CN114755340A - 血清中盐酸阿霉素的检测方法 - Google Patents

血清中盐酸阿霉素的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清中盐酸阿霉素的检测方法，包括以下步骤：1)样品预前处理：1‑1)在血清样本中加入内标工作液，混匀；1‑2)再加入水溶液，涡旋震荡；2)对步骤1)得到的预前处理后的样品进行固相萃取净化，得到测试样；3)采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到样品中的盐酸阿霉素的含量。本发明提供的血清中盐酸阿霉素的检测方法先使用亲水‑亲脂平衡固相萃取填料进行样品净化，然后使用LC‑MS/MS进行样品检测，具有高灵敏度、准确度及精密度，定量限低至10pg/mL，且样品通量高，具有很好的应用前景。

Description

血清中盐酸阿霉素的检测方法
技术领域
本发明涉及药物化学分析技术领域，特别涉及一种血清中盐酸阿霉素的检测方法。
背景技术
盐酸阿霉素又名盐酸多柔比星，是一种在临床上被广泛应用的蒽环类抗癌类药物，抗癌谱广，可用于治疗肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等。因其具有较强的心脏毒性、骨髓抑制及消化道不良反应，因此盐酸阿霉素在化疗方面的应用受到了一定程度的限制。准确测定体液中，尤其是血液样品中盐酸阿霉素的浓度对于评估用药安全具有重要意义，从而可以调整化疗方案以达到理想的疗效。
目前，盐酸阿霉素的检测方法有荧光光谱法、高效液相色谱紫外检测法、毛细管电泳荧光检测法等，其中技术CN106198694A公开了一种基于裸玻碳电极检测盐酸阿霉素的比率双信号电化学传感器，该技术利用盐酸阿霉素与亚甲基蓝电化学活性高的特点，将两者直接加入电解液中，亚甲基蓝浓度不变作为参比信号，盐酸阿霉素与玻碳电极之间发生氧化还原反应，出现显著电信号，随着盐酸阿霉素加入量的增大，其引起的电信号逐渐增强，利用电化学工作站对盐酸阿霉素和亚甲基蓝电信号进行检测，实现对盐酸阿霉素的比率双重电信号的检测。该技术涉及一种电化学传感器的构建，对实验室的技术要求较高，不利于临床样品的快速、准确定量。技术CN109884011A公开了一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的盐酸阿霉素荧光检测方法，该技术利用金纳米团簇与盐酸阿霉素的特异性作用后发生强烈光致电子转移，导致金纳米团簇的荧光发生猝灭，检测荧光强度的变化从而完成盐酸阿霉素的测定。该技术中盐酸阿霉素测定的线性范围为0.029～1.16μg/mL，最低检测限为0.0029μg/mL。该测试方法需要通过金纳米团簇的荧光发生猝灭这一原料进行测试，测试原料昂贵，测试条件较为苛刻，同时方法定量限偏高，同样不利于在临床检测实验室进行推广应用；技术CN 112782318 A公开了一种用HPLC检测盐酸阿霉素的方法，该方法检测的是盐酸阿霉素药品，样品前处理方法为将样品用流动相溶解后直接测试，并不涉及体液样品中盐酸阿霉素浓度的检测，同时该技术的检测限(S/N＝3)为0.014μg/mL，定量限(S/N＝10)为0.034μg/mL，检测限与定量限普遍偏高，不利于痕量盐酸阿霉素的准确定量。
所以，现在有必要提供一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种血清中盐酸阿霉素的检测方法。本发明提供的方法先通过固相萃取(SPE)进行样品前处理、再使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行检测，利用LC-MS/MS的高灵敏度、高特异性特点结合固相萃取对样品的净化处理，能实现血清中盐酸阿霉素的高精度检测，定量限低至10pg/mL。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种血清中盐酸阿霉素的检测方法，包括以下步骤：
1)样品预前处理：
1-1)在血清样本中加入内标工作液，混匀；
1-2)再加入水溶液，涡旋震荡；
2)对步骤1)得到的预前处理后的样品进行固相萃取净化，得到测试样；
3)采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到样品中的盐酸阿霉素的含量。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)将血清样本加入孔板中，然后加入内标工作液，混匀；
1-2)再加入水溶液，密封孔板，750-3000转/min涡旋震荡30-120S。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)将200μL血清样本加入96孔板中，然后加入10uL内标工作液，混匀；
1-2)再加入200μL水溶液，通过硅胶盖密封96孔板，1500转/min涡旋震荡60S。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
2-1)使用甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用水进行平衡；
2-2)将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱中；
2-3)使用第一淋洗淋洗，弃淋洗液；
2-4)使用第二淋洗淋洗，弃淋洗液；
2-5)使用甲醇洗脱，收集洗脱液；
2-6)在收集的洗脱液中加入水稀释样品，涡旋混合，得到测试样。
优选的是，所述第一淋洗为体积分数10-30％的甲醇水溶液，所述第二淋洗为体积分数35-70％的甲醇水溶液。
优选的是，所述第一淋洗为体积分数15％的甲醇水溶液，所述第二淋洗为体积分数50％的甲醇水溶液。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
