CN107459548B - 一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法 - Google Patents

一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法，该方法用甲醇回流提取鹿仙草，提取液浓缩后乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取物浓缩回收后，浸膏用甲醇溶解石油醚萃取，取甲醇层过碱性氧化铝柱脱去酚性成分，再经硅胶柱层析，氯仿甲醇洗脱得到蛇菰素A、蛇菰素B，甲醇水结晶得到高纯度单体化合物；本发明方法采用溶剂萃取去除大量杂质，提高了上样样品中目标物含量，为后续柱层析过程中节省了柱层析填料用量和洗脱溶剂，不需反复柱层析减少了过柱过程中对目标物的死吸附量，最大限度节约了时间和溶剂，大大提高制备效率，降低了成本，且提取时间短、提取率高，实现了大量、快速、低成本、高效的制备。

Description

一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法
技术领域
本发明属于植物活性成分提取领域，具体涉及一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法。
背景技术
鹿仙草（Balanophora involucrata Hook.f.）为蛇菰科蛇菰属植物，别名蛇菰，蛇菰为寄生性草本植物，退化较强、一年或多年生，生长季节性强，生长期短，故资源稀少。鹿仙草资源分布：分布于福建、湖北、广东、广西、四川、云南等地；具有壮阳补肾，理气健脾，止血生肌，清热解毒的功效；民间常用于治疗阳痿，慢性肝炎，消化道出血，月经过多，遗精，肿瘤等症。
鹿仙草主含化学成分为三萜类、甾醇类、多酚类；其中鹿仙草蛇菰素具有良好的抗肿瘤活性。1919年Simon等人从蛇菰中分离出蛇菰素；1998年，刘锡葵等人正式提出蛇菰素分为蛇菰素A(balanophorin A)和蛇菰素B(balanophorin B)。在抗肝损伤药物研究中已经证明了蛇菰素具有较强的保肝活性。蛇菰素有修复酒精性肝损害作用，具有解酒毒作用。在抗肿瘤方面，鹿仙草蛇菰素对小鼠实体型肝肿瘤H22具有良好的抗肿瘤活性；其作用机理为蛇菰素与肝癌细胞内的DNA、蛋白质相作用，从而诱导肝癌细胞凋亡。国药准字Z20025653鹿仙草颗粒对肝癌细胞的生长有显著的抑制作用、对人体毒副作用低，用于对肝癌的治疗。
蛇菰属植物属于天然药物，疗效好且对人体的毒副作用小，堪称绿色疗法，所以，深入研究该属植物对于今后在抗肝炎，抗肿瘤方面的临床应用有着积极的意义。另外，蛇菰属植物在我国分布较广，具有较好的开发利用价值。
鹿仙草蛇菰素护肝和治疗肝病方面有重要的作用，对人体的副作用小，值得进一步的研究与开发。文献对鹿仙草的活性成分及药理作用方面的研究较多，很少涉及到对鹿仙草活性成分蛇菰素提取及纯化研究，大多报道仅是提取粗提物，比如乙酸乙酯或氯仿提取物，未对粗提物中主要活性成分蛇菰素的分离纯化方法深入研究，且粗提方法简单、单一，普遍存在提取率偏低，蛇菰素纯度不高的缺点。
发明内容
针对现有技术的不足和缺陷，本发明提供了一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法，该方法具体步骤如下：
（1）鹿仙草粉碎、粗提
A、将鹿仙草粉碎至60-100目；
