CN112782328A - 检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112782328A
CN112782328A CN201911095743.0A CN201911095743A CN112782328A CN 112782328 A CN112782328 A CN 112782328A CN 201911095743 A CN201911095743 A CN 201911095743A CN 112782328 A CN112782328 A CN 112782328A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
standard
sample
phase extraction
solid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911095743.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112782328B (zh
Inventor
鲁靖睿
廖云莉
饶维桥
任艳
訾金
林梁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Huada Clinic Examination Center
Original Assignee
Shenzhen Huada Clinic Examination Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Huada Clinic Examination Center filed Critical Shenzhen Huada Clinic Examination Center
Priority to CN201911095743.0A priority Critical patent/CN112782328B/zh
Publication of CN112782328A publication Critical patent/CN112782328A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112782328B publication Critical patent/CN112782328B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本申请公开了一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用。本申请的检测方法包括对待测尿液样品依序进行预处理、样本处理和固相萃取，然后对固相萃取产物进行液相色谱串联质谱法检测，实现五种儿茶酚胺及其代谢物同时检测；样本预处理包括避光取待测尿液样品，向其中加酸进行酸化处理，并加稳定剂和抗氧化剂；样本处理包括向预处理产物中加入含有内标的样本稀释液；固相萃取包括对样本处理产物进行过柱、淋洗和洗脱，获得用于检测的固相萃取产物。本申请的方法和试剂盒，仅需少量尿液就可一次性定量检测五种儿茶酚胺及其代谢物，简单快捷，节省了操作时间，为嗜铬细胞瘤或其相关肿瘤筛查、评估提供了更为准确和完整的参考依据。

Description

检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及儿茶酚胺及其代谢物检测技术领域，特别是涉及一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
嗜铬细胞瘤是一类起源于神经外胚层嗜铬组织的内分泌肿瘤，其主要特征是分泌大量的儿茶酚胺，典型的临床症状为头痛、心悸、出汗以及继发性高血压。患者会因为长期的高血压导致严重的心、脑、肾损伤或者因突发急性严重高血压导致死亡。
嗜铬细胞瘤与儿茶酚胺的代谢密切相关。儿茶酚胺是由神经组织(包括大脑)和肾上腺制成的化学物质。主要类型有多巴胺(Dopamine，DA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)和肾上腺素(Epinephrine，EP)。其代谢物主要有变肾上腺素(Metanephrine，MN)和去甲变肾上腺素(Normetanephrine，NMN)。高浓度的儿茶酚胺及其代谢物可能意味着嗜铬细胞瘤或其他类似的内分泌肿瘤的存在，因此儿茶酚胺及其代谢物的检测结果可以作为中间参考数据，为嗜铬细胞瘤或其他类似的内分泌肿瘤的分析、研究或检测提供参考依据。嗜铬细胞瘤在高血压病人中患病率为0.05％～0.2％，发病高峰为20～50岁。嗜铬细胞瘤位于肾上腺者占80％～90％，且多为一侧性；肾上腺外的瘤主要位于腹膜外、腹主动脉旁；多良性，恶性者占10％。与大部分肿瘤一样，散发型嗜铬细胞瘤的病因仍不清楚；家族型嗜铬细胞瘤则与遗传有关。
2014年由美国内分泌学会与欧洲内分泌学会和美国临床化学协会共同制定的国际指南指出：嗜铬细胞瘤的初始生化筛查应包括尿液中的分馏变肾上腺素(MN)和去甲变肾上腺素(NMN)。梅奥医学指出，针对阳性复检样本，要同时测试血浆或尿液中的儿茶酚胺，而血浆中的儿茶酚胺含量很低，且不如尿液中儿茶酚胺稳定。因此，基于尿液样本采集方便、成本低，且尿液中嗜铬细胞瘤标志物更加稳定的特点，开发尿液中儿茶酚胺或其代谢物的检测技术是目前研究的重点。
目前，儿茶酚胺或其代谢物的检测方法主要为酶联免疫法、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。酶联免疫法由于本身方法的限制，每次仅能够测定一种分析物，且抗原抗体的反应无法达到100％。因此，酶联免疫法检测结果差异性较大，在临床和健康筛查方面可靠性差。高效液相色谱法由于其方法本身和检测器的限制，仅能够针对一种或几种分析物的测定，且方法本身的检测限较高，无法对含量极低的分析物进行准确定量。液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)可以同时对多种分析物进行精准的定量，满足对临床和健康方面对儿茶酚胺或其代谢物的检测需求，具有高通量、快速、低成本的特点，因此在临床和健康筛查及科研领域具有极高的应用价值。
关于嗜铬细胞瘤的检测，重庆医科大学的专利申请201710716931.5中披露了一种“嗜铬细胞瘤诊断试剂盒及其使用方法”；但是，其中仅仅记载了变肾上腺素(Metanephrine，MN)和去甲变肾上腺素(Normetanephrine，NMN)的检测，不能全面的检测和分析儿茶酚胺及其代谢物，也难以为嗜铬细胞瘤或其相关肿瘤的筛查和评估提供准确、完整的参考依据。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的能同时检测尿液中的儿茶酚胺及其代谢物等五种化合物的方法，该方法使用的试剂盒，以及本申请方法和试剂盒的应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法，包括对待测尿液样品依序进行预处理、样本处理和固相萃取，然后对固相萃取的产物进行液相色谱串联质谱法检测，实现同时检测待测尿液样品中的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素；预处理包括避光取待测尿液样品，向其中加入酸进行酸化处理，然后加入稳定剂和抗氧化剂以保证待测尿液样品的稳定性；样本处理包括向预处理的产物中加入含有内标的样本稀释液，混合均匀，备用；固相萃取包括对样本处理的产物进行过柱、淋洗和洗脱，获得固相萃取产物，其中，固相萃取的固相萃取柱为全能型亲水亲脂平衡的水可浸润性反相吸附剂；样本稀释液为含有乙二胺四乙酸和2-氨基乙基二苯基硼酸酯的氯化铵-氨水溶液；内标包括多巴胺-D4、去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D6、去甲变肾上腺素-D3和变肾上腺素-D3。
