CN109030680A - 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法 - Google Patents

一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109030680A
CN109030680A CN201811067978.4A CN201811067978A CN109030680A CN 109030680 A CN109030680 A CN 109030680A CN 201811067978 A CN201811067978 A CN 201811067978A CN 109030680 A CN109030680 A CN 109030680A
Authority
CN
China
Prior art keywords
krill
extraction
testosterone
estradiol
aldosterone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811067978.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109030680B (zh
Inventor
韩香凝
刘代成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Normal University
Original Assignee
Shandong Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Normal University filed Critical Shandong Normal University
Priority to CN201811067978.4A priority Critical patent/CN109030680B/zh
Publication of CN109030680A publication Critical patent/CN109030680A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109030680B publication Critical patent/CN109030680B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法，将新鲜南极磷虾在‑10℃至‑50℃条件下冷冻干燥后粉碎；向上述粉碎后的南极磷虾中加入乙酸‑乙酸钠缓冲液和β‑葡萄糖苷酸酶进行酶解；将酶解后的样品中加入乙腈或乙酸乙酯涡旋提取，重复提取3～4次，合并上清液；用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，旋转蒸发至干，用乙腈或乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜，得到南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取物；超高效液相色谱‑质谱联用检测。本发明提取过程操作简单，耗时短，且可以充分的去除影响检测的杂质，是一种简易可行，耗时短，提取率高的方法。

Description

一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及 检测方法
技术领域
本发明涉及南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的高效提取方式及超高效液相色谱-质谱联用检测方法，属于医药、食品和化工技术领域。
背景技术
泼尼松龙，分子式为C21H28O5，分子量为360.44，密度为1.31g/cm3，熔点为240℃，沸点为570.6℃在760mmHg。本品为白色或类白色的结晶性粉末；无臭，味微苦；有引湿性。主要用于过敏性与自身免疫性炎症性疾病，胶原性疾病，如风湿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、严重支气管哮喘、肾病综合症、血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、急性淋巴性白血病、各种肾上腺皮质功能不足症、剥脱性皮炎、天疱疮、神经性皮炎、湿疹等。醛固酮，分子式：C21H28O5，分子量360.44，醛固酮是一种盐皮质激素，在动物的水盐平衡代谢过程中有重要作用，是具有代表性的强电解质代谢作用的盐皮质类固醇，其作用是促进Na+在体内贮留，同时排出K+。睾酮，又称睾丸素，分子式：C19H28O2，分子量288.42，雌二醇，分子式：C18H24O2。睾酮和雌二醇是两种有重要作用的性激素，睾酮在卵巢和精巢均可以分泌，雌二醇由卵巢分泌，在性激素中属于含量较高的。睾酮是一种活性极强的雄激素类药物，在维持第二性征，治疗疾病等方面有重要的应用价值。雌二醇作为一种性激素药物，对于治疗转移性乳腺癌，治疗骨质疏松以及妇科疾病有重要作用，在医疗上应用较为广泛。
南极磷虾(Euphausia superba)，主要生活在南极洲的南冰洋水域，是南极洲生态系统的重点物种，为鲸鱼、海豹、企鹅等提供了重要的食物来源。南极磷虾储量巨大，并多以群居方式生活，易采集捕捞。南极磷虾含有丰富的脂类和高质量的蛋白质，具有巨大的应用价值。目前，对于南极磷虾的应用主要集中于作为鱼类饵料以及加工磷虾油保健产品。海洋生物因其特殊的生存环境而有不同于陆生生物的代谢途径，一直是发现新药先导的天然宝库，世界上有70％的药物来源于海洋。南极磷虾中生物活性物质丰富，与其生存的低温、低盐的特殊海洋生存环境不无关系，目前对于南极磷虾中关于泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的研究近乎空白。因此，开发一种脱脂南极磷虾中提取及检测泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的方法，对于南极磷虾资源的开发利用具有十分重要的意义。此外，对于评估南极磷虾及其产品的安全性以及评估南极水域的污染情况，也有重要意义。
现有技术中，公开的关于泼尼松龙的检测有王静从牛奶中提取并检测泼尼松龙残留，牛奶样品采用醋酸盐缓冲液提取、三氯乙酸沉淀蛋白、MCX固相萃取和富集的提取检测方法；王伟等人在HPLC同时测定血液和尿液中的泼尼松龙，通过乙酸乙酯为样品萃取剂、以倍他米作为内标，色谱柱为Zorbax SB-Aq柱，流动相为甲醇-KH2PO4进行提取检测泼尼松龙。公开的关于醛固酮的提取检测方法尚未有；关于睾酮的提取检测公开的有宋昆等人从家蚕雄蛾中提取睾酮并进行含量测定，即分别以100％甲醇、100％乙酸乙酯、70％乙醇以及100％乙酸乙酯与70％乙醇体积比为9：1的混合液作为提取溶剂，提取雄蚕蛾中的睾酮，并用HPLC测定，色谱条件：色谱柱为XDBC18，VWD紫外检测器，检测波长242nm，流动相中乙腈与水的体积比为70：30，流速1.0mL/min，进样量20L。关于雌二醇的提取检测公开的有马丽莎等人从鱼虾中提取测定雌二醇，采用的是用无水硫酸镁和乙酸乙酯进行提取，以中性氧化铝为基质净化剂净化，氮气吹干，经双三氟乙酰胺与甲级氯硅烷的硅烷化试剂衍生后，在EI-SIM-MS模式下进行测定。上述方法并不适含有丰富的脂类和高质量的蛋白质的南极磷虾，因此，需要提供一种可以将这些物质高效提取出并适合南极磷虾的方法及测定方法。上述物质中泼尼松龙、雌二醇检测可以采用放射性免疫，气相色谱-质谱联用，高效液相色谱-质谱联用等，酶联免疫,薄层层析等等；但是放射性免疫操作较复杂，需要的仪器昂贵，且也需要进行硅烷甲基化或乙酰化反应转化为挥发性的成分才能进行GC-MS测定，酶联免疫灵敏度较高，但方法假阳性高，只能用于定性初筛；薄层层析是一种半定量检测方法，检测迅速，操作简便，但检测限高，需要的材料较多；超高效液相色谱-质谱联用是一种新的色谱方法，具有颗粒填料小，系统体积低，收集数据快速，柱效高，分离时间短，溶剂消耗较少等优点，是一种优于高效液相色谱-质谱检测方法。
综上所述，本发明提供一种适合南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的提取以及检测方法。
发明内容
发明人在前期南极磷虾类固醇激素研究中发现，南极磷虾中含有的类固醇激素类种类很多，且都属于脂溶性的物质，各物质高含量的提取难度较大，而且南极磷虾体内脂含量及虾青素(即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素)含量十分高，提取物呈鲜艳红色，给提取和检测造成了很大的困难。发明人研究发现，上述众多激素中有些物质的性质差异较大，然而有些物质的某些性质比较相近，所以本发明根据前期研究基础上根据物质特定的化学结构或极性等进行归类提取，即提供了一种简单方便的适用于南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的提取和检测方法。
基于上述问题，本发明的目的是提供一种适合从南极磷虾中大量的提取泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的方法及检测方法。该提取方法中只需要通过采用不同的有机溶剂即可同时实现高含量的提取泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇，提取效果优异，且该方法操作简单，提取充分，除杂良好。本发明利用超高效液相色谱进行检测，在前期研究中发现，其对南极磷虾中类固醇激素的检测限低，所用样品量少，是一种准确、可靠的适用于南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取方法，步骤如下：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入乙酸-乙酸钠缓冲液和β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)进行酶解；
(3)向上述酶解液中加入乙腈或乙酸乙酯进行涡旋提取，取清液；
(4)将步骤(3)所得的上清液用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液；
(5)旋转蒸发至干，用乙腈或乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜，得到泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取物。
优选地，在本发明的一个实施例中，公开了一种南极磷虾中泼尼松龙的提取方法，步骤如下：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入乙酸-乙酸钠缓冲液和β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)进行酶解；
(3)向上述酶解液中加入乙腈涡旋提取，取清液；
(4)将步骤(3)中的上清液用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液；
(5)旋转蒸发至干，用乙腈复溶，过0.2μm滤膜，得到泼尼松龙的提取物。
优选地，在本发明的另一实施例中，公开了一种南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的提取方法，步骤如下：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入乙酸-乙酸钠缓冲液和β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)进行酶解；
(3)向上述酶解液中加入乙酸乙酯涡旋提取，取清液；
(4)将步骤(3)中的上清液用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液；
(5)旋转蒸发至干，用乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜，得到醛固酮、睾酮和雌二醇的提取物。
本发明中，泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇属于脂溶性物质，可溶于乙醚、乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷等有机溶剂。而南极磷虾中脂肪含量及虾青素含量高，且易溶于有机溶剂，这会对本发明的提取造成一点干扰。所以本发明尽可能降低脂肪及虾青素的影响使得醛固酮、睾酮和雌二醇高效提取并富集。在有机溶剂中，乙腈穿透力强，是一种良好的提取溶剂。甲醇与水的互溶性好，可充分渗入组织内部，对目标物进行充分提取。正己烷也可以提取类固醇激素，南极磷虾中油脂多，正己烷会把油脂也提取到，造成乳化，影响后期两相分离。乙醚挥发性强、毒性大。此外，研究发现，这些大多有机溶剂会大量的提取到脂肪和虾青素(根据提取物颜色可快速判断)。所以，本申请中综合考虑各种因素，将有毒溶剂和可以大量提取到脂肪和虾青素的溶剂不考虑在范围之内，将提取目标物含量高且干扰较小的有机溶剂作为本发明的筛选溶剂。所以优选出甲醇、乙腈、乙酸乙酯和乙醇，但是研究发现目标物在有机溶剂乙醇中的溶解最差，只有通过很长的涡旋时间才能提高提取含量，不利于本发明快速提取。因此，优选为甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为本发明的提取溶剂，这三种提取溶剂提取效果相对来说较好且脂肪和虾青素的提取相对较差。在提取过程中发现，乙腈提取泼尼松龙的效果最好，乙酸乙酯提取醛固酮、睾酮和雌二醇的效果最好，所以综合考虑，本发明选用采用乙腈作为泼尼松龙的提取溶剂，乙酸乙酯作为醛固酮、睾酮和雌二醇的提取溶剂。
在实验中发现，如果直接用有机溶剂提取会使样品分散不均匀，有机溶剂较难完全渗透到肌肉组织中，而在水解后的水溶液中，用有机溶剂提取，能使提取完全。β-葡萄糖苷酸酶，是一种酸性水解酶，该酶在组织中能分解葡萄糖苷键，对类固醇的葡萄糖苷键可以从非还原的未端进行分解，可以将结合态的类固醇激素泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇水解释放出来。本发明通过研究发现，β-葡萄糖苷酸酶水解后提取出的泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇含量要比用氢氧化钠水解和不水解高，因此，本发明采用β－葡糖苷酸酶进行水解。
由于南极磷虾中油脂含量高，采用上述溶剂提取后，主要干扰物为油脂、有机酸、色素，其中油脂不会吸附在液相色谱仪的进样口及色谱仪中，导致目标的检测灵敏度下降，同时还会干扰目标物的测定。因此，本发明的目标在于去除脂肪、有机酸、色素等干扰物，发明人通过比较C18柱、QuEChERS柱和HLB柱，发现采用QuEChERS萃取柱净化，净化效率高，净化速率高，可以除去影响检测的杂质。
上述提取方法中，优选地，步骤(1)中将南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥，优选冷冻干燥的温度是-40℃。冷冻干燥一方面可以去除水分，因为水分会对提取有影响，会使水溶性蛋白杂质提取出；另一方面，可避免南极磷虾酶解变质，南极磷虾体内的酶含量特别高，当处于温度较高的条件下，几小时之后虾就会发黑发臭。南极磷虾体内的酶含量特别高，当采用鲜虾进行酶解时，放置在常温37℃条件下酶解，几小时之后虾就会发黑发臭。
优选地，步骤(1)中，采用高速组织粉碎机研磨粉碎。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎，是为了增大南极磷虾与酶以及溶剂的接触面积，使水解充分，使提取充分。粉碎处理，可以显著增加提取效率。
优选地，南极磷虾与乙酸-乙酸钠缓冲液、β-葡萄糖苷酸酶的加入量比(g/mL/μL)为1～3：1.2～1.5:5～6；所述乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为2.0mol·L-1，PH为5～6，优选为PH＝5.2。
优选地，步骤(2)中，酶解的温度为30-40℃，酶解的时间为10-14h，优选酶解温度为37℃，时间为12h。该条件下进行酶解，酶解效果最好。在加入酶解液之前加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液的目的是为β-葡萄糖苷酶创造最好的酶解条件。
优选地，步骤(3)中，乙腈或乙酸乙酯的体积为10～30mL，每次涡旋提取时间为1-3min，优选涡旋时间为2min。采用乙腈或乙酸乙酯涡旋提取，乙腈提取泼尼松龙的含量高，乙酸乙酯提取醛固酮、睾酮和雌二醇的含量最高，且提取出的其他的杂质较少，采用涡旋提取，提取方式简单，提取效率高。
优选地，步骤(4)中，涡旋时间为1-4min，离心为4000～4500r/min离心5～8min。步骤(4)采用QuEChERS固相萃取柱萃取。该固相萃取柱可除去南极磷虾中油脂，有机酸，色素等杂质，但不会去除泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇，且操作简单迅速，可以达到快速净化的目的。
进一步优选地，涡旋时间为2min，4000r/min离心5min。
优选地，步骤(5)中，乙腈或乙酸乙酯复溶体积为1～3mL。复溶其目的是使用较少的体积去最大限度的将旋蒸得到的物质溶解，这样可以使用较少的溶剂，溶解大多数的物质，一方面防止激素的损失，另一方面相当于提高了激素类物质的浓度。
优选地，步骤(5)中，旋转蒸发的温度为30-60℃，优选温度为50℃。
本发明的第二个方面，提供一种采用上述方法提取的泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的检测方法，采用超高效液相色谱-质谱法，液相条件为：色谱柱：Acchrom Unitary C18柱，2.1mm×150mm，粒径5μm，柱温：30～35℃，进一步的，柱温为30℃，样品温度10～15℃，进一步的，样品温度为10℃，进样体积10μL；流动相条件为：A相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，B相为甲醇，进一步的，A相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3mL/min，进一步的，流速为0.2mL/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相A 20％→30％，流动相B80％→70％；8～10min，流动相A 30％→35％，流动相B70％→65％；色谱条件为：电喷雾离子源，多反应离子检测模式，电离电压3.0kV，电离电压3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气(N2)，脱溶剂气流量800L/h，它参数见表1：
本发明的第三个方面，提供一种采用上述方法得到的含有泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的产品。
本发明取得了以下有益效果：
1、本发明首次以南极磷虾为材料提取泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇，甲壳动物中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇为痕量，而南极磷虾体内脂含量及虾青素含量十分高，提取物呈鲜艳红色，极大的影响了痕量泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的检测。利用乙腈或乙酸乙酯提取泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇，并通过涡旋进行提取，提取充分，且耗时短，提取的得率高，杂质较少；采用β-葡萄糖苷酸酶对于组织进行水解，可以将结合态的泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇水解释放出来，水解彻底，能够达到泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇完全提取的作用。并通过QuEChERS萃取柱净化，净化效率高，净化速率高，可以除去影响检测的杂质。本发明整个提取过程操作简单，耗时短，是一种简易可行，耗时短，提取率高，且可充分除杂的南极磷虾泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取方法。
2、本发明利用超高效液相色谱进行检测，在前期研究中发现，检测限低，所用样品量少，因此可用于南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的检测，本发明操作简单，峰面积定量准确可靠，是一种准确、可靠的适用于南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇的检测方法。
3、目前尚未有关于南极磷虾体内泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇等激素的含量评估研究报告，因此，本发明对南极磷虾4种激素本底值测定，可用于评估南极磷虾及其产品的安全性，也可用于判断南极磷虾的生理、生化、生长和生存机制以及南极水域污染情况。此外，为后期天然药物的开发提供基础。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明所用试剂和材料如下，未特殊指出的是常规试剂或通过常规途径即可购买得到。
QuEChERS固相萃取柱，成分为50mg PSA,50mg C18，150mg MgSO4，型号：Copure-2mL，中国Copure公司。
HLB固相萃取柱，型号：Waters Oasis-60mg/3mL，美国Waters公司。
实施例1：超高效液相色谱-质谱条件的摸索
本发明中超高效液相色谱条件的选择，考察了甲醇，水；甲醇，乙腈；甲醇，甲酸水作为洗脱剂的洗脱效果，甲醇，水的分离效果不好，后来采用甲醇、乙腈作为流动相，发现几乎所有激素都在3min内出峰，且都很难分开，之后采用甲醇、0.1％甲酸水作为流动相，发现采用一个梯度分离效果不好，经过不断调节流动相，发现甲醇和0.1％的甲酸水采用梯度分离的效果较好，并能在9min之内完全出峰，最后确定为检测泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇类固醇激素的流动相。
考虑到流速越大，离子化的效率越低，一般流量的选择会在0.2mL/min-0.3mL/min之间，灵敏度较为理想，同时，流速还应该适应所选择的色谱柱，选择适当的流量才会有较好的分离效率，为了兼顾离子化的效率和色谱柱的分离效率，流速最终设定为0.2mL/min。
本发明中质谱条件的摸索，根据激素的相对分子质量及结构式对质谱条件进行摸索和优化，利用流动注射泵连续进样，在正离子和负离子模式下进行全扫描，选择合适的分子离子峰和电离方式，探索响应信号最高的子离子，并确定定量离子。雌二醇采用负离子模式，睾酮、醛固酮和泼尼松龙采用正离子模式进行电离。并确定碰撞能，特征离子。确定最佳检测质谱条件。
因此，本发明最终确定的液相色谱条件和质谱条件如下：
液相色谱条件：色谱柱：Acchrom Unitary C18柱，2.1mm×150mm，粒径5μm，柱温：30～35℃，进一步的，柱温为30℃，样品温度10～15℃，进一步的，样品温度为10℃，进样体积10μL；流动相条件为：A相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，B相为甲醇，进一步的，A相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3mL/min，进一步的，流速为0.2mL/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相A 20％→30％，流动相B80％→70％；8～10min，流动相A 30％→35％，流动相B70％→65％；
质谱条件如下：电喷雾离子源，多反应离子检测模式(MRM)，电离电压3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气(N2)，脱溶剂气流量800L/h；其它参数见表1：
表1 质谱条件参数
实施实例2：提取条件的优化筛选
1、提取溶剂的优化筛选
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加12mL浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)50μL,于37℃恒温振荡器中酶解12h。样品取出冷却至室温，加入10mL提取溶剂，涡旋提取2min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为50℃，用1mL提取溶剂复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的粗提物。将粗体物用上述确立的超高效液相色谱质谱进行检测。
本发明考察了采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈分别作为提取溶剂，对于南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取检测效果进行考察，对于提取的南极磷虾的泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇提取进行上样，上样量10μL，得到不同溶剂提取的每10μL样品液中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的含量，见下表2：
表2 不同提取溶剂对各目标产物的影响
2、水解条件的优化筛选
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加12mL浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2)，加水解液进行水解,于37℃恒温振荡器中酶解12h。样品取出冷却至室温，加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为50℃，用1mL乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的粗提物。将粗体物用上述确立的超高效液相色谱质谱进行检测。
本发明考察了采用碱水解(pH＝12的氢氧化钠缓冲液，使用量5mL)、酶水解(β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)，使用量50μL)、以及不水解(水)作为水解方式，对于南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取检测效果进行考察，对于提取的南极磷虾的泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇粗提取进行上样，上样量10μL，得到不同溶剂提取的每10μL样品液中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的含量，见下表3：
表3 不同水解方法对各目标产物的影响
3、固相萃取柱的优化筛选
HLB柱或C18柱：取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加12mL浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)50μL，于37℃恒温振荡器中酶解12h。样品取出冷却至室温，加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。采用HLB固相萃取柱或C18柱进行净化，具体净化方式为：首先采用6mL水和6mL甲醇冲柱，放入样品后，用6mL水冲柱，之后接NH2柱，用8mL甲醇冲柱洗脱，收集洗脱液，浓缩至1mL，过0.2μm有机滤膜。得到南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的粗提物。将粗体物用上述确立的超高效液相色谱质谱进行检测。
QuEchERS柱：
区别在于：采用QuEChERS固相萃取柱萃取净化，方法为涡旋净化2min，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜。
本发明考察了采用HLB固相萃取柱，C18固相萃取柱，QuEChERS固相萃取柱分别作为净化柱，对于南极磷虾泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取检测效果进行考察，对于提取的南极磷虾的泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇粗提取进行上样，上样量10μL，得到不同溶剂提取的每10μL样品液中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的含量，见下表4：
表4 不同固相萃取柱对各目标产物的影响
从表2～4可知，泼尼松龙最佳提取剂为乙腈，醛固酮、睾酮和雌二醇的最佳提取剂为乙酸乙酯。采用β-葡糖苷酶水解效果最好，采用QuEChERS萃取柱净化效果最好，因此本发明最终确定南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取方法为乙腈或乙酸乙酯提取，酶水解，QuEChERS萃取柱净化，得到充分完全的提取的南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇。
实施例3：
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加12mL浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)50μL,于37℃恒温振荡器中酶解12h。样品取出冷却至室温，加入10mL乙腈，涡旋提取2min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为50℃，用1mL乙腈复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中泼尼松龙粗提物。取10μL粗体物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中泼尼松龙的含量为216.2ng/g。
实施例4
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加12mL浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)50μL,于37℃恒温振荡器中酶解12h。样品取出冷却至室温，加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为50℃，用1mL乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的粗提物。取10μL粗体物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的含量为381.4ng/g，127.7ng/g,393.7ng/g。
实施例5：
取20g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加13mL物质量浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)60μL,于30℃恒温振荡器中酶解10h。样品取出冷却至室温，加入20mL乙酸乙酯，涡旋提取1min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为50℃，用2mL乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的粗提物。取10μL粗体物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的含量为376.9ng/g，121.8ng/g,392.5ng/g。
实施例6
取20g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加13mL物质量浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝5.2),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)60μL,于30℃恒温振荡器中酶解10h。样品取出冷却至室温，加入20mL乙腈，涡旋提取1min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为50℃，用2mL乙腈复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中泼尼松龙的粗提物。取10μL粗体物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中泼尼松龙的含量为215.4ng/g。
实施实例7：
取30g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加15mL物质量浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝6),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)60μL,于40℃恒温振荡器中酶解14h。样品取出冷却至室温，加入30mL乙腈，涡旋提取3min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋3min净化，4500r/min离心8min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为60℃，用3mL乙腈复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中泼尼松龙的粗提物。取10μL粗体物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中泼尼松龙的含量为209.8ng/g。
实施例8
取30g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加15mL物质量浓度2.0mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH＝6),加入β-葡萄糖苷酸酶(10000U/mL)60μL,于40℃恒温振荡器中酶解14h。样品取出冷却至室温，加入30mL乙酸乙酯，涡旋提取3min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋3min净化，4500r/min离心8min，取上清液。旋转蒸发至干，旋蒸温度为60℃，用3mL乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的粗提物。取10μL粗体物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中醛固酮、睾酮和雌二醇的含量为369.9ng/g，126.4ng/g,393.8ng/g。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入乙酸-乙酸钠缓冲液和β-葡萄糖苷酸酶进行酶解；
(3)向上述酶解液中加入乙腈或乙酸乙酯涡旋提取，取上清液；
(4)将步骤(3)所得的上清液用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液；
(5)旋转蒸发至干，用乙腈或乙酸乙酯复溶，过0.2μm滤膜，得到南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，冷冻干燥的温度是-40℃，采用高速组织粉碎机研磨粉碎。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，南极磷虾与乙酸-乙酸钠缓冲液、β-葡萄糖苷酸酶的加入量比(g/mL/μL)为1～3：1.2～1.5：5～6；所述乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为2.0mol·L-1，PH为5～6，优选为PH＝5.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解的温度为30-40℃，酶解的时间为10-14h；优选酶解温度为37℃，酶解时间为12h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，每次涡旋提取时间为1-3min，乙腈或乙酸乙酯的体积为10～30mL，优选涡旋时间为2min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，涡旋时间为1-4min，离心为4000～4500r/min离心5～8min；优选地，涡旋时间为2min，4000r/min离心5min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，旋转蒸发的温度为30-60℃，优选旋转蒸发的温度为50℃；优选地，乙腈或乙酸乙酯复溶体积为1～3mL。
8.权利要求1～7任一所述的制备方法得到含有泼尼松龙和醛固酮、睾酮和雌二醇的产品。
9.权利要求8所述的产品中泼尼松龙和醛固酮、睾酮和雌二醇的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱法。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，液相条件为：色谱柱：AcchromUnitary C18柱，2.1mm×150mm，粒径5μm，柱温：30～35℃，进一步的，柱温为30℃，样品温度10～15℃，进一步的，样品温度为10℃，进样体积10μL；流动相条件为：A相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，B相为甲醇，进一步的，A相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3mL/min，进一步的，流速为0.2mL/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相A20％→30％，流动相B80％→70％；8～10min，流动相A 30％→35％，流动相B70％→65％；色谱条件为：电喷雾离子源，多反应离子检测模式(MRM)，电离电压3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气(N2)，脱溶剂气流量800L/h。
CN201811067978.4A 2018-09-13 2018-09-13 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法 Active CN109030680B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811067978.4A CN109030680B (zh) 2018-09-13 2018-09-13 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811067978.4A CN109030680B (zh) 2018-09-13 2018-09-13 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109030680A true CN109030680A (zh) 2018-12-18
CN109030680B CN109030680B (zh) 2021-07-20

Family

ID=64622003

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811067978.4A Active CN109030680B (zh) 2018-09-13 2018-09-13 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109030680B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110865137A (zh) * 2019-12-03 2020-03-06 天津国科医工科技发展有限公司 一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995014489A1 (en) * 1993-11-22 1995-06-01 Phairson Medical Inc. Composition comprising compounds for use as therapeutical agent
CN107664671A (zh) * 2017-08-18 2018-02-06 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所） 一种动物源食品的残留药物检测方法
CN108051507A (zh) * 2017-11-17 2018-05-18 新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所（新疆维吾尔自治区种羊与羊毛羊绒质量安全监督检验中心） 一种分析羊肉中残留兽药的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995014489A1 (en) * 1993-11-22 1995-06-01 Phairson Medical Inc. Composition comprising compounds for use as therapeutical agent
CN107664671A (zh) * 2017-08-18 2018-02-06 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所） 一种动物源食品的残留药物检测方法
CN108051507A (zh) * 2017-11-17 2018-05-18 新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所（新疆维吾尔自治区种羊与羊毛羊绒质量安全监督检验中心） 一种分析羊肉中残留兽药的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PU CHIEH-HAN 等: "Modified QuEChERS method for 24 plant growth regulators in grapes using LC-MS/MS", 《JOURNAL OF FOOD AND DRUG ANALYSIS》 *
章超桦 等: "《水产食品学》", 30 October 2010, 中国农业出版社 *
连英杰 等: "QuEChERS/超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测鸡肉中11种激素类药物残留", 《食品安全质量检测学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110865137A (zh) * 2019-12-03 2020-03-06 天津国科医工科技发展有限公司 一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN109030680B (zh) 2021-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Raml et al. Improved chromatographic separation of thio-arsenic compounds by reversed-phase high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry
Fan et al. A rapid, accurate and sensitive method for determination of monosaccharides in different varieties of Osmanthus fragrans Lour by pre-column derivatization with HPLC-MS/MS
CN109001335A (zh) 用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法
Xue et al. Analysis of coenzyme Q10 in bee pollen using online cleanup by accelerated solvent extraction and high performance liquid chromatography
CN106770819B (zh) 一种液质联用定量检测大鼠血浆中叶酸浓度的方法
Li et al. Simultaneous determination of matrine, sophoridine and oxymatrine in Sophora flavescens Ait. by high performance liquid chromatography
CN106501382A (zh) 一种鱼肉中汞化合物的提取和检测方法
CN109030680A (zh) 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法
CN109738562B (zh) 液相色谱串联质谱同步检测植物油料多酚的方法
CN104840488A (zh) 一种中药蟾酥提取物及其制备方法
Takatsuki et al. Liquid chromatographic determination of free and added niacin and niacinamide in beef and pork
CN109432302A (zh) 一种铁皮石斛酚的提取方法
Jia et al. Application of a liquid chromatography–tandem mass spectrometry method to the pharmacokinetics, tissue distribution and excretion studies of brazilin in rats
Zhang Biodistribution evaluation of icaritin in rats by ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry
CN109884199A (zh) 一种蜂蜜中黄酮类成分的含量测定方法
Yu et al. Simultaneous determination of safflor yellow a, puerarin, daidzein, ginsenosides (Rg1, Rb1, Rd), and notoginsenoside R1 in rat plasma by liquid chromatography–mass spectrometry
Chen et al. Determination of five polyphenols by HPLC/DAD and discrimination of apple varieties
Li et al. Determination of Steroid Hormone Residues in Fish Tissues Using Gel Permeation Chromatography and Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CN108918728A (zh) 一种南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取以及检测方法
Zhang Ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the quantification of icaritin in mouse bone
CN103575820A (zh) 血浆中5种黄酮苷的分析方法及其在药代动力学中的应用
CN108918727A (zh) 一种南极磷虾中激素类物质的提取及检测方法
CN107037139B (zh) 免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法
Jia et al. Application of liquid chromatography-mass spectrometry technology in the detection of pyrrolizidine alkaloids in agricultural products
Jiang et al. Characterisation of hederacoside C metabolites using ultrahigh‐performance liquid chromatography quadrupole Orbitrap mass spectrometry based on automatic fragment ion search

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant