CN110865137A - 一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒，其中，血浆中醛固酮的检测试剂盒，包括校准品和质控品；所述校准品和质控品均为含有醛固酮的牛血清白蛋白。本发明所述的血浆中醛固酮的检测试剂盒，能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差，保证检测结果的准确性。

Description

一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于临床体外检测试剂技术领域，尤其是涉及一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒，其可用于对血浆中醛固酮的检测。
背景技术
高血压有原发性高血压和继发性高血压两种类型。继发性高血压发生心血管事件的概率比原发性高血压更高，继发性高血压中原发性醛固酮增多症(primaryaldosteronism，PA)是最常见的病因，在年轻高血压人群中几乎占10％。若能早期诊断，继发性高血压可通过手术或药物治疗使血压回到正常水平，提高患者预后，大大降低心血管疾病的发生率。
醛固酮是由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素。它的主要生理功能是保钠排钾，通过调节血容量维持体液水盐平衡。快速准确地检测醛固酮和肾素对于判断肾素-血管紧张素-醛固酮系统的状态非常重要。临床上往往使用醛固酮肾素比值(Aldosterone torenin ratio，ARR)作为PA的初筛方法，再使用生理盐水抑制试验，开博通试验等验证试验作为确认试验，最后使用肾上腺静脉取样检测醛固酮。在这三步骤中准确检测醛固酮浓度都至关重要。
血液中醛固酮水平非常低，仅为pg/mL级，因此对检测方法的灵敏度要求很高。1970s起使用放射免疫法检测,有些采用化学发光法检测，是如今临床最常用的检测方法。免疫法可实现自动化操作，检测快速、成本低，但单次仅能检测一种靶标激素，特异性差、易出现交叉反应，不同的免疫测试结果不一定统一。随着技术的发展，以色谱作为分离手段、三重四极杆串联质谱作为检测手段的液相色谱-串联质谱技术成为了定量检测生物样品中痕量目标分析物的强有力的手段。现有的基于液相色谱串联质谱技术检测血浆中醛固酮的定量检测方法多为实验室自建方法，由于每个实验室检测方法和试剂选择不同，会造成室间的检测结果差异大，特别是在面对临床大量的检测样本，很难保证检测结果的一致性。想要解决这些问题，就需要针对检测项目直接提供经过验证的配套试剂盒以及标准的检测流程，提高液相色谱-串联质谱技术在临床检测的推广性，保证检测结果的一致性和准确性。
此外，在检测过程中，对血浆量的需求也没有那么大，大大降低了患者的生理负担，而且检测精准。而目前基于液相色谱-串联质谱技术进行血浆中醛固酮的检测方法及检测试剂盒还鲜有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种血浆中醛固酮的检测试剂盒，以克服现有技术的缺陷，能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差，保证检测结果的准确性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种血浆中醛固酮的检测试剂盒，包括校准品和质控品；所述校准品和质控品均为含有醛固酮的牛血清白蛋白。
优选的，所述校准品为含有梯度浓度醛固酮的牛血清白蛋白。
优选的，所述校准品的制备方法为：先用甲醇稀释醛固酮标准品到梯度浓度，然后与牛血清白蛋白混合均匀，得到含有醛固酮的牛血清白蛋白校准品。
优选的，校准品中醛固酮的浓度范围为50-10000pg/mL。
优选的，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者浓度依次升高。
优选的，所述第一质控品中醛固酮的含量范围为80-500pg/mL，第二质控品中醛固酮的含量范围为2000-6000pg/mL，第三质控品中醛固酮的含量范围为7000-10000pg/mL。
优选的，所述质控品的制备方法为：用甲醇分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的标准品，然后将相应的标准品与牛血清白蛋白混合均匀，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。
优选的，所述血浆中醛固酮的检测试剂盒，还包括内标、萃取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液。
优选的，所述内标为醛固酮-d7的甲醇溶液。
进一步优选的，内标中醛固酮-d7的浓度范围为50-200ng/mL。
优选的，所述萃取液为甲基叔丁基醚或正己烷/乙酸乙酯，优选为甲基叔丁基醚。
优选的，所述复溶液为甲醇水；较佳的，复溶液为甲醇与水按体积比1:1混合的混合溶液。
优选的，流动相A为水。
优选的，流动相B为甲醇。
优选的，所述洗针液为甲醇和水按体积比1:1混合的混合溶液。
