CN103884811B - 一种生物色谱比较筛选系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，本发明提供了一种生物色谱比较筛选系统，是一种在线的柱切换全二维色谱系统，由三个高效液相色谱溶剂输送泵，一个六位柱切换阀，一个二位十通阀，两个定量环，数根生物色谱柱，一根整体柱串联质谱分析器构成，用于平行比较小分子在正常、病理组织或细胞来源的生物色谱上的亲和力，从而筛选复杂样品中的疾病靶向性活性组分。本发明还进一步提供了利用上述筛选系统的生物色谱比较筛选方法。本发明的筛选系统和方法适用于在复杂体系样品中疾病靶向活性组分的自动高通量筛选，通过分析正常和病理模型上的差异大大增加筛选结果的专属性，同时本发明的筛选方法具有自动化、操作简单、普适性好、灵活性强、耗时短，可满足各类生物色谱的灵敏度需求，显著提高筛选通量和可信度。

Description

一种生物色谱比较筛选系统及其应用

技术领域

本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，具体涉及一种生物色谱比较筛选系统、筛选方法及其应用。

背景技术

生物色谱技术（BiologicalChromatography）连接先进的检测器，具有高通量和高选择性的优势，广泛用于复杂样品(MoaddelR.,RosenbergA.,SpelmanK.,FrazierJ.,FrazierC.,NocerinoS.,BrizziA.,MugnainiC.andWainerI.W.,Developmentandcharacterizationofimmobilizedcannabinoidreceptor(CB1/CB2)opentubularcolumnforon-linescreening,Anal.Biochem.,2011,412,85-91)中活性小分子的筛选和小分子与特定受体间相互作用的研究(HabichtK.L.,FrazierC.,SinghN.,ShimmoR.,WainerI.W.andMoaddelR.,Thesynthesisandcharacterizationofanuclearmembraneaffinitychromatographycolumnforthestudyofhumanbreastcancerresistantprotein(BCRP)usingnuclearmembranesobtainedfromtheLN-229cells,J.Pharm.Biomed.Anal.,2013,72,159-162)。为了有效地表征和确证对于生物色谱固定相有亲和作用的活性成分，国内外研究者建立了几种在线或离线的二维液相色谱的方法，用于复杂体系药物的活性组分的快速筛选(WangS.,SunM.,ZhangY.,DuH.andHeL.,AnewA431/cellmembranechromatographyandonlinehighperformanceliquidchromatography/massspectrometrymethodforscreeningepidermalgrowthfactorreceptorantagonistsfromRadixsophoraeflavescentis,J.Chromatogr.A,2010,1217,5246-5252,WangL.,RenJ.,SunM.andWangS.,AcombinedcellmembranechromatographyandonlineHPLC/MSmethodforscreeningcompoundsfromRadixCaulophylliactingonthehumanalpha(1A)-adrenoceptor,J.Pharm.Biomed.Anal.,2010,51,1032-1036)。从正常组织或传代细胞系中得到的细胞膜或蛋白片段已经成功用于生物色谱的筛选(SunM.,RenJ.,DuH.,ZhangY.,ZhangJ.,WangS.andHeL.,AcombinedA431cellmembranechromatographyandonlinehighperformanceliquidchromatography/massspectrometrymethodforscreeningcompoundsfromtotalalkaloidofRadixCaulophylliactingonthehumanEGFR,J.Chromatogr.B,2010,878,2712-2718,WangC.,HeL.,WangN.andLiuF.,Screeninganti-inflammatorycomponentsfromChinesetraditionalmedicinesusingaperitonealmacrophage/cellmembranechromatography-offline-GC/MSmethod,J.Chromatogr.B,2009,877,3019-3024)。然而，这些生物色谱模型的缺点在于它并不能完全模拟器官的损伤或病理状态，可能出现一些非疾病专属性或非特异性的相互作用，因而耗费了大量的时间用于分离、纯化和药效学的确证。

因此，利用能最大化地模拟真实的病理状态的病理性生物色谱模型，并与正常生物色谱模型在相同色谱条件下平行比较，可大大提升生物色谱筛选的通量和专属性。因此，发展一种能在线高通量平行分析复杂样品中的活性组分在正常和病理生物色谱模型上的亲和力的分析系统具有重要科学意义和应用价值。