其中，稳定剂和抗氧化剂主要是保障待测尿液样品中的儿茶酚胺及其代谢物的稳定性，避免其被氧化或降解，为后续的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素等五种化合物的同时检测奠定基础；因此，能够稳定儿茶酚胺及其代谢物或防止其氧化的试剂都可以用于本申请。但是，为了保障检测效果，本申请的一种实现方式中，对稳定剂和抗氧化剂进行了详细限定，详见以下方案。
本申请中，样本稀释液的作用主要是为待测尿液样品的固相萃取提供条件和环境，以便于更好的实现五种化合物的固相萃取，因此，本申请采用含有乙二胺四乙酸和2-氨基乙基二苯基硼酸酯的氯化铵-氨水溶液作为样本稀释液。其中，氯化铵-氨水溶液是实验室常规的溶液；本申请的一种实现方式中具体采用的是2mol/L且pH8.5的氯化铵-氨水溶液。乙二胺四乙酸和2-氨基乙基二苯基硼酸酯的量可以根据试验需求调整，本申请的一种实现方式中，具体的，每50mL浓度为2mol/L且pH8.5的氯化铵-氨水溶液添加0.285g的乙二胺四乙酸和0.1g的2-氨基乙基二苯基硼酸酯制成样本稀释液。
需要说明的是，本申请采用全能型亲水亲脂平衡的水可浸润性反相吸附剂对经过处理的待测尿液样品进行固相萃取，正常状况下，这种固相萃取柱对儿茶酚胺类化合物的吸附作用很微弱，无法对复杂基质中的儿茶酚胺及其代谢物进行有效萃取；但是，本申请在进行样本处理时，采用添加2-氨基乙基二苯基硼酸酯(Diphenyl boronic acid,DPBA)的碱性样本稀释液进行处理，在碱性环境下，2-氨基乙基二苯基硼酸酯可与儿茶酚胺及其代谢物形成硼酸二苯酯儿茶酚胺络合结构，而该类络合物可以与本申请采用的固相萃取柱的填料之间形成很强的吸附作用。本申请的检测方法，通过一系列预处理和样本处理步骤，并结合固相萃取，对尿液样品进行净化，使得待测尿液样品中的目标分析物得以最大程度的保留，因此，能够实现多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素等五种化合物的同时检测。
还需要说明的是，儿茶酚胺及其代谢物虽然在尿液中的含量较血浆高、且稳定，但是，总体来说，尿液中儿茶酚胺及其代谢物在的绝对含量还是较低，且尿液中成分复杂。虽然已经有尿液中儿茶酚胺及其代谢物的检测技术研究，但是，如背景技术提到的，通常都只能检测一两种儿茶酚胺或其代谢物，无法实现多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素五种化合物的同时检测。现有研究和报道中，虽然也有对尿液样品进行前处理的步骤，但是，由于处理方案都比较简单，直接按照现有的处理方案进行尿液样品前处理，即便采用液相色谱串联质谱法检测，也难以有效的实现本申请的五种化合物的同时检测。因此，为保证仪器检测的准确性、稳定性和防止仪器污染，本申请的检测方法特别研发了一系列的样本前处理方案来对尿液样品进行净化。
可以理解，本申请检测方法中，预处理、样本处理和固相萃取为五种化合物的同时检测奠定了基础；至于后续的液相色谱串联质谱法检测，可以参考常规的液相色谱串联质谱法检测；但是，为了确保五种化合物的检测质量和效率，本申请优选的方案中对液相色谱串联质谱法的部分关键条件进行了详细说明，详见以下技术方案。
优选的，预处理中，酸化处理加入的酸为乙酸和/或柠檬酸二氢钠，稳定剂为乙二胺四乙酸，抗氧化剂为Na2S2O3。
需要说明的是，样本预处理的目的是保证儿茶酚胺类化合物在待测尿液样本中的稳定性，保证儿茶酚胺及其代谢物不会随着存放时间的延长而逐步降解，使检测浓度产生偏差。尿液酸化处理不仅可以选择乙酸，也可以选择柠檬酸二氢钠，二者可以单独或混合使用，都可以使尿液酸化且不影响检测的稳定性和可靠性。乙二胺四乙酸(简写EDTA)作为金属离子络合剂加入至尿液样本中，其目的是防止样本在运输、储存过程中所引入的其他金属离子对尿液样本中待测物的检测产生影响；Na2S2O3作为抗氧化剂加入待测尿液样本中，其目的是防止尿液样本中的待测物被空气中的氧气或其他氧化剂氧化而降解，从而影响待测物的检测结果。
优选的，酸化处理中，待测尿液样品与乙酸的体积比为10:0.08。
需要说明的是，待测尿液样品与乙酸的体积比为10:0.08，是本申请的一种实现方式中最佳的体积比，该比例过高或过低都会对样品检测产生影响。可以理解，在对检测结果的准确性要求较低的情况下，待测尿液样品与乙酸的体积比可以在试验允许的范围内调整，例如待测尿液样品与乙酸的体积比(10±2):(0.08±0.03)。
优选的，预处理中，乙二胺四乙酸和Na2S2O3的工作浓度都为0.25mg/mL。
其中，工作浓度是指，例如乙二胺四乙酸加入酸化处理的待测尿液样品后的浓度。工作浓度为0.25mg/mL，同样是本申请的一种实现方式中，既能够有效保障待测尿液样品的稳定性，又能够尽量不影响待测尿液样品总体的浓度和用量，在要求相对较低的检测中，乙二胺四乙酸和Na2S2O3的工作浓度也可以在试验允许的范围内调整，例如0.25±0.05mg/mL。本申请的一种实现方式中，具体采用的是浓度25mg/mL的乙二胺四乙酸溶液和浓度25mg/mL的Na2S2O3溶液，按照待测尿液样品、乙二胺四乙酸溶液和Na2S2O3溶液的体积比为10:0.1:0.1的比例添加，使乙二胺四乙酸和Na2S2O3添加到待测尿液样品中后稀释约100倍，获得约为0.25mg/mL的工作浓度。
优选的，固相萃取还包括，在对样本处理的产物进行过柱之前，对固相萃取柱进行活化。
优选的，活化采用的试剂为甲醇和Wash Buffer，Wash Buffer为0.2mol/L的氯化铵-氨水缓冲液。
优选的，活化具体包括，向固相萃取柱中加入甲醇，自然流干，然后再加入氯化铵-氨水缓冲液，自然流干，即完成固相萃取柱的活化。
需要说明的是，固相萃取柱活化的目的是对固相进行浸润，使其在液相环境中激活，以便于后续的固相萃取的进行；因此，原则上，优选采用样本稀释液相同或近似的溶液进行活化。
优选的，对样本处理的产物进行过柱、淋洗，具体包括，将样本处理的产物加入固相萃取柱中，自然流干，再进行淋洗。
优选的，淋洗包括分别采用淋洗液1和淋洗液2对固相萃取柱进行淋洗；淋洗液1为含20％甲醇的0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液；淋洗液2为0.01％氨水溶液。
需要说明的是，淋洗的目的是去除固相吸附的样本中的除儿茶酚胺及其代谢物以外的杂质；本申请考虑到尿液样品的复杂性，优选的采用两种淋洗液分步对尿液样本中不同性质的、可能对样本检测带来影响的杂质进行祛除；特别是，淋洗液1采用含甲醇的碱性溶液，即氯化铵-氨水缓冲液，与固相萃取的碱性环境一致，可以在进一步确保固相萃取柱对儿茶酚胺及其代谢物吸附的情况下，对其他杂质进行去除。
优选的，淋洗具体包括，向固相萃取柱中加入淋洗液1，自然流干，然后再加入淋洗液2，再自然流干，即完成淋洗。
优选的，固相萃取中，洗脱包括采用待测尿液样品5倍体积的洗脱液对固相萃取柱进行洗脱；洗脱液为含2％甲酸的水溶液。
优选的，洗脱具体包括，向固相萃取柱中加入洗脱液，自然流干，然后使用正压仪将其压干。
需要说明的是，采用酸性溶液对固相萃取柱中吸附的硼酸二苯酯儿茶酚胺络合物进行洗脱，洗脱过程中硼酸二苯酯儿茶酚胺络合物会解除络合状态，2-氨基乙基二苯基硼酸酯会留在固相萃取柱内，而儿茶酚胺及其代谢物等儿茶酚胺类化合物将会与洗脱液一同流出萃取柱，最终实现待测尿液样品中多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素等儿茶酚胺类化合物的净化，为多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素五种化合物的同时检测奠定了基础。可以理解，2％甲酸的水溶液只是本申请的一种实现方式中具体采用的酸性溶液，不排除还可以采用其它酸性溶液进行洗脱。
优选的，液相色谱串联质谱法中，流动相包括流动相A和流动相B；流动相A由去离子水、流动相添加剂A和流动相添加剂B按体积比1000:1:0.4混合而成；流动相B由甲醇、流动相添加剂A和流动相添加剂B按体积比1000:1:0.4混合而成；流动相添加剂A为甲酸，流动相添加剂B为5mol/L乙酸铵溶液。
