CN107050095B - 一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，将绞股蓝药材低温烘干、粉碎、过筛后，超声波加热提取，澄清，过滤，抽滤，上清液浓缩后通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇味，冷冻、冻干后得到总皂苷样品，将总皂苷样品用去离子水溶解，加酸加热水解，水解结束后调节溶液pH值，薄层色谱法鉴定寡糖，最后将水解后得的溶液浓缩、大孔树脂吸附，去离子水洗脱至无糖后，收集洗脱液，浓缩，冷冻、冻干后得绞股蓝皂苷侧链寡糖。本发明的优点在于绞股蓝总皂苷的提取溶剂为水，溶剂成本小，无毒易获取，药材粉碎后加热超声波提取，提取时间在15～45min，大大降低提取时间，提高工作效率，缩短绞股蓝总皂苷的生产周期。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材制备技术领域，具体涉及一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法。
背景技术
绞股蓝（Gynostemma Pentaphyllum(Thunb.)Makino）为葫芦科绞股蓝属多年生藤本植物的干燥全草，主要分布于我国南部，号称“南方人参”，1986年被国家科委列为待开发的首位“名贵中药材”，2003年被国家卫生部列入保健品名单。现代药理学研究表明，绞股蓝具有降低血脂、降血压、防止衰老、抑制肿瘤、增强免疫力、保护血管、抗动脉粥样硬化等作用，这些药理作用主要是由绞股蓝中的有效活性成分产生的。研究表明，绞股蓝全草中含有绞股蓝皂苷、绞股蓝多糖、黄酮类、蛋白质、脂肪、维生素和纤维素等，其中的主要活性成分为皂苷类、多糖类和黄酮类。目前，研究证实的绞股蓝皂苷多达84种，其中有6种的结构和人参皂苷相同，且在优良体系绞股蓝中，这6种皂苷的含量均高于人参。除此之外，很多绞股蓝皂苷水解产生的次生苷，苷元和次级苷元和人参皂苷水解产物相同。所以，绞股蓝号称“南方人参”。
绞股蓝皂苷的基本化学结构是达玛烷型四环三萜类，C3位和C20位羟基上多半连接糖链，主要由β-D-葡萄吡喃糖、α-L-鼠李吡喃糖和β-D-木吡喃糖组成，亦有少数的α-L-阿吡喃糖，现在的研究主要集中在皂苷、苷元的分离和活性研究上，对皂苷侧链上的糖链研究甚少。
绞股蓝总皂苷的提取方法已有很多文献及专利报道，如CN201410481903.6报道了一种从绞股蓝中提取纯化绞股蓝皂苷的方法，CN103923150B报道了绞股蓝皂苷及其制备方法。然而，已有的报道中没有对其侧链寡糖进行进一步的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法。
本方案中一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）将绞股蓝低温干燥后粉碎成粉末，过筛形成绞股蓝粉末，将绞股蓝粉末和去离子水按重量比1：40～60的比例混合后超声波加热进行提取，提取结束后，澄清，过滤得到滤液；
（2）在步骤（1）的滤液中放入硅藻土进行抽滤，得到澄清的溶液，将溶液浓缩后得浓缩液；
（3）将步骤（2）中浓缩液通过预处理好的大孔树脂进行吸附，用水洗脱至无色，再使用70～90%的乙醇洗脱，得到乙醇洗脱液；
（4）将步骤（3）中乙醇洗脱液浓缩，然后冷冻得绞股蓝总皂苷样品；
（5）取步骤（4）中绞股蓝总皂苷样品于反应瓶中，用去离子水配制成含绞股蓝总皂苷1%的溶液，然后在溶液中加入三氯乙酸，随后通入氮气，密封后放入干燥箱中加热水解，水解结束后取出，迅速冰浴降温，然后在降温后的水解液中加入氨水调节pH值至6.5～8；
（6）取步骤（5）中水解液，浓缩后使用预处理好的大孔树脂吸附，用水洗脱至无糖分出现，收集水洗脱液，将其浓缩、冷冻后得到绞股蓝总皂苷侧链寡糖。
本发明的工作原理及有益效果：本发明的工作原理是利用超声波加热水提后获得绞股蓝总皂苷粗提物，水提液含有大量糖类、黄酮类及植物色素类等杂质，需要使用大孔吸附树脂对皂苷类物质进行纯化。纯化时，利用皂苷极性较小的性质，使用高浓度的乙醇进行洗脱，大孔树脂可以选择D101，AB-8，NKA-
型大孔吸附树脂。洗脱液浓缩后冻干得到绞股蓝总皂苷。将总皂苷进行水解，大孔树脂纯化后得到绞股蓝皂苷侧链寡糖，本发明深入研究绞股蓝侧链寡糖的提取纯化方法，且对绞股蓝皂苷的提取方法进行改进。
具体体现在：（1）水提绞股蓝时，加入稳定剂柠檬酸钠及乙二胺四乙酸混合溶液，避免提取液中皂苷类物质絮凝成不定性沉淀或胶体，影响皂苷产率。（2）大孔树脂吸附之前先通过硅藻土，吸附悬浮的微小杂质，可以提高大孔吸附树脂的吸附效率及产物纯度。（3）使用冻干技术除掉浓缩物中的水分，除水率高，能除掉95～99%的水分，且干燥后的物质疏松多孔，加溶剂后可迅速溶解，不影响化合物本身的性质。（4）选择三氯乙酸对绞股蓝总皂苷进行水解，相比三氟乙酸，价格便宜且易得，水解效率相当。密封水解，水解效率高，水解之前通入氮气，避免氧气和二氧化碳在高温下影响水解反应，提高绞股蓝总皂苷侧链寡糖的得率。（5）选择大孔树脂对寡糖进行纯化，绞股蓝侧链寡糖能溶于水，收集水洗脱液富集后即得最终产物，且纯度较高。
与现有技术相比，本发明的优点在于绞股蓝总皂苷的提取溶剂为水，溶剂成本小，无毒易获取，药材粉碎后加热超声波提取，提取时间在15～45min，大大降低提取时间，提高工作效率，缩短绞股蓝总皂苷的生产周期；硅藻土抽滤后吸附，提高吸附效果及收率，密封加热水解，提高水解效率，冷冻干燥技术增强产物的稳定性。
进一步细化的，所述步骤（1）的干燥温度为35～45℃，粉碎粒径为50～300目，提取溶剂为去离子水，超声波功率为15～25W，热提温度为75～85℃，提取时间15～45min。选择35～45℃对药材进行干燥，避免有效成分在高温下变性或部分挥发性物质受热挥发，将药材粉碎后超声波，可以加速绞股蓝中有效成分的溶出，70～300目的粒径，能保证较短时间内有效成分的较快溶出，粒径越小，溶出度越高，但过滤难度越大。超声波提取相对于浸提或回流提取，提取时间短，提取效率高，加热促进绞股蓝有效成分的溶出。提取溶剂为水溶剂，获取简单，价格低廉，不污染环境。
作为上述方案的优选，所述步骤（1）的超声波功率为20W，热提温度为85℃，提取时间30min。该超声波提取操作下，寡糖的收率最高，基本在1.3%以上。
又进一步细化的，所述步骤（2）的硅藻土抽滤具体步骤为：将2层润湿的定性滤纸置于玻璃砂芯漏斗上，打开水泵，滤纸吸附在漏斗上，加入1～2cm厚的硅藻土，铺匀，再加去离子水润湿后即可加样。使用硅藻土抽滤可以将过滤后溶液中存在的悬浮微小杂质进行筛分及吸附，提高大孔吸附树脂的吸附效率及产物纯度。
再一步细化的，所述步骤（3）的大孔树脂预处理方法为95%乙醇浸泡24h后装柱，用95%乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊，用去离子水洗至无醇味，再用5%HCl通过树脂柱，浸泡2～4h后去离子水洗至中性，再使用2%NaOH通过树脂柱，浸泡2～4h后去离子水洗至中性，即得处理好的大孔树脂。使用前，对大孔树脂进行预处理，除掉内的分散剂、致孔剂、残留杂质等，提高吸附效率。
再进一步细化的，所述步骤（3）的浓缩为旋转蒸发，旋转温度为40～50℃，转速为100～180rpm，浓缩体积为20～50mL，冷冻方法为-80℃冰箱冷冻8～12h，冻干方法为冷冻干燥机中24～72h。使用冻干技术除掉浓缩物中的水分，除水率高，能除掉95～99%的水分，且干燥后的物质疏松多孔，加溶剂后可迅速溶解，不影响化合物本身的性质。相对于蒸干、煮干、真空干燥来说，冷冻干燥不改变化合物的性质，干燥前后化合物体积、性状基本不变，能很好保护易氧化物质，干燥度高，能长期保存。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
实施例1：一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，包括以下3个步骤：
步骤一、绞股蓝活性成分的提取
取中药绞股蓝全草低温干燥，粉碎过筛，粉碎粒径为100目，将20g绞股蓝粉末和800mL去离子水混合均匀，调节超声波温度为85℃，频率为20W，提取30min；提取结束后，静置澄清，过滤，收集滤液；将2层润湿的定性滤纸置于玻璃砂芯漏斗上，打开水泵，让滤纸紧紧地吸附在漏斗上，加入2cm厚的硅藻土，铺匀，再加少量去离子水润湿后，将滤液抽滤；将澄清的滤液转入500mL圆底烧瓶，置于旋转蒸发仪上旋蒸，旋转温度为50℃，转速为180rpm，旋转至溶液体积约40mL。
步骤二、绞股蓝皂苷的分离纯化
使用 95%乙醇浸泡D101型大孔树脂24h后湿法装柱，用95%乙醇洗至流出液与去离子水1：5不浑浊，再用去离子水洗至流出液无醇味，再用5%HCl通过树脂柱，浸泡2h后去离子水洗至中性，再使用2%NaOH通过树脂柱，浸泡2h后去离子水洗至中性；将大孔树脂柱中溶液放出，至溶液离大孔树脂上层约1cm时停止放液，将上述步骤中浓缩液小心转入大孔树脂柱上层，轻轻搅动浓缩液至浓缩液表面平整；用去离子水洗脱，洗脱至流出液呈无色，再用70～90%的乙醇进行梯度洗脱，洗脱至流出液呈无色，收集乙醇洗脱液；洗脱结束后，回收大孔树脂，将收集的乙醇洗脱液旋转蒸发浓缩，旋转温度为40℃，转速为120rpm，浓缩体积为20mL；将浓缩后的溶液放至-80℃冰箱冷冻8h后转入冷冻干燥机中48h，得到绞股蓝总皂苷，收率为3.89%。移入4℃样品柜中保存。
步骤三、绞股蓝皂苷侧链寡糖的提取纯化
取1g绞股蓝总皂苷样品于500mL带盖反应瓶中，加入100mL去离子水，加入15mL三氯乙酸混合均匀后，向反应瓶中通入氮气1min，通气结束后立刻盖紧瓶盖，放入已升温的干燥箱中水解，干燥箱温度为120℃，水解时间12h。水解结束后取出反应瓶，冰浴迅速降温；然后加入氨水溶液调节水解液pH值至7.0，取活化后的薄层色谱板，用毛细管吸取水解液，在板上点样，重复点样3次，用展开剂展开点样后干燥的色谱板，展开剂为正丁醇：乙酸乙酯：水=4:1:5的上层溶液，展开结束后用硫酸：甲醇=1:1的显色剂显色，观察斑点的数量及位置，判断绞股蓝总皂苷上侧链寡糖的水解；将水解成功的水解液进行旋转蒸发浓缩，旋转温度为50℃，转速为180rpm，浓缩体积约为40mL，将浓缩液通过预处理好的大孔树脂进行洗脱，洗脱液为去离子水，至洗脱液无糖分出现为止；洗脱结束后回收大孔树脂，大孔树脂的处理回收方法同步骤（2）；收集水洗脱液，旋转蒸发浓缩，旋转温度为50℃，转速为180rpm，浓缩体积约为20mL；将浓缩液放至-80℃冰箱冷冻12h后转入冷冻干燥机中72h，得到绞股蓝总皂苷侧链寡糖，移入4℃样品柜中保存。
绞股蓝总皂苷侧链寡糖的收率为1.48%。
实验对照
实施例2：一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法
步骤一、绞股蓝活性成分的提取
取中药绞股蓝全草低温干燥，粉碎过筛，粉碎粒径为50目，将20g绞股蓝粉末和800mL去离子水混合均匀，调节超声波温度为80℃，频率为25W，提取45min；提取结束后，静置澄清，过滤，收集滤液；将澄清的滤液转入500mL圆底烧瓶，置于旋转蒸发仪上旋蒸，旋转温度为50℃，转速为180rpm，旋转至溶液体积约40mL。
步骤二、绞股蓝皂苷的分离纯化
将上述步骤中浓缩液小心转入预处理过的大孔树脂柱上层（大孔树脂预处理方法同实施例1），轻轻搅动浓缩液至浓缩液表面平整。用去离子水洗脱，洗脱至流出液呈无色，再用70～90%的乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱液；洗脱结束后，回收大孔树脂，将收集的乙醇洗脱液旋转蒸发浓缩，旋转温度为40℃，转速为100rpm，浓缩体积为20mL；将浓缩后的溶液放至-80℃冰箱冷冻10h后转入冷冻干燥机中72h，得到绞股蓝总皂苷，收率为3.06%。移入4℃样品柜中保存。
步骤三、绞股蓝皂苷侧链寡糖的提取纯化
取1g绞股蓝总皂苷样品于500mL带盖反应瓶中，加入100mL去离子水，加入15mL三氯乙酸混合均匀后，放入已升温的干燥箱中水解，干燥箱温度为110℃，水解时间18h；水解结束后取出反应瓶，冰浴迅速降温，然后加入氨水溶液调节水解液pH值至7.0；用薄层色谱法鉴定寡糖，方法同实施例1。将水解成功的水解液进行旋转蒸发浓缩，旋转温度为45℃，转速为120rpm，浓缩体积约为40mL，将浓缩液通过预处理好的大孔树脂进行洗脱，洗脱液为去离子水，至洗脱液无糖分出现为止；洗脱结束后回收大孔树脂，收集水洗脱液，旋转蒸发浓缩，旋转温度为50℃，转速为120rpm，浓缩体积约为30mL；将浓缩液放至-80℃冰箱冷冻18h后转入冷冻干燥机中48h，得到绞股蓝总皂苷侧链寡糖，移入4℃样品柜中保存。
寡糖收率为1.05%。
实施例3：一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法
步骤一、绞股蓝活性成分的提取
取中药绞股蓝全草低温干燥，粉碎过筛，粉碎粒径为50目，将20g绞股蓝粉末和400mL75%乙醇混合均匀，调节超声波温度为50℃，频率为25W，提取15min；提取结束后，静置澄清，过滤，收集滤液；将澄清的滤液转入500mL圆底烧瓶，置于旋转蒸发仪上旋蒸，旋转温度为40℃，转速为120rpm，旋转至溶液体积约20mL。
步骤二、绞股蓝皂苷的分离纯化
将上述步骤中浓缩液小心转入预处理过的大孔树脂柱上层（大孔树脂预处理方法同实施例1），轻轻搅动浓缩液至浓缩液表面平整。用去离子水洗脱，洗脱至流出液呈无色，再用70～90%的乙醇进行梯度洗脱，洗脱至流出液呈无色，收集乙醇洗脱液；洗脱结束后，回收大孔树脂，将收集的乙醇洗脱液旋转蒸发浓缩，旋转温度为40℃，转速为120rpm，浓缩体积为20mL；将浓缩后的溶液放至-80℃冰箱冷冻12h后转入冷冻干燥机中48h，得到绞股蓝总皂苷，收率为4.91%，移入4℃样品柜中保存。
步骤三、绞股蓝皂苷侧链寡糖的提取纯化
取1g绞股蓝总皂苷样品于500mL带盖反应瓶中，加入100mL去离子水，加入15mL三氯乙酸混合均匀后，放入已升温的干燥箱中水解，干燥箱温度为125℃，水解时间24h；水解结束后取出反应瓶，冰浴迅速降温，然后加入氨水溶液调节水解液pH值至7.0；用薄层色谱法鉴定寡糖，方法同实施例1。将水解成功的水解液进行旋转蒸发浓缩，旋转温度为40℃，转速为120rpm，浓缩体积约为30mL，将浓缩液通过预处理好的大孔树脂进行洗脱，洗脱液为去离子水，至洗脱液无糖分出现为止。洗脱结束后回收大孔树脂，收集水洗脱液，旋转蒸发浓缩，旋转温度为50℃，转速为120rpm，浓缩体积约为20mL；将浓缩液放至-80℃冰箱冷冻24h后转入冷冻干燥机中48h，得到绞股蓝总皂苷侧链寡糖，移入4℃样品柜中保存。
寡糖收率为1.25%。
实施例1~3对比如下表
综合上述分析，在实施例1的操作条件下，寡糖的收率最高。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (5)
1.一种绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将绞股蓝低温干燥后粉碎成粉末，过筛形成绞股蓝粉末，将绞股蓝粉末和去离子水按重量比1：40～60的比例混合后超声波加热进行提取，其中，超声波功率为20W，热提温度为85℃，提取时间30min，提取结束后，澄清，过滤得到滤液；
（2）在步骤（1）的滤液中放入硅藻土进行抽滤，得到澄清的溶液，将溶液浓缩后得浓缩液；
（3）将步骤（2）中浓缩液通过预处理好的大孔树脂进行吸附，用水洗脱至无色，再使用70～90%的乙醇洗脱，得到乙醇洗脱液；
（4）将步骤（3）中乙醇洗脱液浓缩，然后冷冻得绞股蓝总皂苷样品；
（5）取步骤（4）中绞股蓝总皂苷样品于反应瓶中，用去离子水配制成含绞股蓝总皂苷1%的溶液，然后在溶液中加入三氯乙酸，随后通入氮气，密封后放入干燥箱中加热水解，水解温度为120℃，水解时间12h，水解结束后取出，迅速冰浴降温，然后在降温后的水解液中加入氨水调节pH值至6.5～8；
（6）取步骤（5）中水解液，浓缩后使用预处理好的大孔树脂吸附，用水洗脱至无糖分出现，收集水洗脱液，将其浓缩、冷冻后得到绞股蓝总皂苷侧链寡糖。
2.根据权利要求1所述的绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的干燥温度为35～45℃，粉碎粒径为50～300目，提取溶剂为去离子水。
3.根据权利要求1所述的绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的硅藻土抽滤具体步骤为：将2层润湿的定性滤纸置于玻璃砂芯漏斗上，打开水泵，滤纸吸附在漏斗上，加入1～2cm厚的硅藻土，铺匀，再加去离子水润湿后即可加样。
4.根据权利要求1所述的绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）的大孔树脂预处理方法为95%乙醇浸泡24h后装柱，用95%乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊，用去离子水洗至无醇味，再用5%HCl通过树脂柱，浸泡2～4h后去离子水洗至中性，再使用2%NaOH通过树脂柱，浸泡2～4h后去离子水洗至中性，即得处理好的大孔树脂。
5.根据权利要求1所述的绞股蓝皂苷侧链寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)浓缩为旋转蒸发，旋转温度为40～50℃，转速为100～180rpm，浓缩体积为20～50mL，冷冻方法为-80℃冰箱冷冻8～12h，冻干方法为冷冻干燥机中24～72h。
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| PB01 | Publication | ||
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 563000 Dalian Road, Guizhou, China, No. 201, No. Applicant after: ZUNYI MEDICAL University Address before: 563000 No. 201 Dalian Road, Huichuan District, Zunyi City, Guizhou Province Applicant before: ZUNYI MEDICAL University |
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| GR01 | Patent grant | ||
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