随着色谱柱的切换(JoverE.,MatamorosV.andBayonaJ.M.,Characterizationofbenzothiazoles,benzotriazolesandbenzosulfonamidesinaqueousmatrixesbysolid-phaseextractionfollowedbycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatographycoupledtotime-of-flightmassspectrometry,J.Chromatogr.A,2009,1216,4013-4019)、峰对齐(AdcockJ.L.,AdamsM.,MitrevskiB.S.andMarriottP.J.,Peakmodelingapproachtoaccurateassignmentoffirst-dimensionretentiontimesincomprehensivetwo-dimensionalchromatography,Anal.Chem.,2009,81,6797-6804)、二维数据解析技术(PierceK.M.,KehimkarB.,MarneyL.C.,HoggardJ.C.andSynovecR.E.,Reviewofchemometricanalysistechniquesforcomprehensivetwodimensionalseparationsdata,J.Chromatogr.A,2012,1255,3-11)的不断发展，全二维液相色谱技术应用越来越广泛，利用两根具有良好正交性色谱作为第一维和第二维，并串联先进质量分析检测器，具有强大的分离分析能力。

然而，目前尚没有研究将生物色谱比较分析的理念融入全二维色谱中，也缺乏相应的全二维色谱比较分析策略和技术。

发明内容

本发明目的是提供一种生物色谱比较筛选系统，该系统适用于不同种类生物色谱柱的平行比较分析，从而实现在复杂体系样品中自动高通量筛选疾病靶向活性组分的目的，显著减少疾病不相关或非特异性的组分的影响，降低后期提取、分离、药效确证的工作量。

本发明的另一目的是提供一种利用上述筛选系统的生物色谱比较筛选方法。

本发明的第三目的是提供上述的生物色谱比较筛选系统及其方法在复杂体系样品疾病靶向组分筛选中的应用。

本发明的第一方面，是提供了一种生物色谱比较筛选系统，该筛选系统包括三个高压液相溶剂输送泵，一个自动进样器，一个恒温控制单元，一个六位柱切换阀，一个二位十通阀，两个定量环，2至6根生物色谱柱，一根整体色谱分析柱，一台质谱分析器构成；所述的三个高效液相色谱溶剂输送泵是指第一维高压液相溶剂输送泵一、还有第二维高压液相梯度泵二和泵三；泵一与自动进样器和六位柱切换阀依次连接，2至6根生物色谱柱可依次连接在六位柱切换阀上的接口上，置于37℃恒温控制单元中，六位柱切换阀出口连接二位十通阀①位，定量环1连通②位与⑤位，定量环2连通⑦位与⑩位，③位与⑧位直接连通，⑥位为废液出口，⑨位接高压液相梯度泵二和泵三，④位接整体色谱分析柱，分流后串联一台质谱分析器。

所述的2至6根生物色谱柱中，第一维中的色谱分析柱可以是将细胞膜、蛋白、酶、DNA等各类生物分子作为色谱固定相的生物色谱柱，优选2根正常和病理状态下制备的生物色谱柱用于比较分析；第二维中的色谱分析柱可以是所有类型的大流速整体色谱柱；

所述的质谱分析器可以是各种类型的质谱检测器。

本发明的第二方面，是提供了一种利用上述生物色谱比较筛选系统的筛选方法，该筛选方法的具体操作流程如下：

A、如图1a所示，第一维中的馏分（生物色谱柱1）经泵一(优选生物和质谱均兼容的流动相，如醋酸铵等)输送并储存在定量环1中，同时梯度泵二、泵三平衡定量环2和整体色谱分析柱。

B、如图1b所示，每隔2.5分钟，二位十通阀切换位置，梯度泵二、三将定量环1中富集的组分导入第二维中进一步分离分析，切换12次，共收集了12组流分，第一维共30min全部导入第二维整体色谱柱中分析，通过质谱分析器采集数据，所述的运行参数可以根据实际分析情况调整。

C、如图1c所示，当第一维中生物色谱柱1的最后一部分进入第二维整体色谱分析柱分析时，位置切换阀切至生物色谱柱2，完成平衡步骤，可开始下一个样品的分离分析。

D、采用质谱自带软件对质谱采集的数据进行分析，将原始数据导出，再导入到MATLAB7.10.0中，进行基线校正和峰对齐，然后绘制2Dcontour图谱或3D谱，对结果进行比较分析，从而筛选靶向性活性组分。

较佳地，为了实现两相的同步性，利用VisualBasic6.0自行编写了的软件控制本系统的相关参数，也可用EXCEL直接编写相关参数。

本发明的第三方面，是提供上述的生物色谱比较筛选系统及其方法在复杂体系样品疾病靶向活性组分筛选中的应用。

本发明的生物色谱比较筛选系统及其方法，适用于在复杂体系样品中疾病靶向活性组分的自动高通量筛选，所述复杂体系样品为生物样品、环境样品、天然产物提取液或体液等，活性组分是指样品中分子量小于1000的，与生物色谱固定相存在相互作用的非挥发性小分子物质。

本发明具有以下有益效果：

本发明系统非常适用于各种类型的生物色谱分析，针对生物色谱低分离效率的特性，采用大容量的定量环，以及高流速的快速分离整体色谱分析柱，可以实现大体积流分富集和分析一体化，从而大大缩短了分析时间，在一小时内可完成一组比较分析；

灵活性好，可根据具体分析对象的特点和要求调整多个实验参数，从而达到针对特定样品优化分离的结果；

可同时装载多根生物色谱柱，进行平行比较分析，从而大大减少了系统条件误差对于实验结果的影响；

通过可视化比较活性组分在正常、病理组织、细胞来源的生物色谱上的色谱行为，可实现在复杂体系样品中自动高通量筛选疾病靶向活性组分的目的，显著减少疾病不相关或非特异性的组分的影响，大大减轻后期提取、分离、药效确证的工作量。

本发明所采用的所有组件均为商品化模块，可适用于几乎所有生物色谱体系，为复杂体系样品中活性组分的高通量筛选提供可靠方法，也为生物色谱技术的更广泛应用提供技术手段。

附图说明

图1a：本发明系统的结构和操作流程图之一；

图1b：本发明系统的结构和操作流程图之二；

图1c：本发明系统的结构和操作流程图之三。

图2：全二维分析后得到的典型混合标准三维图；

其中A为正常心肌细胞膜色谱柱；B为病理心肌细胞膜。

图3：全二维细胞膜色谱系统分析附子提取物后得到的典型三维图谱；

其中A为使用正常心肌细胞膜色谱柱；B为使用病理心肌细胞膜。

图4：16个潜在活性组分在正常心肌细胞膜色谱柱(n=3)和心力衰竭细胞膜色谱柱(n=3)上的保留时间对比。

图5：在多柔比星诱导损伤的H9c2细胞上观察塔拉乌头胺（TALA）的心肌保护效应；

其中A为用不同浓度TALA和苯甲酰乌头碱(benzolyaconitine)处理细胞2h，加或不加多柔比星（DOX）孵育24h，采用CCK8法测定细胞活力，分别与正常组（CTL）比较；B为H9c2用不同浓度TALA处理2h，并与2μMDOX孵育24h，用大鼠乳酸脱氢酶ELISA试剂盒测定胞外乳酸脱氢酶的含量。

图6：中药黄柏或苦参的全二维图谱；

其中A为中药黄柏的全二维图谱，化合物3,4分别鉴别为四氢巴马汀（THP）和小檗碱(BBR)；B为中药苦参的全二维图谱，化合物1,2分别鉴别为苦参碱（MAT）和氧化苦参碱(OMT);

图7：CCK-8法测定吉非替尼（GFT）,小檗碱（BBR）,四氢巴马汀（THP）,苦参碱（MAT）和氧化苦参碱（OMT）对肝癌细胞的增殖抑制活性。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：心肌细胞膜色谱比较分析系统筛选附子中抗心衰活性成分