B、在粉碎后的鹿仙草中加入体积浓度80-95%的甲醇溶液进行回流提取，提取2-4小时，过滤得提取液，药渣再加入体积浓度80-95%的甲醇溶液回流提取1-2小时，过滤得二次提取液，合并提取液，50-60℃下真空浓缩回收甲醇，得粗膏；
（2）粗膏萃取处理
A、在粗膏中加入其质量2-3倍的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并2次萃取所得乙酸乙酯相，50-60℃下真空浓缩回收乙酸乙酯，得到浸膏；
B、将浸膏用其质量3-4倍的甲醇溶解后，加入等体积甲醇量的石油醚溶液萃取，弃石油醚层，萃取2-3次，合并得到甲醇萃取层；
（3）氧化铝过柱去除酸性酚类杂质
取碱性氧化铝进行干法装柱，将甲醇萃取层过碱性氧化铝柱，吸附去除甲醇萃取物中酚酸类成分，收集流出液，50-60℃下真空浓缩，得蛇菰素粗品浸膏；
（4）硅胶柱精分
A、在蛇菰素粗品浸膏中加入等质量的60-100目硅胶拌样，50-60℃干燥后，碾碎备用；
B、使用200-400目的硅胶装柱，以10-20mL/min 流速用氯仿溶液平衡硅胶柱5-8分钟；
C、将拌样后样品进行干法上样，以氯仿-甲醇混合液为洗脱剂，洗脱流速为10-15mL/min，
按每50mL体积接取1份洗脱液，薄层层析鉴别蛇菰素A和蛇菰素B，分别收集合并含蛇菰素A和含蛇菰素B的洗脱液，浓缩，得蛇菰素A和蛇菰素B；
D、将蛇菰素A和蛇菰素B用体积浓度70%甲醇溶解，敞口静置，分别得白色蛇菰素A和蛇菰素B结晶；将蛇菰素A和蛇菰素B进行冷冻干燥制备得高纯度单体。
所述步骤（1）B中添加粉碎后鹿仙草质量6-7倍的甲醇溶液，二次提取时添加其质量4-5倍的甲醇溶液。
所述氯仿-甲醇混合液是氯仿和甲醇按体积比13:2的比例混合制得。
本发明方法步骤（2）中溶剂萃取方法为乙酸乙酯萃取，浸膏制成甲醇液后采用石油醚脱脂，采用溶剂萃取去除大量杂质，提高了上样样品中目标物含量，为后续柱层析过程中节省了柱层析填料用量和洗脱溶剂；步骤（3）中通过碱性氧化铝吸附法去除萃取粗提取物中的酚类、黄酮类杂质；步骤（4）中精细分离方法为硅胶柱层析法、洗脱液为氯仿-甲醇混合液。
本发明采用溶剂萃取法、碱性氧化铝柱脱杂质方法去除大量非目标物杂质，大大提高上样物中蛇菰素A、蛇菰素B含量，再经硅胶柱层析，重结晶得到高纯度蛇菰素A和蛇菰素B单体，该法不需要反复硅胶柱层析或昂贵的色谱制备分离，蛇菰素在柱层析中死吸附量少，最大限度节约了时间和溶剂；大大提高制备效率，降低了成本，且提取时间短、提取率高，该提取分离方法实现了大量、快速、低成本、高效的制备，适用于产业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法步骤如下：
（1）鹿仙草粉碎、粗提
A、将鹿仙草粉碎至60目；
B、在粉碎后的鹿仙草中加入鹿仙草质量7倍的体积浓度80%的甲醇溶液进行回流提取，提取4小时，过滤得提取液，药渣再加入鹿仙草质量5倍的体积浓度80%的甲醇溶液回流提取2小时，过滤得二次提取液，合并提取液，50℃下真空浓缩回收甲醇，得粗膏；
（2）粗膏萃取处理
A、在粗膏中加入其质量2倍的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并2次萃取所得乙酸乙酯相，50℃下真空浓缩回收乙酸乙酯，得到浸膏；
B、将浸膏用其质量3倍的甲醇溶解后，加入等体积甲醇量的石油醚萃取，弃石油醚层，萃取2次，合并得到甲醇萃取层；
（3）氧化铝过柱去除酸性酚类杂质
取200目碱性氧化铝进行干法装柱，将甲醇萃取层过碱性氧化铝柱，吸附去除甲醇萃取物中酚酸类成分，收集流出液，50℃下真空浓缩，得蛇菰素粗品浸膏；
（4）硅胶柱精分
A、在蛇菰素粗品浸膏中加入等质量的60目硅胶拌样，50℃干燥后，碾碎备用；
B、使用200目的硅胶装柱，以10mL/min 流速用氯仿溶液平衡硅胶柱8分钟；
C、将拌样后样品进行干法上样，以氯仿-甲醇混合液（氯仿和甲醇按体积比13:2的比例混合）为洗脱剂，洗脱流速为10mL/min，按每50mL体积接取1份洗脱液，薄层层析鉴别蛇菰素A和蛇菰素B，分别收集合并含蛇菰素A和含蛇菰素B的洗脱液，浓缩，得蛇菰素A和蛇菰素B；
D、将蛇菰素A和蛇菰素B用体积浓度70%甲醇溶解，敞口静置2天，分别得白色蛇菰素A和蛇菰素B结晶；将蛇菰素A和蛇菰素B结晶进行冷冻干燥，制备得含量97.6%的蛇菰素A和含量94.8%的蛇菰素B，蛇菰素A回收率为85.3%，蛇菰素B回收率84.6%。
实施例2：本从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法步骤如下：
（1）鹿仙草粉碎、粗提
A、将鹿仙草粉碎至80目；
B、在粉碎后的鹿仙草中加入鹿仙草质量6倍的体积浓度85%的甲醇溶液进行回流提取，提取3小时，过滤得提取液，药渣再加入鹿仙草质量4倍的体积浓度85%的甲醇溶液回流提取1.5小时，过滤得二次提取液，合并提取液，60℃下真空浓缩回收甲醇，得粗膏；
（2）粗膏萃取处理
A、在粗膏中加入其质量3倍的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并2次萃取所得乙酸乙酯相，55℃下真空浓缩回收乙酸乙酯，得到浸膏；
B、将浸膏用其质量4倍的甲醇溶解后，加入等体积甲醇量的石油醚溶液萃取，弃石油醚层，萃取3次，合并得到甲醇萃取层；
（3）氧化铝过柱去除酸性酚类杂质
取200目碱性氧化铝进行干法装柱，将甲醇萃取层过碱性氧化铝柱，吸附去除甲醇萃取物中酚酸类成分，收集流出液，55℃下真空浓缩，得蛇菰素粗品浸膏；
（4）硅胶柱精分
A、在蛇菰素粗品浸膏中加入等质量的100目硅胶拌样，55℃干燥后，碾碎备用；
B、使用300目的硅胶装柱，以15mL/min 流速用氯仿溶液平衡硅胶柱6分钟；
C、将拌样后样品进行干法上样，以氯仿-甲醇混合液（氯仿和甲醇按体积比13:2的比例混合）为洗脱剂，洗脱流速为12mL/min，按每50mL体积接取1份洗脱液，薄层层析鉴别蛇菰素A和蛇菰素B，分别收集合并含蛇菰素A和含蛇菰素B的洗脱液，浓缩，得蛇菰素A和蛇菰素B；
D、将蛇菰素A和蛇菰素B用体积浓度70%甲醇溶解，敞口静置2天，分别得白色蛇菰素A和蛇菰素B结晶；将蛇菰素A和蛇菰素B结晶进行冷冻干燥，制备得含量96.5%的蛇菰素A和含量93.4%的蛇菰素B，蛇菰素A回收率为85.3%，蛇菰素B回收率84.1%。
实施例3：本从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法步骤如下：
（1）鹿仙草粉碎、粗提
A、将鹿仙草粉碎至100目；
B、在粉碎后的鹿仙草中加入鹿仙草质量6倍的体积浓度90%的甲醇溶液进行回流提取，提取2小时，过滤得提取液，药渣再加入鹿仙草质量5倍的体积浓度90%的甲醇溶液回流提取1小时，过滤得二次提取液，合并提取液，55℃下真空浓缩回收甲醇，得粗膏；
（2）粗膏萃取处理
A、在粗膏中加入其质量2.5倍的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并2次萃取所得乙酸乙酯相，60℃下真空浓缩回收乙酸乙酯，得到浸膏；
B、将浸膏用其质量3.5倍的甲醇溶解后，加入等体积甲醇量的石油醚萃取，弃石油醚层，萃取2次，合并得到甲醇萃取层；
（3）氧化铝过柱去除酸性酚类杂质
取200目碱性氧化铝进行干法装柱，将甲醇萃取层过碱性氧化铝柱，吸附去除甲醇萃取物中酚酸类成分，收集流出液，60℃下真空浓缩，得蛇菰素粗品浸膏；
（4）硅胶柱精分
A、在蛇菰素粗品浸膏中加入等质量的80目硅胶拌样，60℃干燥后，碾碎备用；
B、使用200目的硅胶装柱，以20mL/min 流速用氯仿溶液平衡硅胶柱5分钟；
C、将拌样后样品进行干法上样，以氯仿-甲醇混合液（氯仿和甲醇按体积比13:2的比例混合）为洗脱剂，洗脱流速为15mL/min，按每50mL体积接取1份洗脱液，薄层层析鉴别蛇菰素A和蛇菰素B，分别收集合并含蛇菰素A和含蛇菰素B的洗脱液，浓缩，得蛇菰素A和蛇菰素B；
D、将蛇菰素A和蛇菰素B用体积浓度70%甲醇溶解，敞口静置2天，分别得白色蛇菰素A和蛇菰素B结晶；将蛇菰素A和蛇菰素B进行冷冻干燥，制备得含量95.1%的蛇菰素A和和含量93.1%的蛇菰素B，蛇菰素A回收率为88.3%，蛇菰素B回收率86.7%。

Claims (2)

1.一种从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法，其特征在于步骤如下：
（1）鹿仙草粉碎、粗提
A、将鹿仙草粉碎至60-100目；
B、在粉碎后的鹿仙草中加入体积浓度80-95%的甲醇溶液进行回流提取，提取2-4小时，过滤得提取液，药渣再加入体积浓度80-95%的甲醇溶液回流提取1-2小时，过滤得二次提取液，合并提取液，50-60℃下真空浓缩回收甲醇，得粗膏；
（2）粗膏萃取处理
A、在粗膏中加入其质量2-3倍的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并2次萃取所得乙酸乙酯相，50-60℃下真空浓缩回收乙酸乙酯，得到浸膏；
B、将浸膏用其质量3-4倍的甲醇溶解后，加入等体积甲醇量的石油醚萃取，弃石油醚层，萃取2-3次，合并得到甲醇萃取层；
（3）氧化铝过柱去除酸性酚类杂质
取碱性氧化铝进行干法装柱，将甲醇萃取层过碱性氧化铝柱，收集流出液，50-60℃下真空浓缩，得蛇菰素粗品浸膏；
（4）硅胶柱精分
A、在蛇菰素粗品浸膏中加入等质量的60-100目硅胶拌样，50-60℃干燥后，碾碎备用；
B、使用200-400目的硅胶装柱，以10-20mL/min 流速用氯仿溶液平衡硅胶柱5-8分钟；
C、将拌样后样品进行干法上样，以氯仿-甲醇混合液为洗脱剂，洗脱流速为10-15mL/min，
按每50mL体积接取1份洗脱液，薄层层析鉴别蛇菰素A和蛇菰素B，分别收集合并含蛇菰素A和含蛇菰素B的洗脱液，浓缩，得蛇菰素A和蛇菰素B；
D、将蛇菰素A和蛇菰素B用体积浓度70%甲醇溶解，敞口静置，分别得白色蛇菰素A和蛇菰素B结晶；将蛇菰素A和蛇菰素B进行冷冻干燥制备得高纯度单体；
所述氯仿-甲醇混合液是氯仿和甲醇按体积比13:2的比例混合制得。
2.根据权利要求1所述的从鹿仙草中提取制备蛇菰素的方法，其特征在于：步骤（1）B中添加粉碎后鹿仙草质量6-7倍的甲醇溶液，二次提取时添加其质量4-5倍的甲醇溶液。
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