需要说明的是，流动相是确保各种目标分析物能够被有效分离和被检测到的基础，虽然本申请的检测方法中采用的样本处理使得待测对象中最大限度的保留了多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素五种化合物，但是，为了确保五种化合物能够被更有效的区分检测，本申请特别研发了由流动相A和流动相B组成的流动相。
优选的，液相色谱串联质谱法中，按照表1所示的洗脱梯度表进行梯度洗脱，
表1
洗脱时间(分钟) 流速 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0.0 0.4mL/分钟 99 1
1.0 0.4mL/分钟 99 1
2.5 0.4mL/分钟 70 30
2.6 0.4mL/分钟 2 98
3.5 0.4mL/分钟 2 98
3.6 0.4mL/分钟 99 1
5.0 0.4mL/分钟 99 1
优选的，液相色谱串联质谱法中，色谱条件为，柱温40℃、样品池温度8℃、进样体积5.0μL。
需要说明的是，虽然本申请特别研发了由流动相A和流动相B组成的流动相，但是为了进一步保障液相色谱串联质谱法对五种化合物的检测质量和效率，本申请进一步的研发了一种新的梯度洗脱方案，即表1所示的梯度洗脱；并对柱温、样品池温度和进样体积等都进行了详细限定。
本申请的另一面公开了一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒，包括样本稀释液、WashBuffer、淋洗液1、淋洗液2、洗脱液、儿茶酚胺及其代谢物校准品、尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品、仪器质控品、同位素混合标准品、流动相添加剂A和流动相添加剂B；
样本稀释液由每50mL浓度为2mol/L且pH8.5的氯化铵-氨水溶液添加0.285g的乙二胺四乙酸和0.1g的2-氨基乙基二苯基硼酸酯制备而成；
Wash Buffer为0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液，pH8.5；
淋洗液1为含20％甲醇的0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液，pH8.5；
淋洗液2为0.01％氨水溶液；
洗脱液为含2％甲酸的水溶液；
儿茶酚胺及其代谢物校准品为若干个人工尿液样品，每个人工尿液样品中都同时含有多巴胺标准品、去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、去甲变肾上腺素标准品和变肾上腺素标准品，并且若干个人工尿液样品中的各标准品形成梯度浓度；儿茶酚胺及其代谢物校准品用于绘制标准曲线，以便于定量分析检测，其中，各标准品形成梯度浓度，例如在8个人工尿液样品中多巴胺标准品以2倍、5倍或10倍的梯度浓度存在于各人工尿液样品，梯度浓度可以是成倍的浓度递增或递减，也可以是等比或其它方式递增或递减，梯度浓度的范围以最低浓度和最高浓度能够覆盖有效检测范围为准，在此不作具体限定；本申请中，若干个人工尿液样品，其具体数量可以根据所需要的浓度梯度范围而定；对于相同的浓度梯度范围，人工尿液样品数量越多，即相邻浓度梯度的差越小，或者说单位梯度内人工尿液样品数量越多，则制备的标准曲线越准确，可以理解，标准曲线是以各浓度梯度的人工尿液样品的检测值为点进行拟合得到的曲线，检测值越多拟合曲线就越接近真实情况，但是相应的成本也会增加，因此一般本申请6-8个浓度梯度的人工尿液样品即可满足检测需求；
尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品分别为正常浓度人工尿液样品和异常浓度人工尿液样品，其中，正常浓度和异常浓度是指人工尿液样品中多巴胺标准品、去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、去甲变肾上腺素标准品和变肾上腺素标准品五种标准品的浓度；
正常浓度人工尿液样品中，多巴胺标准品的浓度为64-96ng/mL、去甲肾上腺素标准品的浓度为32-48ng/mL、肾上腺素标准品的浓度为12-18ng/mL、去甲变肾上腺素标准品的浓度为280-420ng/mL、变肾上腺素标准品的浓度为88-132ng/mL；
异常浓度人工尿液样品中，多巴胺标准品的浓度为408-612ng/mL、去甲肾上腺素标准品的浓度为160-240ng/mL、肾上腺素标准品的浓度为72-108ng/mL、去甲变肾上腺素标准品的浓度为640-960ng/mL、变肾上腺素标准品的浓度为416-624ng/mL；
其中，正常浓度人工尿液样品是对比健康人群而言，其正常尿液中的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素的浓度；异常浓度人工尿液样品是对比患病人群的尿液中的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素的浓度；一般来说，作为尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品，正常浓度人工尿液样品和异常浓度人工尿液样品中，各标准品都采用其平均浓度，例如本申请的一种实现方式中，正常浓度人工尿液样品中，多巴胺标准品的浓度为80ng/mL、去甲肾上腺素标准品的浓度为40ng/mL、肾上腺素标准品的浓度为15ng/mL、去甲变肾上腺素标准品的浓度为350ng/mL、变肾上腺素标准品的浓度为110ng/mL，异常浓度人工尿液样品中，多巴胺标准品的浓度为510ng/mL、去甲肾上腺素标准品的浓度为200ng/mL、肾上腺素标准品的浓度为90ng/mL、去甲变肾上腺素标准品的浓度为800ng/mL、变肾上腺素标准品的浓度为520ng/mL；
仪器质控品为包含巴胺标准品、去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、去甲变肾上腺素标准品和变肾上腺素标准品五种标准品的纯标准品；
同位素混合标准品为多巴胺-D4、去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D6、去甲变肾上腺素-D3和变肾上腺素-D3；
流动相添加剂A为甲酸；
流动相添加剂B为5mol/L的乙酸铵。
需要说明的是，本申请的试剂盒实际上就是本申请检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法中采用的试剂，流动相添加剂A和流动相添加剂B用于制备流动相A和流动相B。可以理解，本申请所使用的试剂或者配制这些试剂的原材料都可以通过市场购买，本申请为了使用方便并确保五种化合物的检测质量，将其组装成本申请的检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒。
优选的，本申请的试剂盒中还包括96孔微孔板和相应的热封铝膜。
优选的，本申请的试剂盒中还包括96孔固相萃取板和96孔深孔板；96孔固相萃取板中，每个孔中含有固相萃取柱；96孔深孔板与96孔固相萃取板和96孔微孔板相匹配。
需要说明的是，96孔固相萃取板的作用是对大批量的尿液样本进行同时处理，96孔固相萃取板的96个孔，原则上可以处理96个不同的样本，实现对96个样本的固相萃取。可以理解，如果仅仅是对个别样本的处理或研究，可以不使用96孔固相萃取板和96孔深孔板，直接采用单个的固相萃取柱即可。
本申请的再一面还公开了本申请的检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法，或本申请的检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒，在制备嗜铬细胞瘤检测试剂盒或装置中的应用。
需要说明的是，本申请的五种儿茶酚胺及其代谢物的检测方法和试剂盒，其目的就是通过对五种儿茶酚胺及其代谢物的检测，为嗜铬细胞瘤或其相关肿瘤的筛查和评估提供更为准确、完整的参考依据；因此，本申请的试剂盒可以用于制备嗜铬细胞瘤检测试剂盒。并且，基于本申请检测方法和试剂盒的发明构思，也可以研制相应的专门用于嗜铬细胞瘤检测的自动化装置。