一、实验材料和仪器设备：

材料：多柔比星、四环素、地塞米松、羟甲唑林、坦索洛锌、苯甲酰乌头碱购自中国食品药品检定研究院（中国北京），纯度均超过98%。我们从附子根部提取分离纯化后得到25mg的塔拉乌头胺，其结构由核磁共振氢谱、质谱进行确证，经高效液相紫外检测证实其纯度超过98%。附子（中国四川）购自上海雷允上医药公司（中国上海）。大鼠心肌细胞H9c2购自美国模式细胞培养保藏所（美国马里兰州洛克威尔）。高效液相级的乙腈购自默克有限公司（德国达姆施塔特）。质谱级的醋酸氨购自西格玛有限公司（美国圣路易斯）。超纯水由Milli-Q水净化系统制备得到。其余试剂纯度均达到分析级。

仪器设备：三个高压液相溶剂输送泵，一个自动进样器，一个恒温控制单元属于Agilent1200液相色谱系统，一个六位柱切换阀，型号G1159A，购自Agilent公司，一个二位十通阀，型号MXP9960-000，购自Rheodyne公司，两个定量环500μL，一根整体色谱分析柱(RP-18e，100mm×4.6mm，购自Merck公司)，一台质谱分析器（Agilent6220TOF/MS）；

二、实验步骤：

样品制备和标准溶液配制：200g附子原药材在2.4L水中浸泡1h，煮沸2h。煎出液经四层纱布过滤。药渣用2L水煮沸1h，使用相同的方法过滤。将两次煎出液合并后，于减压下使用旋转蒸发器浓缩。附子煎出液的浓度为1.0g/mL。（相当于原药材）运用细胞膜色谱分析，向浓缩液中加入四倍体积的乙醇来沉淀多糖和蛋白质，过夜后，取上清过滤后浓缩至相当于原药材0.3g/mL。（主要组分的含量超过50μM）。用70%乙醇制备羟甲唑林、硝苯吡啶和地塞米松（每种含量0.5mM）的混合标准溶液。使用之前，立即用双蒸水制备5mM多柔比星氢氯化物溶液。将塔拉乌头胺溶解在0.15%盐酸中（v/v）制备10mM的储备液。

正常心肌/细胞膜色谱和心力衰竭心肌/细胞膜色谱模型制备：立即获取正常大鼠或阿霉素诱导后的心脏，除左心室外将心脏心房完全去除。将心肌组织浸入预冷的盐水中以洗出血液。在10ml预冷的生理盐水中将其切碎，约200mg组织放入玻璃匀浆器进行均质化。随后，离心，3000rpm10分钟，将10ml磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH值为7.4，10mM）加至沉淀中，得到细胞悬浮液，将其进行超声波细胞破碎（芝生物科技有限公司，宁波，中国），条件为400瓦，2秒，间隔20秒，5次。将所得悬浮液涡旋，并离心1000g10分钟。4℃下，弃去沉淀，将上清液离心12000g20分钟，获得心肌细胞膜，将其悬浮于5mL生理盐水中。4℃下，在真空搅拌条件下使细胞膜悬浮液与硅胶吸附（0.04克，预先120℃下干燥2小时），得到细胞膜固定相（CMSP）。静置过夜后，用10mlPBS洗涤CMSP，3次，湿法装柱。

比较心肌细胞膜色谱分析：如图1a所示，第一维中的馏分经泵一输送并储存在定量环1中，同时梯度泵二、三平衡定量环2和整体色谱分析柱。如图1b所示，每隔2.5分钟，二位十通阀切换位置，梯度泵二、三将定量环1中富集的组分导入第二维中进一步分离分析，切换12次，共收集了12组流分，第一维共30min全部导入第二维整体色谱柱中分析，通过质谱分析器采集数据。如图1c所示，当第一维中生物色谱柱1的最后一部分进入第二维整体色谱分析柱分析时，位置切换阀切至生物色谱柱2，完成平衡步骤，可开始下一个样品的分离分析。采用质谱自带软件对质谱采集的数据进行分析，将原始数据导出，再导入到MATLAB7.10.0中，进行基线校正和峰对齐，然后绘制2Dcontour图谱或3D谱，对结果进行比较分析，从而筛选靶向性活性组分。

三、实验结果和讨论：

我们利用本发明所述的生物色谱比较分析系统，将正常心肌细胞膜和多柔比星诱导的心力衰竭的细胞膜色谱进行比较分析，用于筛选附子和附子为君药的复方四逆汤中与治疗心力衰竭相关的成分。首先采用两种不同的阳性药和阴性药对模型的专属性和稳定性进行考察，如图2所示，整体柱/飞行时间质谱系统,我们可以看到在正常心肌细胞膜色谱上，钙通道的拮抗剂硝苯地平有明显的亲和活性，但在衰竭心肌细胞膜色谱上活性显著下降，这与钙离子通道在衰竭心肌中表达密度降低密切相关。而α1受体拮抗剂羟甲唑啉却在两种细胞膜色谱模型上呈现出相同的保留活性，这和α1受体在心衰组织中表达量升高有密切关系。阴性药地塞米松在两种模型上都没有亲和活性。通过阴性药和阳性药的在心肌细胞膜色谱上的行为考察，该系统的稳定性和选择性得到了验证。

如图3所示，附子中的组分在正常、衰竭心肌细胞膜色谱模型上的保留行为的差异，发现附子中有16个组分在两个模型上均有亲和活性，但大部分组分在衰竭心肌细胞膜色谱模型上都呈现出保留行为下降的趋势。通过进一步对容量因子的比较分析，只有4个组分在衰竭心肌细胞膜色谱上依然具有很强的亲和力，如图4所示，分别是塔拉乌头胺(Talatizamine,TALA)，14-乙酰塔拉乌头胺（14-acetyltalatizamine），14-苯甲酰尼奥林(14-benzoylneoline)以及海瑟定(Hetisine)。

选取亲和力最强的活性组分塔拉乌头胺（TALA）进行后续的细胞活力分析，如图5所示，采用多柔比星（DOX）诱导的H9c2心肌细胞衰竭模型，我们发现TALA具有保护H9c2细胞阿霉素损伤的效果，能降低上清中LDH的分泌量，呈剂量依赖性，并且没有细胞毒性，而活性较低的苯甲酰乌头碱没有保护作用，可见细胞膜色谱的筛选结果与药效呈正相关性。

本实施例充分证明了该系统能有效筛选中药复杂体系中的结构相似物质，并能对特定疾病专属性的组分进行有效的筛选，特别适用于组分结构性质相似的复杂体系样品，可大大减轻后期对于潜在活性组分提取、分离、药效确证的工作量。

实施例2：肝癌细胞膜比较筛选系统的构建及其在中药抗肿瘤活性成分筛选中的应用

一、实验材料和仪器设备：

试剂吉非替尼、埃罗替尼购买自南京安格医药化工有限公司（中国南京市）；多巴酚丁胺、硝苯地平、去甲肾上腺素、小檗碱、四氢巴马汀、苦参碱和氧化苦参碱购买自中国药品生物制品检定所（中国北京市），标准品纯度均大于99.9%；中药材购买自上海雷允上药业有限公司（中国上海市），DMEM高糖培养基购买自HyClone公司（美国）；胎牛血清（FBS）、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素/链霉素双抗溶液、胰酶购买自Gibco公司（美国）；磷酸盐缓冲溶液（10mM，pH7.4）购买自上海蔚宏生物科技有限公司（中国上海市）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒购买自碧云天生物技术研究所（中国海门市）；大孔硅胶（5μm，）、空色谱柱（10mm×2.1mmI.D.）购买自大连日普利科技仪器有限公司（中国大连市）；色谱纯乙腈购买自MerckChemicals（德国）；色谱纯甲酸购买自Tedia（美国）；质谱纯醋酸铵购买自Sigma-Aldrich（美国）；氯化钠、氯化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钾、无水乙醇等试剂购买自中国医药集团上海化学试剂公司（中国上海市）；蒸馏水购买自屈臣氏集团有限公司（中国香港市）；超纯水由Milli-QAcademic超纯水系统（Millipore，美国）生产。

仪器设备：同实施例1。

二、实验步骤：

药材提取液的制备：干燥的药材经粉碎后，过40目筛。取3g药材粉末，加入30mL30%乙醇，采用CW-2000型超声-微波协同萃取仪（上海新拓分析仪器科技有限公司，中国上海市）进行提取。参数设置如下：微波功率为800W、超声波功率为200W、提取温度为80℃、提取时间为10min。提取液经过12000×g离心10min后取上清，经过0.22μm微孔滤膜过滤，置于4℃备用。进行细胞膜色谱实验之前，取药材提取液1mL加入5mM醋酸铵溶液，稀释至10mL。

细胞培养：人肝癌细胞（HepG2）或正常肝细胞来自第二军医大学药学院生化药学教研室（中国上海市）冻存，也可购自中科院细胞所。HepG2细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中。细胞增殖至指数生长期时进行传代或相关实验。

正常、肝癌细胞膜色谱模型的建立：取约1×10⁷个贴壁生长的HepG2或肝细胞，弃去完全培养基，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，加入10mL磷酸盐缓冲溶液，用细胞刮刀轻轻的将细胞刮下。采用JY92-IIN超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，中国宁波市）破碎细胞，参数设置如下：超声波功率为400W、工作时间为2s、间隔时间为20s、工作次数为3次。混匀后1000×g离心10min后取上清，12000×g离心20min后取沉淀，加入10mL磷酸盐缓冲溶液，混匀后再次12000×g离心20min后取沉淀，加入5mL生理盐水重新混悬沉淀，即得细胞膜混悬液，以上操作均在4℃下进行。取0.05g大孔硅胶，在120℃下活化30min，在涡旋和抽真空条件下，将细胞膜混悬液加入到大孔硅胶中，搅拌30min后静置过夜，即得细胞膜色谱固定相，以上操作均在4℃下进行。将细胞膜色谱固定相混悬液500×g离心5min后取沉淀，加入5mL磷酸盐缓冲溶液重新混悬，如此反复洗涤沉淀3次。采用湿法装柱将细胞膜色谱固定相装入空色谱柱中，即得HepG2细胞膜色谱柱，置于4℃备用。

比较心肌细胞膜色谱分析：方法同实施例1。

三、实验结果和讨论：

在HepG2细胞膜上高表达表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR），因此本发明采用HepG2细胞膜色谱来筛选中药中的抗肿瘤活性成分。将上述黄柏和苦参两种药材提取液进行细胞膜色谱-高效液相色谱-飞行时间质谱全二维系统分析，导出每一个样品的信号点数据，采用MATLAB自编程序，绘制每个药材的细胞膜色谱-高相液相色谱全二维色谱图。从全二维色谱图上可以看出，黄柏和苦参有明显保留成分，而其他药材无明显保留成分。黄柏和苦参2种药材的筛选结果，如图6所示，虽然这些保留成分在第一维细胞膜色谱上无法有效分离，但是由于第二维色谱的作用，使得各个成分的保留行为都能够在全二维色谱图上得到准确的表征。我们对保留成分进行了鉴定。黄柏中的保留成分为小檗碱（BBR）和四氢巴马汀（THP），苦参中的保留成分为苦参碱（MAT）和氧化苦参碱（OMT），并分别采用标准品进行了确证，这四个组分在正常肝细胞膜色谱上均无活性，但在HepG2肝癌细胞膜色谱上均具有较强的亲和力。

在全二维系统中，第一维的流出样品全部进入第二维进行分析，因此不需要对第一维的化合物进行识别，凭借第二维TOF/MS强大的分析鉴别能力，结合MATLAB的数据处理即可快速准确的对化合物的保留行为进行表征和结构鉴定。在二维色谱系统中第二维的分析时间是重要的限速步骤，由于采用了整体硅胶柱，极大缩短了第二维的分析时间，使得仅需62.5min即可完成全二维比较分析；同时，TOF/MS为化合物提供了精确的质量信息和丰富的碎片信息，使得全二维系统筛选出的成分，无需标准品的确证，也可以得到相对可信的鉴定结果，为高通量筛选提供了可能。

为了验证上述4个成分的抗肿瘤活性作用，采用CCK-8法分别测定了不同浓度的小檗碱、四氢巴马汀、苦参碱和氧化苦参碱对HepG2细胞增殖的抑制作用，以阳性药物吉非替尼为对照，结果如图7所示。吉非替尼（GFT）在25和50μM浓度下、小檗碱（BBR）和四氢巴马汀（THP）在50和250μM浓度下作用48h，均对HepG2细胞增殖有抑制作用，并且呈现浓度依赖关系，与对照组相比，P<0.05。而苦参碱（MAT）和氧化苦参碱（OMT）在10、50和250μM浓度下作用相对较弱。这4个成分的活性作用与其细胞膜色谱筛选的结果具有一致性，说明这些成分是通过与EGFR作用而发挥抑制肿瘤细胞增殖的活性。此外，这些具有抗肿瘤活性的成分可以作为先导化合物，进行结构优化，以获得更为理想的抗肿瘤药物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种生物色谱比较筛选系统，其特征在于，该筛选系统包括：三个高压液相溶剂输送泵、一个自动进样器、一个恒温控制单元、一个六位柱切换阀、一个二位十通阀、两个定量环、第一维的2至6根生物色谱柱、第二维的一根整体色谱分析柱和一台质谱分析器；所述的三个高压液相溶剂输送泵是指第一维高压液相溶剂输送泵一、还有第二维高压液相梯度泵二和泵三；所述的泵一与自动进样器和六位柱切换阀依次连接，2至6根生物色谱柱依次连接在六位柱切换阀上的接口上，置于37℃恒温控制单元中，六位柱切换阀出口连接二位十通阀①位，定量环1连通十通阀②位与⑤位，定量环2连通十通阀⑦位与⑩位，十通阀③位与⑧位直接连通，十通阀⑥位为废液出口，十通阀⑨位接高压液相梯度泵二和泵三，十通阀④位接整体色谱分析柱，分流后串联一台质谱分析器；

第一维的2至6根生物色谱柱是将各类生物分子作为色谱固定相的生物色谱柱，其中2根分别是正常和病理状态下制备的生物色谱柱；第二维中的一根整体色谱分析柱是大流速整体色谱柱。

2.一种生物色谱比较筛选方法，其特征在于，该筛选方法利用如权利要求1所述的生物色谱比较筛选系统，该筛选方法的具体操作流程为：

A、第一维中的馏分经第一维高压液相溶剂输送泵一输送并储存在定量环1中，同时高压液相梯度泵二、泵三平衡定量环2和整体色谱分析柱；

B、每隔2.5分钟，二位十通阀切换位置，高压液相梯度泵二、泵三将定量环1中富集的组分导入第二维中进一步分离分析，切换12次，共收集了12组流分，第一维共30分钟全部导入第二维整体色谱柱中分析，通过质谱分析器采集数据；

C、当第一维中生物色谱柱1的最后一部分进入第二维整体色谱分析柱分析时，六位柱切换阀切至生物色谱柱2，完成平衡步骤，可开始下一个样品的分离分析；

D、采用质谱分析器自带软件对质谱采集的数据进行分析，将原始数据导出，再导入到MATLAB7.10.0中，进行基线校正和峰对齐，然后绘制2D等高线图谱或3D谱，对结果进行比较分析，从而筛选靶向性活性组分。

3.根据权利要求2所述的一种生物色谱比较筛选方法，其特征在于，该筛选方法的B和C中，为了实现两相的同步性，利用VisualBasic6.0编写的软件控制筛选系统的相关参数，或用EXCEL直接编写相关参数。

4.一种如权利要求1所述的生物色谱比较筛选系统在复杂体系样品疾病靶向活性组分筛选中的应用。

5.根据权利要求4所述的生物色谱比较筛选系统在复杂体系样品疾病靶向活性组分筛选中的应用，其特征在于，所述复杂体系样品为生物样品、环境样品，或天然产物提取液；所述的活性组分是指样品中分子量小于1000的，与生物色谱固定相存在相互作用的非挥发性小分子物质。

6.一种如权利要求2或3所述的生物色谱比较筛选方法在复杂体系样品疾病靶向活性组分筛选中的应用。

7.根据权利要求6所述的生物色谱比较筛选方法在复杂体系样品疾病靶向活性组分筛选中的应用，其特征在于，所述复杂体系样品为生物样品、环境样品，或天然产物提取液；所述的活性组分是指样品中分子量小于1000的，与生物色谱固定相存在相互作用的非挥发性小分子物质。