将1.044g三甲基十八烷基溴化铵(TSAB)加入步骤(2)所得混悬液中,继续反应1.0小时,得棕色混悬液;
(4)将步骤(3)所得混悬液放置至室温,然后磁分离,将所得固体用二次水洗涤至中性,再用无水乙醇洗涤2~3次;
(5)将步骤(4)所得固体在60℃真空干燥8小时,研磨,即得产物。
采用透射电子显微镜对所合成的TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂进行表征,从图1(a)可以看出,Fe3O4磁性纳米粒子不规则球形分布,粒径为~10nm;图1(b)显示,TSAB-coated Fe3O4/SiO2 MNPs粒径在~25nm。
采用傅里叶红外光谱对所合成的TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂进行表征,从图2中可以看出,TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂的特征峰分布在2924,2855和1070cm-1处,其中2924和2855cm-1为TSAB中十八烷基的C-H伸缩振动峰,1070cm-1则为TEOS中Si-O键的特征吸收峰,这些特征峰表明TEOS和TSAB均被成功修饰于Fe3O4磁性纳米粒子表面。此外,586cm-1处可见Fe-O键的特征峰,而3435cm-1处则为Fe3O4表面裸露-OH的O-H伸缩振动峰。
实施例4:高效液相色谱-荧光检测法测定血浆和尿液样品中盐酸阿霉素的方法学评价
(1)盐酸阿霉素储备液的配制
精密称取盐酸阿霉素标准品适量,配制成0.2mg/mL的储备液,置于4℃保存。
(2)血浆样品的制备
取5mL健康人血液,在3000rpm下离心5min,吸取0.5mL上清血浆,加入甲醇-丙酮(25:75v/v)混合溶剂1.5mL,然后再12000rpm下离心5min,收集上清液,二次水稀释至5.0mL,置于4℃保存;
(3)尿液样品的制备
取5mL健康人尿液,加入1~2滴浓盐酸,摇匀,吸取0.5mL并用二次水稀释至5.0mL,置于4℃保存;
(4)色谱条件
色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:0.5%甲酸水溶液-乙腈(70:30V/V);波长:498nm/577nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL;
(5)方法学评价
标准曲线:配制盐酸阿霉素浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg mL-1系列标准溶液,然后按此实施例(4)项的色谱条件进样分析。以其峰面积(Y)与对应浓度(X)进行线性回归,回归方程为Y=13.33X-5.1008(r=0.9984),见图3所示。
检测限和定量限:检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别以信噪比S/N=3和S/N=10计算,LOD为5.05ng mL-1,LOQ为16.82ng mL-1。
回收率和精密度:在血浆或尿液样品中加入适量盐酸阿霉素储备液,配制浓度为0.5、2.5和10.0μg mL-1盐酸阿霉素的血浆或尿液溶液,按此实施例(4)项的色谱条件进样分析,每个浓度重复测定6次,分别计算日内和日间RSD及其回收率,结果见表1。
表1 血浆和尿液样品加标回收率及其精密度实验结果(n=6)
实施例5:基于磁性固相萃取的高效液相色谱-荧光检测法对血浆或尿液样品中盐酸阿霉素的测定
(1)盐酸阿霉素储备液的配制
精密称取盐酸阿霉素标准品适量,配制成0.2mg/mL的储备液,置于4℃保存。
(2)血浆样品的制备
取5mL健康人血液,在3000rpm下离心5min,吸取0.5mL上清血浆,加入甲醇-丙酮(25:75/v)混合溶剂1.5mL,然后再12000rpm下离心5min,收集上清液,用二次水稀释至4.90mL,加入0.1mL0.2mg/mL盐酸阿霉素储备液,摇匀,得浓度为2μg mL-1盐酸阿霉素的血浆样品,置于4℃保存;
(3)尿液样品的制备
取5mL健康人尿液,加入1~2滴浓盐酸,吸取0.5mL并用二次水稀释至4.9mL,加入0.1mL 0.2mg/mL盐酸阿霉素储备液,摇匀,得浓度为2μg mL-1盐酸阿霉素的尿液样品,置于4℃保存;
(4)磁性固相萃取操作
血浆或尿液样品各三组平行的磁性固相萃取实验。步骤如下:
称取TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂10mg置于比色管中,加入血浆或尿液样品1mL并用磷酸缓冲液(pH 5)稀释至2mL;涡旋震荡至分散,振摇3min,待达到吸附平衡后磁分离并弃去上清液;加入2mL甲醇,涡旋震荡30s进行洗脱,收集洗脱液;将洗脱液用60℃氮气流吹干得红色固体,加1mL二次水溶解,过滤,收集滤液;
(5)高效液相色谱-荧光检测分析
采用高效液相色谱-荧光检测法对滤液进样分析。色谱条件为色谱柱:Agilent EclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:0.5%甲酸水溶液-乙腈(70:30V/V);波长:498nm/577nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。分析结果见表2。
表2 血浆和尿液中阿霉素的检测结果(n=3)
Claims (2)
1.一种磁性纳米吸附剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)Fe3O4/SiO2磁性纳米粒子的制备;
(2)将步骤(1)制得的磁性纳米粒子,在超声作用下分散于二次水中,之后加入三甲基十八烷基溴化铵;所述的磁性纳米粒子、三甲基十八烷基溴化铵和二次水的质量比为1:0.5-0.9:120-160;在氮气保护下1000~1500rpm机械搅拌,40~80℃下反应0.5~1.5小时后磁分离,将所得固体用二次水洗涤至中性,再用无水乙醇洗涤2~3次;在50~80℃真空干燥8~12小时,研磨,即得TSAB-coated Fe3O4/SiO2磁性纳米吸附剂。
2.一种测定人血浆或尿液中盐酸阿霉素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)称取按权利要求1所述方法制备的磁性纳米吸附剂10mg置于比色管中,加入血浆或尿液样品1mL,并用pH4~5的磷酸缓冲液稀释至2mL;涡旋震荡至分散,振摇3~30min达吸附平衡,磁分离,弃去上清液;
(2)加入1.5~3.0mL乙醇,涡旋震荡0.5~1min以进行洗脱,磁分离,收集洗脱液;
(3)将洗脱液用50~80℃氮气吹干,所得固体加1mL二次水溶解,过滤,收集滤液;
(4)采用高效液相色谱-荧光检测法对滤液进样分析,将其峰面积值Y代入线性方程Y=13.33X-5.1008即可得样品中盐酸阿霉素的浓度X;色谱条件:色谱柱:Agilent EclipseXDB-C18色谱柱,规格:4.6mm×250mm,5μm;流动相:0.5%甲酸水溶液-乙腈,体积比70:30;激发波长:498nm;发射波长:577nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131225 |