2-1)使用100-400ul甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用100-400ul水进行平衡；
2-2)将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱的SPE96孔板中；
2-3)使用100-400ul体积分数15％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-4)使用100-400ul体积分数50％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-5)使用40-160μL甲醇洗脱SPE 96孔板，收集洗脱液；
2-6)在收集的洗脱液中加入10-40μL水稀释样品，涡旋混合0.5-2min，得到测试样。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
2-1)使用200ul甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用200ul水进行平衡；
2-2)将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱的SPE96孔板中；
2-3)使用200ul体积分数15％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-4)使用200ul体积分数50％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-5)使用80μL甲醇洗脱SPE 96孔板，收集洗脱液；
2-6)在收集的洗脱液中加入20μL水稀释样品，涡旋混合1min，得到测试样。
优选的是，SPE填料为亲水-亲脂平衡的反相吸附剂。
优选的是，所述步骤3)中液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基反相色谱柱；
流动相：A相含体积分数0.1％的甲酸的水溶液，B相为甲醇；
梯度洗脱程序：0-0.2min，30％B；0.2-0.5min，30％B-80％B；1.5-3min，100％B；3-3.1min，30％B；3.1-5min，30％B。
流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；
质谱条件为：
离子源：ESI源；
检测方式：多反应监测。
本发明的有益效果是：
本发明提供的血清中盐酸阿霉素的检测方法先使用亲水-亲脂平衡固相萃取填料进行样品净化，然后使用LC-MS/MS进行样品检测，具有高灵敏度、准确度及精密度，定量限低至10pg/mL，且样品通量高，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例中获得的盐酸阿霉素的标准曲线；
图2为本发明的实施例中获得的盐酸阿霉素标准溶液色谱图；
图3为本发明的实施例中获得的盐酸阿霉素血清加标色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
1、试剂来源说明
(1)盐酸阿霉素(sigma)；
(2)白藜芦醇(sigma)；
(3)甲醇(康科德科技有限公司)；
(4)甲酸(Thermo Fisher)；
(5)高纯水为符合国际GB/T 6682-2008的一级水。
2、试剂配制
使用甲醇作为溶剂，配制盐酸阿霉素标准工作液，浓度分别为0.2、0.4、1、4、10、20、100、200、400ng/mL；内标物为白藜芦醇，内标物标准工作液浓度为500ng/mL。
实施例1
一种血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、样品预前处理：
1-1、将200μL血清样本加入96孔板中，然后加入10uL内标工作液，混匀；
1-2、再加入200μL水溶液，通过硅胶盖密封96孔板，1500转/min涡旋震荡60S。
2、对步骤1)得到的预前处理后的样品进行固相萃取净化，得到测试样：
2-1、使用200ul甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用200ul水进行平衡；
2-2、将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱的SPE96孔板中；
2-3、使用200ul体积分数15％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-4、使用200ul体积分数50％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-5、使用80μL甲醇洗脱SPE 96孔板，收集洗脱液；
2-6、在收集的洗脱液中加入20μL水稀释样品，涡旋混合1min，得到测试样。
其中，SPE填料为亲水-亲脂平衡的反相吸附剂，SPE 96孔板规格为2mg/well。
3、上机测试：采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到样品中的盐酸阿霉素的含量。
其中，(1)液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基反相色谱柱(50×3.0mm，2.6μm，100A)；
流动相：A相含体积分数0.1％的甲酸的水溶液，B相为甲醇；
梯度洗脱程序：0-0.2min，30％B；0.2-0.5min，30％B-80％B；1.5-3min，100％B；3-3.1min，30％B；3.1-5min，30％B。
流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；
(2)质谱条件为：
离子源：ESI源；
检测方式：多反应监测(MRM)；
每种化合物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1.
表1质谱采集参数
母离子 子离子 ID 去簇电压(V) 碰撞电压(V) 出口电压(V)
544.3 396.8 盐酸阿霉素-1 60 16 12
544.3 379 盐酸阿霉素-2 60 25 9.5
229.3 135.1 白藜芦醇 60 21 12
标准曲线的构建方法为：将以上配制的浓度为0.2、0.4、1、4、10、20、100、200、400ng/mL的盐酸阿霉素标准工作液供液相色谱串联质谱法检测，从而得到标准曲线，如图1，线性方程为y＝1.3853x-0.0134，相关系数R2＝0.9999，线性范围0.01-20ng/mL，定量限为0.01ng/mL。参照图2，为盐酸阿霉素标准溶液色谱图(0.2ng/mL)；参照图3，为盐酸阿霉素血清加标色谱图(加标浓度1ng/mL)。
本实施例中，为考察本发明的方法的可行性，使用血清进行加标回收率试验，加标浓度为0.05ng/mL、0.5ng/mL。样品预处理上述样品处理步骤进行。获得实验准确性及精密度数据，结果见表2。
表2准确性与精密度数据
Figure BDA0003610714290000071
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样品预前处理：
1-1)在血清样本中加入内标工作液，混匀；
1-2)再加入水溶液，涡旋震荡；
2)对步骤1)得到的预前处理后的样品进行固相萃取净化，得到测试样；
3)采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，通过标准曲线计算得到样品中的盐酸阿霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)将血清样本加入孔板中，然后加入内标工作液，混匀；
1-2)再加入水溶液，密封孔板，750-3000转/min涡旋震荡30-120S。
3.根据权利要求2所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)将200μL血清样本加入96孔板中，然后加入10uL内标工作液，混匀；
1-2)再加入200μL水溶液，通过硅胶盖密封96孔板，1500转/min涡旋震荡60S。
4.根据权利要求1所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：
2-1)使用甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用水进行平衡；
2-2)将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱中；
2-3)使用第一淋洗淋洗，弃淋洗液；
2-4)使用第二淋洗淋洗，弃淋洗液；
2-5)使用甲醇洗脱，收集洗脱液；
2-6)在收集的洗脱液中加入水稀释样品，涡旋混合，得到测试样。
5.根据权利要求4所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述第一淋洗为体积分数10-30％的甲醇水溶液，所述第二淋洗为体积分数35-70％的甲醇水溶液。
6.根据权利要求5所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述第一淋洗为体积分数15％的甲醇水溶液，所述第二淋洗为体积分数50％的甲醇水溶液。
7.根据权利要求6所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：
2-1)使用100-400ul甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用100-400ul水进行平衡；
2-2)将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱的SPE96孔板中；
2-3)使用100-400ul体积分数15％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-4)使用100-400ul体积分数50％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-5)使用40-160μL甲醇洗脱SPE 96孔板，收集洗脱液；
2-6)在收集的洗脱液中加入10-40μL水稀释样品，涡旋混合0.5-2min，得到测试样。
8.根据权利要求7所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：
2-1)使用200ul甲醇活化SPE柱中的SPE填料，然后使用200ul水进行平衡；
2-2)将步骤1)得到的预前处理后的样品全部转移上样至SPE柱的SPE96孔板中；
2-3)使用200ul体积分数15％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-4)使用200ul体积分数50％的甲醇水溶液淋洗SPE 96孔板，弃淋洗液；
2-5)使用80μL甲醇洗脱SPE 96孔板，收集洗脱液；
2-6)在收集的洗脱液中加入20μL水稀释样品，涡旋混合1min，得到测试样。
9.根据权利要求8所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，其中，SPE填料为亲水-亲脂平衡的反相吸附剂。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的血清中盐酸阿霉素的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基反相色谱柱；
流动相：A相含体积分数0.1％的甲酸的水溶液，B相为甲醇；
梯度洗脱程序：0-0.2min，30％B；0.2-0.5min，30％B-80％B；1.5-3min，100％B；3-3.1min，30％B；3.1-5min，30％B。
流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；
质谱条件为：
离子源：ESI源；
检测方式：多反应监测。
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