本发明的另一目的在于提出一种血浆中醛固酮的检测方法，以利用上述试剂盒，用液相色谱-串联质谱联用对血浆中的醛固酮进行检测。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种血浆中醛固酮的检测方法，采用如上所述的试剂盒与液相色谱-串联质谱联用进行血浆中醛固酮的检测。
优选的，所述血浆中醛固酮的检测方法，包括将血浆与内标涡旋混匀、与萃取液混匀离心取上清的步骤。
优选的，所述血浆中醛固酮的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品制备：吸取400-600μL血浆冷冻储存备用；
(2)样本处理：将血浆与10-30μL内标混合涡旋，并加入600μL-3mL的萃取液涡旋混匀，并于4-10℃条件下10000-14000g离心5-10min，取500μL-2.8mL上清液进行氮吹，再用50-100μL复溶液复溶进样，用液相色谱-串联质谱检测；
(3)检测结果计算：将校准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，校准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到醛固酮标准曲线；再将质控品样本的峰面积带入标准曲线中计算得到实际的浓度。
优选的，步骤(1)中，吸取500μL血浆冷冻储存备用。
优选的，步骤(2)中，液相色谱条件为：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液；色谱柱为Kinetex C18，100*3mm，2.6μm；柱温为40℃；检测时间为6min；进样量为10-20μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，20％B，0.5-2.8min，95％B，2.8-4.5min，95％B，4.5-4.55min，20％B，4.55-6min，20％B，流速0.4-1mL/min。
优选的，步骤(2)中，质谱条件为：负离子模式，采用ESI源，碰撞气3-5psi，气帘气20-40psi，雾化气40-70psi，辅助加热气40-70psi，喷雾电压-4500V，雾化温度300-500℃。
相对于现有技术，本发明所述的一种血浆中醛固酮的检测试剂盒具有以下优势：
(1)能够提供校准品，用于每个批次样品检测的工作曲线制定，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差。
(2)能够提供样品前处理所涉及的试剂以及前处理操作流程，实现醛固酮从血浆中提取，避免样品中其他物质对待测物的干扰。
(3)能够提供质控品，随每个检测批次一起检测，保证检测结果的准确性。
(4)利用牛血清白蛋白模拟基质代替人血浆进行校准品和质控品配制，减少了对实际样本的需求。
本发明所述的一种血浆中醛固酮的检测方法具有以下优势：
(1)本方法所需样本量少，降低了患者的生理负担。
(2)前处理过程简单，可尽量避免操作过程带来的实验误差。
附图说明
图1a为标准品色谱图；
图1b为生物样本的色谱图；
图1c为牛血清白蛋白柱后灌注图；
图1d人血浆样本柱后灌注图；
图2为Ald线性曲线图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
一、试剂来源
(1)醛固酮(Ald)：上海谱芬生物，CAS号52-39-1，为干粉试剂，1mg/瓶，临用前用甲醇复溶即可使用。
(2)醛固酮-d7(Ald–d7)：上海谱芬生物，CAS号1261254-31-2，为液体试剂，100μg/mL，临用前用甲醇复溶即可使用。
(3)甲醇：使用Fisher Chemical公司67-56-1号试剂，纯度为LC/MS级，常温密封储存。
(4)甲基叔丁基醚：使用Sigma公司1634-04-4号试剂，纯度为HPLC
级，常温密封储存。
(5)水：符合国标GB/T 6682-2008的一级水。
二、实施例
本实施例中提供血浆中醛固酮的检测试剂盒，包括内标、萃取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液。
配置醛固酮的校准品溶液，具体来说，先用甲醇稀释醛固酮标准品到梯度浓度，然后与牛血清白蛋白混合均匀，最终得到含有醛固酮的牛血清白蛋白校准品，该校准品中醛固酮的浓度范围为50-10000pg/mL。具体到本实施例，可以采用如表1所示的梯度浓度的校准品。
表1醛固酮的校准品溶液梯度浓度分布
Figure BDA0002301282460000061
质控品样本：含有醛固酮低、中、高三个浓度的牛血清白蛋白。低浓度的质控品(也即第一质控品)中醛固酮的浓度为100pg/mL，中浓度的质控品(也即第二质控品)中醛固酮的浓度为5000pg/mL，高浓度的质控品(也即第三质控品)中醛固酮的浓度为8000pg/mL。
内标溶液：醛固酮-d7浓度为100ng/mL。
萃取液：甲基叔丁基醚。
复溶液：甲醇和水按体积比1:1混合。
流动相A：超纯水。
流动相B：甲醇。
洗针液：甲醇和水按体积比1:1进行混合。
采用上述试剂盒对血浆中醛固酮的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品制备
将8个校准品以及3个质控品和待检测的人血浆样本各吸取500μL进行冷冻储存备用。
(2)样本处理
取出待测样本(即待检测的人血浆样本)解冻，与20μL内标混合涡旋2min，并加入萃取液涡旋混匀2min，于4℃条件下14000g离心5min，取2.8mL上清液进行氮吹，再用100μL复溶液复溶进样，用液相色谱-串联质谱检测。
需要说明的是，上述萃取液可以选用甲基叔丁基醚或正己烷/乙酸乙酯，发明人对具体选择哪种物质或哪两种物质作为萃取液及其各自的用量进行了筛选优化，筛选过程见表2。
表2萃取液的类型以及用量筛选
用量体积 萃取液1(正己烷/乙酸乙酯) 萃取液2(甲基叔丁基醚)
5mL 1.33×10<sup>4</sup>cps 2.11×10<sup>4</sup>cps
3mL 1.35×10<sup>4</sup>cps 2.30×10<sup>4</sup>cps
2mL 1.43×10<sup>4</sup>cps 2.01×10<sup>4</sup>cps
0.8mL 8.96.9450cps 1.25×10<sup>4</sup>cps
通过相同体积不同萃取液处理同一样本，甲基叔丁基醚处理的样本强度更强；选择不同体积的甲基叔丁基醚处理同一样本，用量为3mL时，目标分析物的强度更强。同一浓度强度越强则灵敏度越高，基于此，选取甲基叔丁基醚作为萃取液，且用量为3mL。
(3)检测方法
将复溶液在液相色谱(岛津)-串联质谱(爱博才思)设备中进行检测。采用多反应监测(MRM)扫描方式，色谱测试条件为：流动相A为水溶液，流动相B甲醇溶液；色谱柱为Kinetex C18(100mm×3mm，2.6μm)；柱温为40℃；检测时间为6min；进样量为20μL；采用梯度洗脱，0min～0.5min，20％B；0.5min～2.8min，95％B；2.8min～4.5min，95％B；4.5min～4.55min，20％B；4.55min～6min，20％B；流速为0.5mL/min。质谱条件为负离子模式，采用ESI源，碰撞气4psi，气帘气20psi，雾化气40psi，辅助加热气40psi，喷雾电压-4500V，雾化温度500℃。具体化合物质谱参数如表3所示：
表3化合物质谱参数
Figure BDA0002301282460000081
(备注：Ald：醛固酮；Ald–d7：氘代醛固酮)
(4)检测结果
将校准品样本的峰面积与内标峰面积比值作为标准曲线的纵坐标，校准品浓度作为横坐标进行线性拟合，将质控品样本的峰面积带入拟合的标准曲线中计算得到实际的浓度，并与理论值比较评估。
三、效果验证
1、基质效应实验
1.1柱后灌注
采用了柱后灌注对基质效应进行评价，测试的样本包括用于配置校准品的牛血清白蛋白以及人的血浆样本，目标分析物Ald为内源性小分子，在考察真实人血浆的基质效应情况时以同位素内标的出峰行为推测目标分析物的基质影响情况。图1(a)为Ald、Ald-d7混合标准品的谱图，图1(b)为Ald、Ald-d7生物样本的谱图，在测试条件下，Ald保留时间为3.92min，Ald-d7保留时间为3.82min；图1(c)为牛血清白蛋白的柱后灌注图，图1(d)为人血浆样本的柱后灌注图，由图可以看出，在出峰位置没有明显的基质效应。故，可以用牛血清白蛋白代替人血浆基质进行校准品和质控品配制。
1.2绝对基质效应
通过样本处理后加入法对基质效应进行评价，即MF＝提取后的空白基质加入待测物的响应/纯溶剂(纯溶剂采用甲醇)中待测物的响应。内标归一化MF＝待测物MF/内标MF，当内标归一化MF的范围为0.8～1.2可接受。目标分析物选取低中高三个浓度(分别为50pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL)进行验证，每个浓度的样本为5份，进行测定。结果如表4所示，表明牛血清白蛋白没有明显的基质效应影响。
表4 Ald的内标归一化
Figure BDA0002301282460000091
2、特异性
测试空白基质样本和定量下限样品，每个样品测试三次，计算空白基质样品与定量下限样品的目标分析物的峰面积比值，以及与保留时间处内标峰面积的比值结果，如表5所示。对于目标分析物，空白基质的峰面积小于定量下限峰面积的20％，且小于预期保留时间处内标峰面积的5％，说明该试剂盒及方法没有明显的干扰，特异性较强。
表5空白基质样本和定量下限样本峰面积及比值
Figure BDA0002301282460000101
3、定量下限
根据Ald的临床检测需求以及仪器设备的灵敏度，将方法及试剂盒的定量下限定为Ald为50pg/mL，连续检测10次，计算检测值和理论值的偏差以及测试结果的变异系数CV值。测试结果如表6所示。测试值和理论值(也即50pg/mL)的偏差均在15％以内，测试的平行样本变异系数在15％以内，故该方法及试剂盒的定量下限为50pg/mL。
表6定量下限样本测试结果
Figure BDA0002301282460000102
4、线性范围
根据Ald的临床检测需求确定检测范围，并在检测范围需求内设置浓度梯度，检测梯度浓度的校准品，将目标分析物和内标峰面积的比值与梯度浓度进行拟合，得到工作曲线，拟合曲线及工程曲线方程如下图所示。计算测试值和理论值的比值，计算结果如图2所示。线性相关系数r为0.9994(>0.995)，此检测方法及相关试剂盒的Ald的线性范围为50-10000pg/mL。
5、正确度验证
以实施例所述的试剂盒测试实际的人血浆样品，通过加标回收率测定试剂盒的正确度，结果如表7所示。加标回收率为±6％的范围内，表明该检测方法及相应试剂盒的正确度满足要求，进一步说明牛血清白蛋白可以代替人血浆基质，进行校准品和质控品的配制。
表7 Ald正确度
Figure BDA0002301282460000111
6、精密度验证
以实施例所述的试剂盒验证方法及试剂盒的精密度，分别检测批内、批间和总精密度，结果见表8。试剂盒样品中醛固酮的批内、批间、总精密度均小于15％(1.24％～6.61％)。
表8试剂盒测试的批内、批间和总精密度
Figure BDA0002301282460000112
Figure BDA0002301282460000121
本发明针对上述的现有检测醛固酮的问题，所提供的试剂盒的使用方法涵盖从样本处理到进样检测、数据质控的整体解决方案，此外，本方案所需要的血浆样本量很少，可满足临床试剂检测的需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血浆中醛固酮的检测试剂盒，其特征在于：包括校准品和质控品；所述校准品和质控品均为含有醛固酮的牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的血浆中醛固酮的检测试剂盒，其特征在于：所述校准品为含有梯度浓度醛固酮的牛血清白蛋白；
和/或，所述校准品的制备方法为：先用甲醇稀释醛固酮标准品到梯度浓度，然后与牛血清白蛋白混合均匀，得到含有醛固酮的牛血清白蛋白校准品；
优选的，校准品中醛固酮的浓度范围为50-10000pg/mL。
3.根据权利要求1所述的血浆中醛固酮的检测试剂盒，其特征在于：所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者浓度依次升高；
优选的，所述第一质控品中醛固酮的含量范围为80-500pg/mL，第二质控品中醛固酮的含量范围为2000-6000pg/mL，第三质控品中醛固酮的含量范围为7000-10000pg/mL。
4.根据权利要求3所述的血浆中醛固酮的检测试剂盒，其特征在于：所述质控品的制备方法为：用甲醇分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的标准品，然后将相应的标准品与牛血清白蛋白混合均匀，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的血浆中醛固酮的检测试剂盒，其特征在于：还包括内标、萃取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液；
优选的，所述内标为醛固酮-d7的甲醇溶液；
进一步优选的，内标中醛固酮-d7的浓度范围为50-200ng/mL。
6.根据权利要求5所述的血浆中醛固酮的检测试剂盒，其特征在于：所述萃取液为甲基叔丁基醚或正己烷/乙酸乙酯，优选为甲基叔丁基醚；
和/或，所述复溶液为甲醇水；
和/或，流动相A为水；
和/或，流动相B为甲醇；
和/或，所述洗针液为甲醇和水按体积比1:1混合的混合溶液。
7.一种血浆中醛固酮的检测方法，其特征在于：采用如权利要求1至6任意一项所述的试剂盒与液相色谱-串联质谱联用进行血浆中醛固酮的检测。
8.根据权利要求7所述的血浆中醛固酮的检测方法，其特征在于：包括将血浆与内标涡旋混匀、与萃取液混匀离心取上清的步骤。
9.根据权利要求7所述的血浆中醛固酮的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品制备：吸取400-600μL血浆冷冻储存备用；
(2)样本处理：将血浆与10-30μL内标混合涡旋，并加入600μL-3mL的萃取液涡旋混匀，并于4-10℃条件下10000-14000g离心5-10min，取500μL-2.8mL上清液进行氮吹，再用50-100μL复溶液复溶进样，用液相色谱-串联质谱检测；
(3)检测结果计算：将校准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，校准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到醛固酮标准曲线；再将质控品样本的峰面积带入标准曲线中计算得到实际的浓度；
优选的，步骤(1)中，吸取500μL血浆冷冻储存备用。
10.根据权利要求9所述的血浆中醛固酮的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，液相色谱条件为：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液；色谱柱为Kinetex C18，100*3mm，2.6μm；柱温为40℃；检测时间为6min；进样量为10-20μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，20％B，0.5-2.8min，95％B，2.8-4.5min，95％B，4.5-4.55min，20％B，4.55-6min，20％B，流速0.4-1mL/min；
和/或，质谱条件为：负离子模式，采用ESI源，碰撞气3-5psi，气帘气20-40psi，雾化气40-70psi，辅助加热气40-70psi，喷雾电压-4500V，雾化温度300-500℃。
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