CN111484557A - 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 - Google Patents
一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111484557A CN111484557A CN201910074848.1A CN201910074848A CN111484557A CN 111484557 A CN111484557 A CN 111484557A CN 201910074848 A CN201910074848 A CN 201910074848A CN 111484557 A CN111484557 A CN 111484557A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer solution
- growth factor
- serum albumin
- human serum
- epidermal growth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 44
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 44
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 44
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 37
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 30
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 28
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 28
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 23
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 19
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 18
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims description 14
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 9
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 claims description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 5
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 claims description 5
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000010451 perlite Substances 0.000 claims description 3
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 12
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 14
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 13
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 5
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 5
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000007117 Oral Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白的层析方法。具体步骤为1)从重组人血清白蛋白‑表皮生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人血清白蛋白‑表皮生长因子融合的粗提液；2)将含有人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白的粗提液经阳离子交换层析，得到初级产物Ⅰ；3)将初级产物Ⅰ经阴离子交换层析，得到纯化的人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白的目标物。本发明的提取纯化方法可获得纯度大于95％的重组人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白，蛋白活性好，产量高。且本发明的工艺简单，经济高效，适宜工业生产应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法。
背景技术
人表皮细胞生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是一种含53个氨基酸的单链多肽，通过与受体细胞上的受体结合，能够广泛刺激多种细胞如表皮细胞，成纤维细胞，内皮细胞以及平滑肌细胞的增殖，分化和迁移，从而起到加速组织的再生和修复的作用。近年来，hEGF在临床方面应用广泛，如促进皮肤创伤，割伤，烧伤，烫伤以及口腔溃疡，胃溃疡和十二指肠的愈合。在高端化妆品市场，同样存在巨大需求。
目前hEGF制备主要有人源性提取，化学合成和外源表达，能满足工业化生产的大多来自于外源表达，例如重组毕赤酵母分泌表量达到300～900mg/L发酵液(US5102798,CN1210145A)，重组短小芽孢杆菌分泌表达产率能达到1～3g/L的发酵液(SHOGO EBISU,1996)，尽管在目前的技术领域内hEGF的表达量已经提升至g/L发酵液，但前期的发酵和后期纯化的成本仍然很高，规模化有一定的难度。转基因植物表达平台具有安全，廉价，易于扩大等优点，近年来越来越多的重组药物蛋白已经在转基因植物中获得高表达并已达到工业化生产的要求，目前相关报道显示hEGF在西红柿叶片，马铃薯块茎，藻类以及烟草等都得到表达，但表达量普遍较低。
本发明以基因工程水稻表达重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白的技术为依托，进一步研究了从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白的层析方法。为了能在工业上大规模应用基因工程水稻技术进行人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白的生产，本发明旨在研究一种经济、高效且适宜工业放大生产的分离提纯方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白(OsrHSA-EGF)的方法，依次包括以下步骤：
1)从重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合的粗提液；
2)将含有人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白的粗提液经阳离子交换层析，得到初级产物Ⅰ；
3)将初级产物Ⅰ经阴离子交换层析，得到纯化的人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白的目标物。
进一步的，上述方法包括以下步骤：
(1)将基因工程稻谷脱壳成半精米，并研磨成80～100目的米粉，将米粉与提取液以1：5～1：10(kg/L)的比例混合，于25℃～60℃搅拌提取1～2h，提取缓冲液成分为5～20mM磷酸盐、5～20mM醋酸钠、10-30mM硫酸铵、10～20mM辛酸钠，1～5mM还原型谷胱甘肽，pH为7.0～7.5。其中硫酸铵提供一定的盐浓度有助于HSA-EGF融合蛋白的提取，适当浓度的辛酸钠对高温和酸沉的步骤的HSA-EGF融合蛋白有重要的保护作用(参考专利CN102127164A)，还原型谷胱甘肽为本领域所熟知的二硫键还原剂，有助于去除HSA-EGF聚集体。
将上述米粉与提取液的提取混合物用乙酸调节pH为4.5～5.9，搅拌酸沉1～8h，加入2～5％的珍珠岩进行压滤或离心，再经0.22μm的膜过滤后即为OsrHSA-EGF的粗提液；
(2)采用Bestarose Diamond MMC层析介质进行初级分离纯化，采用8～12倍柱体积，pH为4.9～5.1，组分为20～50mM乙酸钠，0～40mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mMEDTA-2Na的平衡缓冲液，以100～170cm/h的线性流速平衡层析柱，以上述步骤(1)中的OsrHSA-EGF的粗提液为上样液，其中上样液pH为4.5～5.5，上样体积为16～25倍柱体积；上样结束后用平衡缓冲液再次平衡8～10倍柱体积；用20～50mM的乙酸钠，10％～15％(V/V)异丙醇，pH4.5～5.5的洗杂缓冲液I，以100～170cm/h的线性流速洗脱杂蛋白，洗杂液体积为4～8倍柱体积，再用20～25倍柱体积的洗杂缓冲液Ⅱ，以100～170cm/h的线性流速洗脱杂蛋白，洗杂缓冲液II的组分为20～50mM乙酸钠，10％～15％(V/V)异丙醇，1.2～1.88MNaCl，pH为4.9～5.5；再以组分为20mM磷酸钠，0.4～0.5mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～2mM EDTA-2Na，pH为6.4～6.5的缓冲液作为洗脱缓冲液进行洗脱目标蛋白，收集含有OsrHSA-EGF融合蛋白的洗脱液即为初级产物Ⅰ；
(3)采用Q Bestarose Fast Flow层析介质进行第二步的分离纯化，使用pH为6.4～6.6的含有20～50mM磷酸钠，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～2mM EDTA-2Na的缓冲液作为平衡缓冲液以流速50～200cm/h平衡层析柱，平衡缓冲液体积为8～12倍柱体积；将步骤(2)的初级产物Ⅰ使用10～30kD的膜包超滤置换至电导小于5mS/cm，其中置换液为Q Besarose FF柱的平衡缓冲液，再将其pH调节为6.4～6.6后作为第二步层析的上样液，上样流速40～70cm/h，上样完毕后使用平衡缓冲液以流速40～70cm/h再次平衡3～5倍柱体积，使用组分为20～50mM磷酸钠，115mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～2mM EDTA-2Na的缓冲液作为洗杂缓冲液，其电导为13.5～13.9mS/cm，用10～12倍柱体积的洗杂缓冲液以流速40～70cm/h冲洗杂蛋白；再以pH为6.4～6.5的组分为20mM磷酸钠，240mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～2mM EDTA-2Na的缓冲液作为洗脱缓冲液进行洗脱，获得纯度为95％以上的OsrHSA-EGF融合蛋白。
本发明提供的从基因工程水稻中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子融合蛋白的方法，使用两步层析可得到纯度和活性令人满意的目标蛋白，产量较高。该方法成本较低，操作简单，重现性好，在工业上有广阔的应用前景。
附图说明
图1为pOsPM767质粒结构示意图
图2为pOsPM768质粒结构示意图
图3为pOsPM769质粒结构示意图
图4为为T1代基因工程材料中目的基因的阳性检测，其中M为DNA标准分子量Marker；1～43为T1代转基因材料，TP为台北阴性对照品。
图5Elisa定量检测种子表达量结果
图6采用不同的提取缓冲液和在不同的pH条件下提取OsrHSA-EGF融合蛋白所得提取混合物的上清液的SDS-PAGE分析(左)和免疫印迹分析(与EGF杂交)，其中M为marker。
图7用20mM PB，pH 7.5的提取液提取米粉后，分别调整提取混合物的pH为5.5，5.0，4.5进行酸沉1～6h，取提取混合物离心后的上清进行SDS-PAGE分析，其中M为marker。