本申请的有益效果在于：
本申请检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法和试剂盒，仅需约200微升的尿液样本就可以一次性定量5种儿茶酚胺及其代谢物，且本申请的检测方法简单快捷，节省了操作时间。采用本申请的检测方法和试剂盒能够为嗜铬细胞瘤或其相关肿瘤的筛查、评估和研究提供更为准确和完整的参考依据，使得嗜铬细胞瘤或其相关肿瘤的预防和诊断更及时有效。
附图说明
图1是本申请实施例仪器质控品中五种儿茶酚胺及其代谢物的色谱图。
具体实施方式
由于儿茶酚胺及其代谢物在尿液中的含量较低，且尿液中成分较为复杂。为保证仪器检测的准确性、稳定性和防止仪器污染，本申请研发了一系列的样本前处理方案来对尿液样本进行净化，包括本申请检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法中的预处理、样本处理和固相萃取，通过这些样本前处理方案，能够确保五种儿茶酚胺及其代谢物，即多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素，被有效的净化，从而为后续的检测奠定基础。
儿茶酚胺及其代谢物一共有五种化合物，五种化合物结构相似，其中肾上腺素与去甲变肾上腺素是同分异构体；并且，人体尿液中儿茶酚胺的代谢物去甲变肾上腺素和变肾上腺素不仅有游离形式的存在，还大量存在硫酸盐的结合形式。因此，在本申请的改进方案中，特别研发了合适的流动相和梯度洗脱方案，以保障检测的准确性、稳定性和可靠性。
本申请检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法，与现有的免疫分析法相比，单位样本检测成本更低，检测结果更准确；与HPLC法相比，样品处理更简便，灵敏度更高；与现有的LC-MS/MS方法相比，检测的指标更多更全面，能同时检测多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素这五种化合物。因此，本申请检测方法具有单样本多指标同步检测功能，具有高灵敏度、高通量、高时效等特点。
在本申请检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法的基础上，本申请进一步的将检测方法中使用的试剂组装成一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒，以方便使用。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒，其组成如表2所示。
表2试剂盒组成
Figure BDA0002268287350000101
表2中，“SetA”是指试剂盒中常温放置的部分，“Set B”是指试剂盒中需要在小于-18℃条件下保存的部分，“Set C”是指试剂盒中需要在4-8℃冷藏保存的部分。
本例的儿茶酚胺及其代谢物校准品有八支，依序为Cal1至Cal8，每支300μL，儿茶酚胺及其代谢物校准品为人工尿液样品；其中，cal1的人工尿液样品中DA标准品的浓度为1.0ng/mL、NE标准品的浓度为0.4ng/mL、EP标准品的浓度为0.4ng/mL、MN标准品的浓度为1.0ng/mL、NMN标准品的浓度为1.0ng/mL；cal2的人工尿液样品中DA标准品的浓度为5.0ng/mL、NE标准品的浓度为2.0ng/mL、EP标准品的浓度为2.0ng/mL、MN标准品的浓度为5.0ng/mL、NMN标准品的浓度为5.0ng/mL；cal3的人工尿液样品中DA标准品的浓度为10.0ng/mL、NE标准品的浓度为4.0ng/mL、EP标准品的浓度为4.0ng/mL、MN标准品的浓度为10.0ng/mL、NMN标准品的浓度为10.0ng/mL；cal4的人工尿液样品中DA标准品的浓度为50.0ng/mL、NE标准品的浓度为20.0ng/mL、EP标准品的浓度为20.0ng/mL、MN标准品的浓度为50.0ng/mL、NMN标准品的浓度为50.0ng/mL；cal5的人工尿液样品中DA标准品的浓度为100.0ng/mL、NE标准品的浓度为40.0ng/mL、EP标准品的浓度为40.0ng/mL、MN标准品的浓度为100.0ng/mL、NMN标准品的浓度为100.0ng/mL；cal6的人工尿液样品中DA标准品的浓度为250.0ng/mL、NE标准品的浓度为100.0ng/mL、EP标准品的浓度为100.0ng/mL、MN标准品的浓度为250.0ng/mL、NMN标准品的浓度为250.0ng/mL；cal7的人工尿液样品中DA标准品的浓度为500.0ng/mL、NE标准品的浓度为200.0ng/mL、EP标准品的浓度为200.0ng/mL、MN标准品的浓度为500.0ng/mL、NMN标准品的浓度为500.0ng/mL；cal8的人工尿液样品中DA标准品的浓度为1000.0ng/mL、NE标准品的浓度为400.0ng/mL、EP标准品的浓度为400.0ng/mL、MN标准品的浓度为1000.0ng/mL、NMN标准品的浓度为1000.0ng/mL。
表2中，尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品有2支，每支1.3mL，其中1支为正常浓度人工尿液样品，1支为异常浓度人工尿液样品；正常浓度人工尿液样品中，DA标准品的浓度为80.0ng/mL、NE标准品的浓度为40.0ng/mL、EP标准品的浓度为15.0ng/mL、MN标准品的浓度为110.0ng/mL、NMN标准品的浓度为350.0ng/mL；异常浓度人工尿液样品中，DA标准品的浓度为510.0ng/mL、NE标准品的浓度为200.0ng/mL、EP标准品的浓度为90.0ng/mL、MN标准品的浓度为520.0ng/mL、NMN标准品的浓度为800.0ng/mL。
表2中，仪器质控品为包含巴胺标准品、去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、去甲变肾上腺素标准品和变肾上腺素标准品五种标准品的纯标准品，其中，DA标准品的浓度为10.0ng/mL、NE标准品的浓度为10.0ng/mL、EP标准品的浓度为10.0ng/mL、MN标准品的浓度为10.0ng/mL、NMN标准品的浓度为10.0ng/mL。
表2中，同位素混合标准品为多巴胺-D4、去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D6、去甲变肾上腺素-D3和变肾上腺素-D3的混合干粉。混合干粉在加入0.50mL甲醇后，可以获得浓度为100.0ng/mL的多巴胺-D4、浓度为50.0ng/mL的去甲肾上腺素-D6、浓度为50.0ng/mL的肾上腺素-D6、浓度为50.0ng/mL的去甲变肾上腺素-D3，以及浓度为50.0ng/mL的变肾上腺素-D3。
表2中，流动相添加剂A为甲酸，流动相添加剂B为5mol/L的乙酸铵溶液。样本稀释液由每50mL浓度为2mol/L且pH8.5的氯化铵-氨水溶液添加0.285g的乙二胺四乙酸和0.1g的2-氨基乙基二苯基硼酸酯制备而成。Wash Buffer为0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液，pH8.5。淋洗液1为含20％甲醇的0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液，pH8.5；淋洗液2为0.01％氨水溶液。洗脱液为含2％甲酸的水溶液。96孔PEP板即固相萃取SPE板。
其中，2mol/L的氯化铵-氨水溶液由53.5g氯化铵加入500mL去离子水充分溶解后，再加入20mL氨水，以及130mL去离子水，充分混合即可。
50mL的样本稀释液的制备方法为，量取48.8mL上述配制好的浓度为2mol/L的氯化铵-氨水溶液，加入0.285g的EDTA粉末，充分溶解；再量取1.2mL甲醇溶解的0.1g的2-氨基乙基二苯基硼酸酯，按200μL/次的速度加入至48.8mL浓度为2mol/L的氯化铵-氨水溶液中，每次加入后涡旋震荡20秒，防止2-氨基乙基二苯基硼酸酯溶出，最终获得50mL的样本稀释液。
Wash Buffer的制备方法为，量取上述配制好的2mol/L的氯化铵-氨水溶液100mL，加入900mL去离子水，充分混合，即可。
淋洗液1的制备方法为，量取100mL甲醇、50mL上述配制好的2mol/L的氯化铵-氨水溶液和350mL去离子水，充分混合，即可。
淋洗液2的制备方法为，量取0.1mL氨水至1000mL去离子水中，充分混合，即可。
洗脱液的制备方法为，量取10mL甲酸至490mL去离子水中，充分混合，即可。
操作说明书中记载了本例试剂盒的使用方法，即本例的检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法，具体如下：
(1)工作液配置
含有内标的样本稀释液的配制：向同位素混合标准品的混合干粉瓶中加入0.50mL甲醇制成内标混合液，然后取0.384mL内标混合液加入50mL样本稀释液中，即获得含有内标的样本稀释液。
(2)预处理
避光取10mL新采集尿液，分别加入100μL 25mg/mL的EDTA溶液和25mg/mL的Na2S2O3溶液，之后加入80μL乙酸。涡旋混匀，待用。
(3)样本处理
将每个预处理后的尿液样本，以及正常浓度人工尿液样品、异常浓度人工尿液样品、不同浓度的儿茶酚胺及其代谢物校准品各取200μL加入对应的96孔深孔板内。之后，各孔内分别加入500μL含内标的样本稀释液，封膜，涡旋混匀，置于4℃待用。
(4)固相萃取
(a)96孔固相萃取板活化：
向96孔固相萃取板内每个孔加入1mL甲醇，使其自然流干，再向96孔固相萃取板内每个孔加入1mL的Wash Buffer，使其自然流干。
(b)上样
向活化后的96孔固相萃取板内对应孔内缓慢加入96孔深孔板内的样本混合溶液，即样本处理的产物，使其自然流干。
(c)淋洗
向96孔固相萃取板内每个孔内加入1mL淋洗液1，使其自然流干；再向96孔固相萃取板内加入2mL淋洗液2，使其自然流干。
(d)洗脱
将96孔固相萃取板与新的96孔深孔板相组合，然后，向96孔固相萃取板内每个孔加入1mL洗脱液，使其自然流干。之后，使用正压仪将其快速压干。即获得用于后续液相色谱串联质谱法检测的固相萃取产物。
从96孔深孔板内取100μL至96孔微孔板内，即浅孔板，封膜，待上机。
(5)上机检测
配制流动相A：1000mL去离子水中加入400μL流动相添加剂B和1mL流动相添加剂A；
配制流动相B：1000mL甲醇中加入400μL流动相添加剂B和1mL流动相添加剂A；
从仪器质控品的瓶内取80μL，直接上机检测系统的适配性。
(a)色谱条件
本例采用超高效液相色谱：WatersACQUITY i-class UPLC液相系统
色谱柱：Waters HSS PFP 1.7μL色谱柱(100mm×2.1mm)
柱温：40℃
样品池温度：8℃
进样体积：5.0μL
洗脱梯度如表1所示：
表1
Figure BDA0002268287350000131
Figure BDA0002268287350000141
(b)质谱条件
质谱：Waters Xevo TQ-S ESI+
离子源参数：Capillary Voltage：0.5kV；Desolvation Temperature：500℃；ConeGas：150L/Hour；Desolvation Gas：900L/Hour。
离子对信息如表3所示。
表3离子对信息
Figure BDA0002268287350000142
(6)定量结果报告
根据仪器设定程序自动输出DA、NE、EP、MN和NMN五种化合物的浓度。
以上步骤具体操作全部在避光条件下进行，避免分析物在光照下降解。
本例的试剂盒中，还可以进一步包含甲醇和色谱柱等，本领域技术人员可以对此类耗材进行选择或直接购买，在此不赘述。
本例的尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品用于评估检测的稳定性，一般来说，CV％≤15％表示检测稳定，数据采集可靠。
本例按照以上方法和参数，采用仪器质控品(QA)检测系统的适配性，结果如图1所示。图1为仪器质控品中五种儿茶酚胺及其代谢物的色谱图，图1的结果显示，本例的方法和试剂盒能够有效的检测出五种化合物，与预期相符。
另外，本例对仪器质控品中儿茶酚胺及其代谢物的CV％值进行了试验，结果如表4所示。
表4质控品中儿茶酚胺及其代谢物的CV％
分析化合物 批次1(n＝12) 批次2(n＝12) 批间(n＝24)
多巴胺 5.60％ 3.83％ 6.87％
去甲肾上腺素 12.41％ 9.36％ 13.78％
肾上腺素 12.27％ 11.58％ 13.59％
去甲变肾上腺素 6.32％ 5.77％ 6.61％
变肾上腺素 4.35％ 3.03％ 4.03％
注：n为重复次数。每15个样本后接1个质控样本
表4中，批次1和批次2是指在不同天数分别制备样本进行上机检测时，仪器所测量质控品浓度的CV％。以批次1为例，一批次12个仪器质控品，一共检测得到12个测量值，计算12个测量值的平均值和标准偏差，CV％为标准偏差除以平均值的商的百分比。
表4的结果显示，根据相关要求，临床质谱的检测稳定性批次内和批次间检测值的CV％应小于15％，表中的数据充分证明本例方法检测的数据稳定性符合相关要求。
此外，本例采用以上试剂盒和检测方法，对183例随机人尿液样品进行了检测，测量尿液中儿茶酚胺及其代谢物的含量，检测结果如表5所示。
表5 183例人尿液样本中儿茶酚胺及其代谢物的检测值(单位：ng/mL)
多巴胺 去甲肾上腺素 肾上腺素 去甲变肾上腺素 变肾上腺素
尿液样本 308.4±171.3 20.7±15.0 2.7±2.0 13.6±8.7 21.4±13.6
表5中儿茶酚胺及其代谢物的检测浓度为183例人尿液样品检测结果的平均值。
表5的结果显示，在随机健康人群中，由于健康人体内的儿茶酚胺会由于情绪、饮食及环境的影响，其体内的儿茶酚胺及其代谢物的含量会有较大的波动，其浓度值会略高于健康人群的参考范围，在未出现明显高血压的症状下，此类浓度值的波动并不会影响健康。健康人群尿液样本中的儿茶酚胺及其代谢物检测结果浓度均符合相关临床诊断中参考范围的要求，本方法对于相关样本检测结果无误。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法，其特征在于：包括对待测尿液样品依序进行预处理、样本处理和固相萃取，然后对固相萃取的产物进行液相色谱串联质谱法检测，实现同时检测待测尿液样品中的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素；
所述预处理包括避光取待测尿液样品，向其中加入酸进行酸化处理，加入稳定剂和抗氧化剂以保证待测尿液样品的稳定性；
所述样本处理包括向所述预处理的产物中加入含有内标的样本稀释液，混合均匀，备用；
所述固相萃取包括对所述样本处理的产物进行过柱、淋洗和洗脱，获得固相萃取产物，所述固相萃取的固相萃取柱采用全能型亲水亲脂平衡的水可浸润性反相吸附剂；
所述样本稀释液为含有乙二胺四乙酸和2-氨基乙基二苯基硼酸酯的氯化铵-氨水溶液；
所述内标包括多巴胺-D4、去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D6、去甲变肾上腺素-D3和变肾上腺素-D3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理中，酸化处理加入的酸为乙酸和/或柠檬酸二氢钠，所述稳定剂为乙二胺四乙酸，所述抗氧化剂为Na2S2O3；
优选的，所述酸化处理中，待测尿液样品与乙酸的体积比为10:0.08；
优选的，所述预处理中，乙二胺四乙酸和Na2S2O3的工作浓度都为0.25mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固相萃取还包括，在对所述样本处理的产物进行过柱之前，对固相萃取柱进行活化；
优选的，所述活化采用的试剂为甲醇和Wash Buffer，所述Wash Buffer为0.2mol/L的氯化铵-氨水缓冲液；
优选的，所述活化具体包括，向固相萃取柱中加入甲醇，自然流干，然后再加入氯化铵-氨水缓冲液，自然流干，即完成固相萃取柱的活化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对所述样本处理的产物进行过柱、淋洗，具体包括，将所述样本处理的产物加入固相萃取柱中，自然流干，再进行淋洗；
优选的，所述淋洗包括分别采用淋洗液1和淋洗液2对固相萃取柱进行淋洗；
所述淋洗液1为含20％甲醇的0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液；
所述淋洗液2为0.01％氨水溶液；
优选的，所述淋洗具体包括，向固相萃取柱中加入淋洗液1，自然流干，然后再加入淋洗液2，再自然流干，即完成淋洗。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固相萃取中，所述洗脱包括采用所述待测尿液样品5倍体积的洗脱液对固相萃取柱进行洗脱；
所述洗脱液为含2％甲酸的水溶液；
优选的，所述洗脱具体包括，向固相萃取柱中加入洗脱液，自然流干，然后使用正压仪将其压干。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述液相色谱串联质谱法中，流动相包括流动相A和流动相B；
流动相A由去离子水、流动相添加剂A和流动相添加剂B按体积比1000:1:0.4混合而成；
流动相B由甲醇、流动相添加剂A和流动相添加剂B按体积比1000:1:0.4混合而成；
所述流动相添加剂A为甲酸，所述流动相添加剂B为5mol/L的乙酸铵溶液；
优选的，所述液相色谱串联质谱法中，按照表1所示的洗脱梯度表进行梯度洗脱，
表1
洗脱时间(分钟) 流速 流动相A(体积％) 流动相B(体积％) 0.0 0.4mL/分钟 99 1 1.0 0.4mL/分钟 99 1 2.5 0.4mL/分钟 70 30 2.6 0.4mL/分钟 2 98 3.5 0.4mL/分钟 2 98 3.6 0.4mL/分钟 99 1 5.0 0.4mL/分钟 99 1
优选的，所述液相色谱串联质谱法中，色谱条件为，柱温40℃、样品池温度8℃、进样体积5.0μL。
7.一种检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒，其特征在于：包括样本稀释液、WashBuffer、淋洗液1、淋洗液2、洗脱液、儿茶酚胺及其代谢物校准品、尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品、仪器质控品、同位素混合标准品、流动相添加剂A和流动相添加剂B；
所述样本稀释液由每50mL浓度为2mol/L且pH8.5的氯化铵-氨水溶液添加0.285g的乙二胺四乙酸和0.1g的2-氨基乙基二苯基硼酸酯制备而成；
所述WashBuffer为0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液，pH8.5；
所述淋洗液1为含20％甲醇的0.2mol/L氯化铵-氨水缓冲液，pH8.5；
所述淋洗液2为0.01％氨水溶液；
所述洗脱液为含2％甲酸的水溶液；
所述儿茶酚胺及其代谢物校准品为若干个人工尿液样品，每个人工尿液样品中都同时含有多巴胺标准品、去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、去甲变肾上腺素标准品和变肾上腺素标准品，并且若干个人工尿液样品中的各标准品形成梯度浓度；
所述尿液儿茶酚胺及其代谢物质控品分别为正常浓度人工尿液样品和异常浓度人工尿液样品；
所述正常浓度人工尿液样品中，多巴胺标准品的浓度为64-96ng/mL、去甲肾上腺素标准品的浓度为32-48ng/mL、肾上腺素标准品的浓度为12-18ng/mL、去甲变肾上腺素标准品的浓度为280-420ng/mL、变肾上腺素标准品的浓度为88-132ng/mL；
所述异常浓度人工尿液样品中，多巴胺标准品的浓度为408-612ng/mL、去甲肾上腺素标准品的浓度为160-240ng/mL、肾上腺素标准品的浓度为72-108ng/mL、去甲变肾上腺素标准品的浓度为640-960ng/mL、变肾上腺素标准品的浓度为416-624ng/mL；
所述仪器质控品为包含巴胺标准品、去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、去甲变肾上腺素标准品和变肾上腺素标准品五种标准品的纯标准品；
所述同位素混合标准品为多巴胺-D4、去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D6、去甲变肾上腺素-D3和变肾上腺素-D3；
所述流动相添加剂A为甲酸；
所述流动相添加剂B为5mol/L的乙酸铵。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包括96孔微孔板和相应的热封铝膜。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：还包括96孔固相萃取板和96孔深孔板；
所述96孔固相萃取板中，每个孔中含有固相萃取柱；
所述96孔深孔板与所述96孔固相萃取板和所述96孔微孔板相匹配。
10.根据权利要求1-6任一项所述的方法，或权利要求7-9任一项所述的试剂盒在制备嗜铬细胞瘤检测试剂盒或装置中的应用。
CN201911095743.0A 2019-11-11 2019-11-11 检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用 Active CN112782328B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911095743.0A CN112782328B (zh) 2019-11-11 2019-11-11 检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911095743.0A CN112782328B (zh) 2019-11-11 2019-11-11 检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112782328A true CN112782328A (zh) 2021-05-11
CN112782328B CN112782328B (zh) 2024-07-09

Family

ID=75749764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911095743.0A Active CN112782328B (zh) 2019-11-11 2019-11-11 检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112782328B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113820437A (zh) * 2021-08-19 2021-12-21 上海睿质科技有限公司 一种去除血浆中儿茶酚胺及其中间代谢物的方法及应用
CN114994211A (zh) * 2022-06-15 2022-09-02 北京豪思生物科技股份有限公司 用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒及其应用
CN116908325A (zh) * 2023-07-10 2023-10-20 昆明医科大学第一附属医院 一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液、方法及试剂盒
CN117368379A (zh) * 2023-12-06 2024-01-09 北京豪思生物科技股份有限公司 液相色谱电化学法高通量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5212097A (en) * 1989-11-22 1993-05-18 Hitachi, Ltd. Method for analysis of catecholamine
JPH0783920A (ja) * 1993-09-14 1995-03-31 Sekisui Chem Co Ltd カテコールアミン検査用採血管
CN106610405A (zh) * 2016-12-05 2017-05-03 江苏省人民医院 人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法
WO2017077401A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Pharmasan Labs, Inc. Method for the ultra-sensitive determination of catecholamines and their metabolites
US20170216199A1 (en) * 2015-09-18 2017-08-03 Insys Development Company, Inc. Epinephrine spray formulations
CN107462647A (zh) * 2017-08-21 2017-12-12 重庆医科大学 嗜铬细胞瘤诊断试剂盒及其使用方法
CN107478741A (zh) * 2017-08-08 2017-12-15 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 一种同时检测甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法
CN108469489A (zh) * 2018-02-12 2018-08-31 东南大学 一种强极性物质选择性分离富集前处理试剂盒及其应用
CN109709239A (zh) * 2019-01-28 2019-05-03 天津医科大学 一种采用聚冠醚功能化纳米纤维在线前处理尿液样品的检测方法
CN109709255A (zh) * 2018-12-30 2019-05-03 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法
CN109932456A (zh) * 2019-04-11 2019-06-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法
CN110274974A (zh) * 2019-07-16 2019-09-24 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种血清中肾上腺素类物质的检测方法及其富集材料

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5212097A (en) * 1989-11-22 1993-05-18 Hitachi, Ltd. Method for analysis of catecholamine
JPH0783920A (ja) * 1993-09-14 1995-03-31 Sekisui Chem Co Ltd カテコールアミン検査用採血管
US20170216199A1 (en) * 2015-09-18 2017-08-03 Insys Development Company, Inc. Epinephrine spray formulations
WO2017077401A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Pharmasan Labs, Inc. Method for the ultra-sensitive determination of catecholamines and their metabolites
CN106610405A (zh) * 2016-12-05 2017-05-03 江苏省人民医院 人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法
CN107478741A (zh) * 2017-08-08 2017-12-15 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 一种同时检测甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法
CN107462647A (zh) * 2017-08-21 2017-12-12 重庆医科大学 嗜铬细胞瘤诊断试剂盒及其使用方法
CN108469489A (zh) * 2018-02-12 2018-08-31 东南大学 一种强极性物质选择性分离富集前处理试剂盒及其应用
CN109709255A (zh) * 2018-12-30 2019-05-03 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法
CN109709239A (zh) * 2019-01-28 2019-05-03 天津医科大学 一种采用聚冠醚功能化纳米纤维在线前处理尿液样品的检测方法
CN109932456A (zh) * 2019-04-11 2019-06-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法
CN110274974A (zh) * 2019-07-16 2019-09-24 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种血清中肾上腺素类物质的检测方法及其富集材料

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW G. ELLIS ET AL.: "Dilute, derivatise and shoot: Measurement of urinary free metanephrines and catecholamines as ethyl derivatives by LC-MSMS", 《CLINICAL MASS SPECTROMETRY》, 5 September 2017 (2017-09-05), pages 1 - 8 *
勾凌燕;刘景东;王憬;刘惠敏;甘露;金玉祥;王志玲;: "固相萃取-高效液相色谱电化学法检测大鼠血浆儿茶酚胺", 分析试验室, no. 01, pages 90 - 94 *
张晚萍，王国民，邱宗荫，赵华，李惠芝: "荧光-高效液相色谱法测定血浆中儿茶酚胺类化合物的研究", 重庆医科大学学报, no. 03 *
牛晋阳;郭文萍;孙焕;宋永青;: "液质法测定动物源性食品中肾上腺素、多巴胺", 食品科学, no. 20 *
邓明彦;邓丽玲;任艳;: "儿茶酚胺心肌病1例报道并文献复习", 贵州医药, no. 11 *
陈静;丘宏强;: "高效液相色谱-电化学法测定人尿液中儿茶酚胺的浓度", 中国药房, no. 26 *
高慧;邢燕;汪洋;宋金枝;王旭;: "固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质", 中国测试, no. 02, pages 39 - 40 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113820437A (zh) * 2021-08-19 2021-12-21 上海睿质科技有限公司 一种去除血浆中儿茶酚胺及其中间代谢物的方法及应用
CN113820437B (zh) * 2021-08-19 2023-08-11 上海睿质科技有限公司 一种去除血浆中儿茶酚胺及其中间代谢物的方法及应用
CN114994211A (zh) * 2022-06-15 2022-09-02 北京豪思生物科技股份有限公司 用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒及其应用
CN114994211B (zh) * 2022-06-15 2023-10-27 北京豪思生物科技股份有限公司 用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒及其应用
CN116908325A (zh) * 2023-07-10 2023-10-20 昆明医科大学第一附属医院 一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液、方法及试剂盒
CN117368379A (zh) * 2023-12-06 2024-01-09 北京豪思生物科技股份有限公司 液相色谱电化学法高通量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112782328B (zh) 2024-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112782328B (zh) 检测尿液中儿茶酚胺及其代谢物的方法、试剂盒及其应用
CN112505228B (zh) 用于评估受试者心血管疾病风险的代谢标志物组合及其应用
Zheng et al. A sensitive, high-throughput LC-MS/MS method for measuring catecholamines in low volume serum
EP2030026B1 (en) Improved measurement of vitamin d
CN111175394B (zh) 一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法
de Jong et al. Current status and future developments of LC-MS/MS in clinical chemistry for quantification of biogenic amines
WO2017077401A1 (en) Method for the ultra-sensitive determination of catecholamines and their metabolites
US20100178663A1 (en) Apparatus And Methods For The Detection Of Plasma Metanephrines
Tsunoda et al. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection
WO2009070594A1 (en) Methods for detecting dihydroxyvitamin d metabolites by mass spectrometry
Lindström et al. Comparison of serum serotonin and serum 5-HIAA LC-MS/MS assays in the diagnosis of serotonin producing neuroendocrine neoplasms: A pilot study
CN111024874A (zh) 液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法
US9146219B2 (en) Sensitive method for measuring cis-diol containing compounds in plasma using 2D-LC-MS/MS
He et al. Development of a liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for plasma-free metanephrines with ion-pairing turbulent flow online extraction
CN114674961A (zh) 一种非衍生化同步检测血清中17种类固醇激素的试剂盒及其应用
CN114354822B (zh) 一种基于磁性吸附剂快速提取儿茶酚胺的方法
CA2906589A1 (en) Method for determining derivatized analytes in a separated biological fluid
Bergmann et al. Analysis of catecholamines in urine by unique LC/MS suitable ion-pairing chromatography
Wang et al. A simple and precise LC-MS/MS method for the simultaneous determination of serum 25-hydroxyvitamin D 3 and D 2 without interference from the C 3 epimer
CN110865137A (zh) 一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒
CN112946150B (zh) 一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及试剂盒
CN113009036A (zh) 一种检测性激素的试剂盒、性激素样品前处理方法及同时检测多种性激素的方法
Fernández et al. High-Throughput Analysis of Amphetamines in Blood and Urine with Online Solid-Phase Extraction-Liquid Chromatography—Tandem Mass Spectrometry
Hassanpour-Sabet et al. UiO-66-based metal–organic framework for dispersive solid-phase extraction of vanillylmandelic acid from urine before analysis by capillary electrophoresis
CN114397379A (zh) 一种液质联用测定血浆中奥硝唑浓度的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 518083 1st, 3rd, 4th and 5th floors of 11 buildings in Beishan Industrial Zone, Yantian Street, Yantian District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant after: Shenzhen Huada Medical Laboratory

Address before: 518083 1st, 3rd, 4th and 5th floors of 11 buildings in Beishan Industrial Zone, Yantian Street, Yantian District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant before: SHENZHEN HUADA CLINIC EXAMINATION CENTER

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant