CN104840488A - 一种中药蟾酥提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种中药蟾酥提取物及其制备方法，属药品技术领域。该提取物制备方法为：蟾酥药材粉碎成中粉，加4-10倍水研磨分散；加乙醇醇沉，低温冷藏；上清液加氯化钠低温盐析；减压浓缩至块状蟾酥提取物析出，减压干燥或浓缩至近干后真空干燥，加入乙醇重结晶，得到的蟾酥提取物含酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基混合物的转移率约为80％，且三种蟾毒配基的重量百分比之和≥35％。该方法提取蟾酥转移率及有效成份含量高，无有机溶剂残留，操作简便，能耗低，产品质量易于控制，适合工业化生产。

Description

一种中药蟾酥提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药蟾酥提取物及其制备方法，属于药品技术领域。

背景技术

蟾酥是常用中药，早在汉代已有应用，《神农本草经》中记载为“味辛寒主那气，破疙坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病。”中医认为蟾酥性味为辛，温；有毒，归心经，具有解毒，止痛，开窍醒神之功效。现代研究表明蟾酥具有抗肿瘤、强心、升压等多种药理作用。特别是对心血管领域及抗肿瘤领域的显著疗效，使得近年来中药蟾酥得到了广泛研究和应用，蟾酥化学成份主要有：①蟾蜍毒素类(bufotoxins)，包括蟾毒、蟾毒配基脂肪酸酯和蟾毒配基硫酸酯等；②蟾毒配基类(bufogenins)，是蟾蜍毒素在加工炮制过程中的分解产物，如脂蟾毒配基(resibufogenin)、华蟾毒精(cinobufagin)和蟾毒灵(bufalin)为蟾酥的3种主要活性单体，并且在抗肿瘤及强心作用上以均以此类活性最强；③蟾毒色胺类(bufotenines)，该类化合物均含有吲哚环，属蟾蜍加工炮制过程中分解产物的水溶性部分，是具有一定生物活性的吲哚类生物碱；④其他化合物，蟾酥还含有氨基酸、有机酸、肾上腺素、吗啡、多肽及多糖等。

目前蟾酥提取物的常见提取方法：1、用一定浓度的乙醇加热回流提取、浓缩、干燥；2、用一定浓度的乙醇加热回流提取后上硅胶柱，用有不同比例的机溶剂洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥。按第1种方法回流提取，虽然操作简单，所得提取物的杂质多，有效成份(以脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵计)含量较低，很难满足载药量小的剂型的制剂要求；第2中方法虽然能够得到含量较高成份或单体，可操作过程复杂，有机溶剂可能对环境产生污染，所得到的各个单体中不可避免会存在有机溶剂的残留，制备成单体投料很难保证中药各成份的协同作用。鉴于以上问题，本发明提出了一种蟾酥提取的新方法，应用低温提取降低有效成份的降解和转化，在保留蟾酥原有有效成份基础上，尽量去除蛋白质及多糖等杂质，能够较大限度的保留了蟾酥各成份间的协同作用，此法具有操作简单，所得提取物能保留蟾酥的多种有效成份，且含量较高，不含有机溶剂残留等优点。用此方法提取的蟾酥提取物保留原有功效的同时突破载药量的限制，适合制备成多种剂型，可较为广泛的应用。

发明内容

本发明是提供一种操作简单，保留原有有效成份，转移率高，不含有机溶剂的蟾酥提取物的制备方法，按此方法操作可直接干燥得到含蟾酥配基含量较高的提取物，以脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵总含量计可达35％以上。

1.本发明所述的蟾酥提取物的制备方法包括以下步骤：

(1)蟾酥药材粉碎成中粉，加水研磨分散使过100目。

(2)将步骤(1)所得的含蟾酥的混悬液加乙醇至含醇量为60％-80％，药液在2-10℃条件下低温冷藏提取；

(3)抽取步骤(2)的上清液加氯化钠盐析，在2-10℃条件下低温盐析12小时；

(4)吸取步骤(3)的上清液，减压浓缩至块状蟾酥提取物析出，50-75℃减压干燥；或将步骤(3)的上清液减压浓缩至近干后真空干燥，再加入3-6倍量的乙醇重结晶。

2、本发明的创新点

2.1 蟾酥的提取方式：传统的用一定浓度的乙醇加热回流提取，提取药材的细度要求为中粉或细粉，本发明改变为最细粉的冷藏提取，减少蟾酥各成份间的转化，减少提取物中的杂质，同时降低能耗。

2.2 蟾酥药材的粉碎方式：蟾酥粉碎过60目后加水4-10倍的水研磨分散，本发明的蟾酥粉碎方法即非传统的直接粉碎也有别于通常的水飞操作，蟾酥加水研磨分散是蟾酥提取的关键步骤，分散细度均对蟾酥的提取影响较大，本发明对分散细度进行了对比研究。

2.3 蟾酥提取物从浓缩液中的分离方式：蟾酥提取物在浓缩过程中能够聚集析出，通过过筛的方式与浓缩液分离。蟾酥提取液中加入氯化钠后，除使蛋白质进一步沉淀除去外，也增大了提取液的极性，通过浓缩回收乙醇使蟾酥提取物在浓缩过程中能够聚集析出；对于由于药材研磨过细的提取物可干燥后加入3-6倍量的乙醇重结晶，也可得到含量较高的提取物。

3.本发明方法制备蟾酥提取物的试验摸索

3.1 试验材料

蟾酥：由临沂康宇中药饮片有限公司提供，产地山东。华蟾酥毒基对照品(批号：110803-200605)，脂蟾毒配基(批号：110718-201108)均由中国药品生物制品检定所提供，蟾毒灵(批号：131213)由成都普菲德生物技术有限公司提供。所用试剂中乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他为分析纯。

3.2 试验仪器：

Agilent 1260高效液相色谱系统；色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)(Agilent公司)；BüCHI旋转蒸发仪(德国)；岛津AW120电子分析天平(日本)。

3.3 检验方法：

药材检验：蟾毒灵对照品加甲醇配制成1ml中含蟾毒灵20μg的溶液，其它依照《中国药典》2010年版蟾酥含量测定项下的方法检测。本发明提取物检验：样品制备：精密称取25mg至25ml容量瓶中加甲醇适量超声处理30min，补足损失的重量，过滤，吸取续滤液5ml至50ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得；其它同药材检测方法。

3.4 提取条件的研究：

3.4.1 原药材含量测定：蟾酥原药材经上述方法测定三种指标性成份的质量百分含量(w/w)：脂蟾毒配基2.73％、华蟾酥毒基4.87％、蟾毒灵2.32％，

3.4.2 提取条件的单因素考察

3.4.2.1 蟾酥加水研磨分散细度考察：蟾酥药材粉碎过60，取4份，每份10g加水5倍量用研钵研磨分散，分别使分散在60-80目；80-100目；100-200目以及200目以上，得的不同粒度的蟾酥粉悬浊液，加乙醇至含醇量为70％，在2℃条件下冷藏24小时，取上清液，加入1％氯化钠，继续在上述温度下冷藏12小时，取上清液浓缩至固体析出物或浓缩膏，干燥，得蟾酥提取物，按3.3项下的方法测定各蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵的含量见下表1：

表1：不同粒度提取转移率考察表

通过以上实验表明：蟾酥提取粒度对有效成份转移率有较为显著的影响，粒度越小转移率越高，粒度过细超过200目时提取物中有效成份的转移率无明显变化，含量明显降低。

3.4.2.2 提取温度考察：取粉碎100-200目的蟾酥粉末5份，每份10g加水5倍量用研钵稍研磨分散，加乙醇至含醇量为70％，分别在-5、-1，2，5，10℃条件下冷藏24小时，取上清液，加入1％氯化钠，继续在上述温度下冷藏12小时，取上清液浓缩，得固体析出物，干燥，得蟾酥提取物，按3.3项下的方法测定各蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵的含量见下表2：

表2：不同温度提取转移率考察表

通过以上实验表明：蟾酥提取温度对有效成份转移率有较为显著的影响，温度过低时转移率低，温度为10℃有效成份转移率无明显变化，含量略有降低提出的杂质增加。

3.4.2.3 提取时间考察：取粉碎100-200目的蟾酥粉末5份，每份10g加水5倍量用研钵稍研磨分散，加乙醇至含醇量为70％，在2℃条件下分别冷藏12、18、30、48、72小时，取上清液，加入1％氯化钠，继续在上述温度下冷藏12小时，取上清液浓缩，得固体析出物，干燥，得蟾酥提取物，按3.3项下的方法测定各蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵的含量，结合3.4.2.2中提取24小时的实验数据，提取时间对转移率的影响见下表3：

表3：不同提取时间转移率考察表

通过以上实验表明：蟾酥提取时间在12-72小时内对有效成份转移率影响较小，在18-48小时内无明显变化，过长或过短均可影响有效成份的转移率。

3.4.2.4 提取乙醇浓度考察：取粉碎100-200目的蟾酥粉末2份，每份10g加水5倍量用研钵稍研磨分散，分别加乙醇至含醇量为60％、80％，在2℃条件下分别冷藏24小时，取上清液，加入1％氯化钠，继续在上述温度下冷藏12小时，取上清液浓缩，得固体析出物，干燥，得蟾酥提取物，按3.3项下的方法测定各蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵的含量，结合3.4.2.2中70％的乙醇提取的实验数据，乙醇浓度对转移率的影响见下表4：

表4：不同乙醇浓度转移率考察表

通过以上实验表明：蟾酥提取乙醇浓度对有效成份转移率影响较小，70％与80％的浓度对提取的转移率及收率无明显变化，60％的乙醇提取收率较高有效成份的转移率略有降低。

3.5 方法验证：同一批次蟾酥药材粉碎过60目筛，取3份，每份10g加水5倍量用研钵研磨分散，使分散粒度80％以上在100-200目之间，得蟾酥粉悬浊液，加乙醇至含醇量为70％，在5℃条件下冷藏24小时，取上清液，加入1％氯化钠，继续在上述温度下冷藏12小时，取上清液浓缩，固体析出物干燥，得蟾酥提取物，按3.3项下的方法测定各蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵的含量见下表5：

表5：用本发明的方法制备三次所得提取物的结果

说明：本发明的方法提取，收率及指标性成份转移率均较为稳定，提取物质量稳定。

3.5 本发明方法的适用性检查：

用三个批次蟾酥药材分别用以下两种方法提取：1、药材粉碎过65目筛，用80％的乙醇每次10倍量，加热回流提取两次，每次45min，减压干燥；2、本发明的方法提取。两种不同方法的到的提取物三种指标性成份的对比见下表：

注：表格中字母A.蟾毒灵、B.华蟾酥毒基、C.脂酥毒配基；*标示为三组试验的平均值。通过以上实验可知：

两种方法对指标性成份的转移率无明显差异，应用本发明的方法所得提取物指标性成份的含量明显高于第1种方法，本发明的蟾酥提取物的制备方法提取物的收率及指标性成份的转移率均稳定，说明本发明有普遍的适用性。

具体实施方式

1.本发明所述的蟾酥提取物的制备方法包括以下步骤：

(1)蟾酥药材粉碎成中粉，加水研磨分散使过100目。

(2)将步骤(1)所得的含蟾酥的混悬液加乙醇至含醇量为60％-80％，药液在2-10℃条件下低温冷藏提取；

(3)抽取步骤(2)的上清液加氯化钠盐析，在2-10℃条件下低温盐析12小时；

(4)吸取步骤(3)的上清液，减压浓缩至块状蟾酥提取物析出，50-75℃减压干燥；或将步骤(3)的上清液减压浓缩至近干后真空干燥，再加入3-6倍量的乙醇重结晶。

步骤(3)所得上清液也可经硅胶柱分离，得到纯度更高的提取物或单体。

2.本发明的注意操作的注意要点：

2.1 蟾酥粉碎成中粉后加入水量最佳为5-8倍；

2.2 蟾酥研磨分散后的细度对提取至关重要，过粗有效物质不易浸出，转移率低，经过研究确定分散后蟾酥粉的细度应在100-200目，浓缩、干燥可得含脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵总量35％以上的蟾酥提取物；药材粉碎细度超过200目时，直接浓缩干燥后有效成份含量低，需要进行重结晶；

2.3 本发明中提取的冷时间最佳时间为18-30小时；超过48小时后转移率有效成份降低，冷藏温度为2-10℃。冷藏提取的时间不宜过长，温度过高或过低，时间及温度均影响指标性成份的含量。

2.4 本发明所述的提取用最佳乙醇浓度为70％-80％，浓度较低时提取的转移率及提取物的有效成份含量均降低。

本法操作简单，能耗低，产品可发挥药物的协同作用，提取有效成份纯度较高，不含有机溶剂，提取物适用范围广，质量易于控制，适合工业化生产。

Claims (6)

1.一种中药蟾酥提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)蟾酥药材粉碎成中粉，加水研磨分散使过100目；

(2)将步骤(1)所得的含蟾酥的混悬液加乙醇至含醇量为60％-80％，药液在2-10℃条件下低温冷藏提取；

(3)抽取步骤(2)的上清液加氯化钠盐析，在2-10℃条件下低温盐析12小时；

(4)吸取步骤(3)的上清液，减压浓缩至块状蟾酥提取物析出，50-75℃减压干燥；或将步骤(3)的上清液减压浓缩至近干后真空干燥，再加入3-6倍量的乙醇重结晶。

2.根据权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其特征在于步骤(1)中蟾酥分散后的细度应为100目以上。

3.根据权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其特征在于步骤(2)中醇沉提取的最佳时间为18-30小时，最长不可超过48小时；温度为2-10℃。

4.根据权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其特征在于步骤(2)中，乙醇的浓度控制在70％-80％，最低不得低于60％。

5.根据权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其特征在于步骤(4)，所得提取物有效成份较低时可重结晶提高有效成份的含量。

6.根据权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其特征在于步骤(3)所得上清液也可经硅胶柱分离，得到纯度更高的提取物或单体。