CN115236222B - 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法，其提取方法，能够快速、准确地提取化妆品中人表皮生长因子。本发明方法采用高效液相色谱‑质谱法测定化妆品中人表皮生长因子，不仅可以对化妆品中的人表皮生长因子进行定性测定，同时还可以进行定量分析，方法简便、易操作，通用性强，重现性好，更适合实验室之间的方法的普及和应用。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品检测分析技术领域，尤其涉及一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法。
背景技术
人表皮生长因子(EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基酸组成的活性多肽；实验研究表明，人表皮生长因子(EGF)具有多种生物活性，能刺激表皮和上皮细胞，促进表皮增生和角质化，能强烈刺激细胞分裂，增强细胞活性，促进新陈代谢。人表皮生长因子(EGF)用于角膜损伤、烫伤和手术等创面的修复和愈合取得很好的疗效。
人表皮生长因子(EGF)曾经在化妆品行业被广泛应用，但因人表皮生长因子(EGF)是单项刺激细胞增生，一味不停地刺激细胞增生可能会导致皮肤细胞出现难以预测的问题，使用过量，或者使用频次过多使皮肤过度吸收后，会有皮肤增生的风险。滥用EGF会导致肌肤生长不可控，形成“肿瘤”样结节增生。人表皮生长因子(EGF)被滥用注射，导致肌肤组织过度生长的报道时常可见。
国家药品监督管理局明确表示：人表皮生长因子(EGF)不得作为化妆品原料使用。在配方中添加或者产品宣称含有人寡肽-1或人表皮生长因子(EGF)的，均属于违法产品。另一方面有一些化妆品厂家为了追求经济利益，却违规在化妆品中添加在医学领域应用的人表皮生长因子(EGF)等人表皮生长因子代替化妆品中允许添加的寡肽-1等生物活性肽，混肴视听，从而引发潜在的安全性问题，给消费者带来了潜在的伤害。《化妆品安全技术规范》(2015年版)无相应检测标准，存在技术空白。目前，文献中报道的关于化妆品中人表皮生长因子的检测方法较少。《中国药典》收载了人表皮生长因子外用溶液的测定方法，该方法为采用凝胶电泳法进行定性，高效液相色谱法的归一化法进行纯度测定。该方法只能对人表皮生长因子进行定性不能定量。且该方法灵敏度低，选择性差，不适用于复杂的化妆品基质。
因此，基于有效性和安全性考虑，建立化妆品中人表皮生长因子的检测方法研究，可为化妆品中非法添加物质的监管提供快速、准确的检测方法和技术支持。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的对人表皮生长因子只能定性不能定量检测的缺陷。提供一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法，包括如下步骤：
步骤一，样品处理
膏霜、乳液、水、凝胶、粉类基质样品：精密称取样品，加入牛血清白蛋白水溶液，旋涡分散均匀，超声提取，采用牛血清白蛋白水溶液定容后离心，得供试品溶液备用；
油基质样品：精密称取样品，加入二氯甲烷，涡旋，加入牛血清白蛋白水溶液，振摇提取，静置分层，离心后取第一上层溶液；第一下层溶液加入牛血清白蛋白水溶液，振摇提取，静置分层，离心后取第二上层溶液与所述第一上层溶液混合，用牛血清白蛋白水溶液定容，得供试品溶液备用；
步骤二，配制基质标准系列溶液
精密称取人表皮生长因子标准品，用水溶解定容，得到标准储备溶液；
精密称取空白样品，采用与步骤一所述样品处理相同的方法，得到空白基质提取液；
准确量取所述标准储备溶液，用所述空白基质提取液稀释，得到基质标准中间溶液；
分别精密量取所述基质标准中间溶液适量，用所述空白基质提取液稀释，配制得到基质标准系列溶液；
步骤三，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪进样检测。
进一步地，所述牛血清白蛋白水溶液中牛血清白蛋白的含量为1w/v％，所述牛血清白蛋白水溶液中还含有0.5w/v％的氯化钠。
进一步地，所述超声提取的时间为20-30min。
进一步地，每克所述油基质样品加入所述二氯甲烷的体积为10-15mL。
进一步地，所述基质标准系列溶液的浓度为50、100、200、250、500、1000μg/L。
进一步地，色谱条件为：
色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm，1.6μm，或等效色谱柱；
流动相：A为0.02v/v％甲酸，B为乙腈；梯度洗脱；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
进一步地，所述梯度洗脱具体为：
进一步地，质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
监测模式：正离子多反应监测模式。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明化妆品中人表皮生长因子的检测方法，其提取方法，能够快速、准确地提取化妆品中人表皮生长因子。
本发明方法采用高效液相色谱-质谱法测定化妆品中人表皮生长因子，不仅可以对化妆品中的人表皮生长因子进行定性测定，同时还可以进行定量分析，方法简便、易操作，通用性强，重现性好，更适合实验室之间的方法的普及和应用。
附图说明
图1为人表皮生长因子标准溶液高效液相色谱-质谱提取离子图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明提供了一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法，具体如下：
1.试剂材料
除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯及以上规格，水为符合GB/T6682规定的一级水。
1.1乙腈，色谱纯。
1.2甲酸，色谱纯。
1.3牛血清白蛋白，色谱纯。
1.4氯化钠，分析纯。
1.5二氯甲烷，分析纯。
1.6 0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液：称取0.1g牛血清白蛋白(1.3)和0.5g氯化钠(1.4)，用水溶解并稀释至100mL，混匀。
1.7 0.02％甲酸溶液：取甲酸(1.2)0.2mL，加水1000mL，混匀，即得。
1.8标准品：人表皮生长因子标准品，纯度均≥98％。标准品的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量、结构式详见表A。
表A
1.9标准储备溶液：称取人表皮生长因子标准品10mg(精确到0.00001g)，置于10mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀。标准储备溶液的质量浓度均为1000mg/L。置于-18℃冰箱中避光保存。
1.10标准溶液：准确量取标准储备溶液(1.9)0.1mL，置10mL棕色容量瓶中，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)定容至刻度，摇匀，制成人表皮生长因子为10mg/L的标准溶液。置于-18℃冰箱中避光保存。
1.11筛查用标准溶液
取标准溶液(1.10)适量，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)进行稀释，配制成人表皮生长因子浓度为20μg/L的筛查用标准溶液。
以上(1.10)和(1.11)作为实验室标准溶液保留。
1.12空白基质提取液
1.12.1膏霜、乳液、水、凝胶、粉类空白基质提取液
称取空白试样0.2g(精确到0.0001g)，置于20mL具塞比色管中，自“准确加入0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液15mL”起与样品同法处理(3.1)，作为空白基质提取液。
1.12.2油类空白基质提取液
称取空白试样0.2g(精确到0.0001g)，置于50mL离心管中，自“准确加入二氯甲烷(1.5)2mL”起与样品同法处理(3.2)，作为空白基质提取液。
1.12.3基质标准中间溶液
准确量取标准储备溶液(1.9)0.1mL，置于10mL棕色容量瓶中，用空白基质提取液(1.12)稀释至刻度，摇匀，制成人表皮生长因子浓度为10mg/L的基质标准中间溶液。
1.12.4基质标准系列溶液
分别精密量取基质标准中间溶液(1.12.3)适量，用空白基质提取液(1.12)配制得50、100、200、250、500、1000μg/L基质标准系列溶液(浓度范围可根据实际情况进行调整)。基质混合标准系列溶液应现用现配。
2.仪器和设备
2.1高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。
2.2分析天平：感量0.0001g和0.00001g。
2.3超声波清洗器。
2.4涡旋混合仪。
2.5高速离心机。
3.样品处理
3.1膏霜、乳液、水、凝胶、粉类基质样品
称取样品0.2g(精确到0.0001g)，置于20mL具塞比色管中，加入0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)15mL，涡旋30s，分散均匀，超声提取20min，放至室温，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)定容至刻度，以10000r/min转速离心5min，作为供试品溶液备用(供试品溶液可根据实际浓度用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)进行适当稀释)。
3.2油基质样品
称取样品0.2g(精确到0.0001g)，置于50mL离心管中，准确加入二氯甲烷(1.5)2mL涡旋30s，加入10mL 0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)，振摇提取，静置分层，以10000r/min转速离心5min，取上层溶液至20mL容量瓶中。下层溶液加入8mL 0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)，振摇提取，静置分层，以10000r/min转速离心5min，取上层溶液至同一20mL容量瓶中，合并两次提取液，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液备用(供试品溶液可根据实际浓度用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)进行适当稀释)。
4.高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪进样检测
4.1色谱条件
色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.6μm)，或等效色谱柱；
流动相：A为含0.02％甲酸(1.7)，B为乙腈(1.1)。梯度洗脱程序见表1；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
表1梯度洗脱程序
4.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
监测模式：正离子多反应监测模式(MRM)，监测离子对及相关参数设定见表2。
表2人表皮生长因子监测离子对及相关参数设定
*为推荐的定量离子。
注：当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。
实施例1
空白样品加标测定：取不含人表皮生长因子的膏霜空白基质样品，对其进行空白加标试验，测定回收率结果。
实施例1中，所使用的主要仪器、材料与试剂包括：
1.仪器与试剂
AB SCIEX 4500三重四极杆质谱联用仪(AB公司)配Waters Acquity高效液相色谱仪(Waters公司)；Sartorius CP224S和225D-1CN电子天平(德国赛多利斯公司)；5800型超声仪(美国Branson公司)；MS3涡旋混合器(德国IKA公司)；5810R型台式离心机(德国Eppendof公司)；Milli-Q Reference A+型超纯水仪(美国Millipore公司)。
人表皮生长因子标准品，(源叶生物有限公司，纯度95％，批号H04S11M122808)；乙腈(色谱纯，德国Merk公司)；甲酸(色谱纯，CNW公司)、牛血清百蛋白(Sigma公司，纯度98％)；氯化钠(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；水均为超纯水。
2.仪器条件
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.6μm)，或等效色谱柱；
流动相：A为含0.02％甲酸(1.7)，B为乙腈(1.1)。梯度洗脱程序见表1；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
2.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
监测模式：正离子多反应监测模式(MRM)，监测离子对及相关参数设定见表2。
3.HPLC-MS系统中线性关系确定
3.1标准储备溶液：称取人表皮生长因子标准品10mg(精确到0.00001g)，置于10mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀。标准储备溶液的质量浓度均为1000mg/L。置于-18℃冰箱中避光保存。
3.2标准溶液：准确量取标准储备溶液0.1mL，置10mL棕色容量瓶中，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液定容至刻度，摇匀，制成人表皮生长因子为10mg/L的标准溶液。置于-18℃冰箱中避光保存。
3.3膏霜空白基质提取液
称取空白试样0.2g(精确到0.0001g)，置于20mL具塞比色管中，自“准确加入0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液15mL”起与样品同法处理，作为空白基质提取液。
3.4膏霜基质标准中间溶液
准确量取标准储备溶液0.1mL，置于10mL棕色容量瓶中，用空白基质提取液稀释至刻度，摇匀，制成人表皮生长因子浓度为10mg/L的基质标准中间溶液。
3.5膏霜基质标准系列溶液
分别精密量取基质标准中间溶液适量，用空白基质提取液配制得50、100、200、250、500、1000μg/L基质标准系列溶液(浓度范围可根据实际情况进行调整)。基质混合标准系列溶液应现用现配。
以峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x，μg/L)，进行线性回归分析，得线性方程如下表3。
表3人表皮生长因子标准曲线方程及相关系数
4.空白样品加标回收率样品处理
称取膏霜空白基质样品0.20g(精确到0.001g)置于20mL具塞比色管中，精密加入一定量的人表皮生长因子，加入0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)15mL，涡旋30s，分散均匀，超声提取20min，放至室温，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)定容至刻度，以10000r/min转速离心5min，作为待测样品溶液。每个加标水平重复6次实验，计算回收率和相对标准偏差(n＝6)。
结果按式(1)计算：
式中：
ω—样品中人表皮生长因子的质量分数，mg/kg；
ρ—供试品溶液中人表皮生长因子的质量浓度，μg/L；
V—样品定容体积，mL；
m—样品取样量，g；
D—稀释倍数(如未稀释则为1)。
在质谱条件下，取标准工作曲线溶液和试样溶液分别进样，从标准曲线上查得试样溶液中人表皮生长因子的含量。试样溶液中人表皮生长因子的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应将提取液稀释后测定或增加提取溶液的量重新检测。
空白基质加标回收率测定结果如表4所示，结果表明回收率测定得到满意结果。
表4膏霜空白基质加标的回收率和精密度试验结果
实施例2
空白样品加标测定：取不含人表皮生长因子的油类空白基质样品，对其进行空白加标试验，测定回收率结果。
实施例2中，所使用的主要仪器、材料与试剂包括：
1.仪器与试剂
AB SCIEX 4500三重四极杆质谱联用仪(AB公司)配Waters Acquity高效液相色谱仪(Waters公司)；Sartorius CP224S和225D-1CN电子天平(德国赛多利斯公司)；5800型超声仪(美国Branson公司)；MS3涡旋混合器(德国IKA公司)；5810R型台式离心机(德国Eppendof公司)；Milli-Q Reference A+型超纯水仪(美国Millipore公司)。
人表皮生长因子标准品，(源叶生物有限公司，纯度95％，批号H04S11M122808)；乙腈(色谱纯，德国Merk公司)；甲酸(色谱纯，CNW公司)、牛血清百蛋白(Sigma公司，纯度98％)；氯化钠(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；水均为超纯水。
2.仪器条件
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.6μm)，或等效色谱柱；
流动相：A为含0.02％甲酸(1.7)，B为乙腈(1.1)。梯度洗脱程序见表1；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
2.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
监测模式：正离子多反应监测模式(MRM)，监测离子对及相关参数设定见表2。
3.HPLC-MS系统中线性关系确定
3.1标准储备溶液：称取人表皮生长因子标准品10mg(精确到0.00001g)，置于10mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀。标准储备溶液的质量浓度均为1000mg/L。置于-18℃冰箱中避光保存。
3.2标准溶液：准确量取标准储备溶液(1.9)0.1mL，置10mL棕色容量瓶中，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)定容至刻度，摇匀，制成人表皮生长因子为10mg/L的标准溶液。置于-18℃冰箱中避光保存。
3.3油空白基质基质提取液
称取空白试样0.2g(精确到0.0001g)，置于50mL具塞比色管中，自“准确加入0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液15mL”起与样品同法处理，作为空白基质提取液。
3.4油基质标准中间溶液
准确量取标准储备溶液(1.9)0.1mL，置于10mL棕色容量瓶中，用空白基质提取液(1.12)稀释至刻度，摇匀，制成人表皮生长因子浓度为10mg/L的基质标准中间溶液。
3.5油基质标准系列溶液
分别精密量取基质标准中间溶液(1.12.3)适量，用空白基质提取液(1.12.1)配制得50、100、200、250、500、1000μg/L基质标准系列溶液(浓度范围可根据实际情况进行调整)。基质混合标准系列溶液应现用现配。
以峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x，μg/L)，进行线性回归分析，得线性方程如下表5。
表5人表皮生长因子油基质标准曲线方程及相关系数
4.油空白基质加标回收率样品处理
称取样品0.2g(精确到0.0001g)，置于50mL离心管中，精密加入一定量的人表皮生长因子，准确加入二氯甲烷(1.5)2mL涡旋30s，加入10mL 0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)，振摇提取，静置分层，以10000r/min转速离心5min，取上层溶液至20mL容量瓶中。下层溶液加入8mL 0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)，振摇提取，静置分层，以10000r/min转速离心5min，取上层溶液至同一20mL容量瓶中，合并两次提取液，用0.1％牛血清白蛋白(含0.5％氯化钠)水溶液(1.6)定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液备用。每个加标水平重复6次实验，计算回收率和相对标准偏差(n＝6)。
结果按式(1)计算：
式中：
ω—样品中人表皮生长因子的质量分数，mg/kg；
ρ—供试品溶液中人表皮生长因子的质量浓度，μg/L；
V—样品定容体积，mL；
m—样品取样量，g；
D—稀释倍数(如未稀释则为1)。
在质谱条件下，取标准工作曲线溶液和试样溶液分别进样，从标准曲线上查得试样溶液中人表皮生长因子的含量。试样溶液中人表皮生长因子的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应将提取液稀释后测定或增加提取溶液的量重新检测。
空白基质加标回收率测定结果如表6所示，结果表明回收率测定得到满意结果。
表6油空白基质加标的回收率和精密度试验结果
综上，本发明化妆品中人表皮生长因子的检测方法操作简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。该方法具有高灵敏度、高质量精确度及可行的线性范围，极大地提高了检测机构对化妆品的监测能力。
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，样品处理；
膏霜、乳液、水、凝胶、粉类基质样品：精密称取样品，加入牛血清白蛋白水溶液，旋涡分散均匀，超声提取，采用牛血清白蛋白水溶液定容后离心，得供试品溶液备用；
油基质样品：精密称取样品，加入二氯甲烷，涡旋，加入牛血清白蛋白水溶液，振摇提取，静置分层，离心后取第一上层溶液；第一下层溶液加入牛血清白蛋白水溶液，振摇提取，静置分层，离心后取第二上层溶液与所述第一上层溶液混合，用牛血清白蛋白水溶液定容，得供试品溶液备用；
步骤二，配制基质标准系列溶液；
精密称取人表皮生长因子标准品，用水溶解定容，得到标准储备溶液；
精密称取空白样品，采用与步骤一所述样品处理相同的方法，得到空白基质提取液；
准确量取所述标准储备溶液，用所述空白基质提取液稀释，得到基质标准中间溶液；
分别精密量取所述基质标准中间溶液适量，用所述空白基质提取液稀释，配制得到基质标准系列溶液；
步骤三，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪进样检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白水溶液中牛血清白蛋白的含量为1w/v％，所述牛血清白蛋白水溶液中还含有0.5w/v％的氯化钠。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声提取的时间为20-30min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，每克所述油基质样品加入所述二氯甲烷的体积为10-15mL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基质标准系列溶液的浓度为50、100、200、250、500、1000μg/L。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，色谱条件为：
色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm，1.6μm；
流动相：A为0.02v/v％甲酸，B为乙腈；梯度洗脱；
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
监测模式：正离子多反应监测模式。
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