图8GE填料SP FF和SP HP在pH 5.0条件下上样后进行NaCl线性洗脱收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中数字部分为取样点对应的电导值。
图9纳微填料Nano Gel 50SP在pH 5.0的上样条件下进行NaCl线性洗脱收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中数字部分为取样点对应的电导值。
图10Bestarose Diamond MMC填料在pH 5.0的上样条件下进行NaCl线性洗脱收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中数字部分为取样点对应的电导值，FT代表流穿液。
图11GE公司填料Q HP在pH 7.0上样条件下进行NaCl线性洗脱收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中数字部分为取样点对应的电导值。
图12GE公司填料Q FF在pH 7.0上样条件下进行NaCl线性洗脱收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中数字部分为取样点对应的电导值。
图13GE公司填料phenyl HP层析收集液的SDS-PAGE分析图谱。
图14GE公司填料octyl 4FF层析收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中数字部分为octyl 4FF填料使用20mM PB缓冲液线性洗脱对应的缓冲液电导值。
图15GE公司填料butyl 4FF层析收集液的SDS-PAGE分析图谱。
图16Bestarose Diamond MMC填料在pH 4.5上样条件下的层析收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中W1为洗杂1，W2为洗杂2，E为洗脱，load为上样液，FT为流穿液。
图17Bestarose Diamond MMC填料在pH 5.0上样条件下的层析收集液的SDS-PAGE分析图谱，其中W1为洗杂1，W2为洗杂2，E为洗脱，load为上样液，FT为流穿液。
图18Bestarose Diamond MMC填料在pH为6.8条件下进行穿透模式的层析收集液的SDS-PAGE图谱。
图19GE公司填料Q HP作为第二步层析的SDS-PAGE图谱和层析图谱，W为洗杂部分，E为洗脱部分，E还原和E非还原分别为洗脱部分的还原电泳的非还原电泳。
图20GE公司填料Q FF作为第二步层析的SDS-PAGE图谱和层析图谱，W为洗杂部分，E为洗脱部分，E还原和E非还原分别为洗脱部分的还原电泳的非还原电泳。
图21连续的三批Bestarose Diamond MMC-Q Bestarose FF串联层析重复验证的酸沉液，MMC洗脱液，Q FF洗脱液的SDS-PAGE分析图谱。
图22Bestarose Diamond MMC–Bestarose Q FF串联层析的SDS-PAGE分析图谱以及对应免疫印迹图谱。
图23三批OsrHSA-EGF融合蛋白纯品的活性分析曲线。
具体实施方式
以下通过结合附图详细说明本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中使用的Bestarose Diamond MMC(MMC)、Q Bestarose FF(Q FF)填料，生产商是博格隆(上海)生物技术有限公司；XK 26/20、XK16/20层析柱，Capto MMC填料购自通用电气(GE Healthcare)公司；其它材料或试剂如无特殊说明均为常规市售产品；
实施例1 OsrHSA-EGF转基因水稻种子的制备
本实施例选用水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽来介导重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子基因在水稻胚乳细胞中的表达，具体参考公开号为CN100540667中的方法来构建本发明的水稻特异性表达重组人血白蛋白-表皮细胞生长因子载体以及筛选基因工程水稻植株，将其中所述的重组人血清白蛋白换成本发明的重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子。用如图1所示的质粒pOsPMP767来构建水稻胚乳特异性表达盒。将所述合成的经密码子优化的人血清白蛋白-表皮细胞生长因子基因(SEQ ID NO.1)用MylI和XhoI酶切后克隆到pOsPMP02中构建成质粒pOsPMP768，如图2所示；然后用HindIII和EcoRI酶切pOsPMP768，将长度为3488bp的含Gt13a启动子及其信号肽序列还有经密码子优化的人血清白蛋白-表皮细胞生长因子基因以及Nos终止子的整个表达盒插入到双元表达载体1300，构建农杆介导菌质粒，命名为pOsPMP769，具体如图3所示。将所述pOsPMP769质粒转化根癌农杆菌EHA105(美国Invitrogen公司)，通过根癌农杆菌介导共转化将pOsPMP769转化到水稻品种TP309的愈伤再生组织中，经培养、筛选和诱导后形成完整的植株；然后，通过PCR扩增来鉴别阳性转化植株，用Gt13a启动子的正向引物Gt13a-F(5’-CACATCCATCATTATCCATCCACC-3’,SEQ ID NO.2)和重组人血清白蛋白-表皮细胞生长因子基因的反向引物HSA-EGF-R(5’-CACTCGGTGAAGGCGGCCTTG-3’,SEQ ID NO.3)进行特异PCR扩增，产物大小为732bp。。鉴别结果表明，基因工程水稻品系EGF-1229后代中均含目的基因人血清白蛋白-表皮细胞生长因子，鉴定结果如图4所示。
对收种后的114单株，每株随机取10粒种子磨粉后加入提取液，常温提取1h后离心取上清进行Elisa，筛选结果如图5(只列出表达量较高部分结果)HSA-EGF核酸序列表:
SEQ ID NO.1
实施例2重组人血清白蛋白-EGF(OsrHSA-EGF)融合蛋白粗提液的制备
将实施例1制备的OsrHSA-EGF转基因水稻种子脱壳成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取液以1：5(kg/L)的比例混合，于60℃搅拌提取1.5h，提取缓冲液成分为5～20mM磷酸盐、5～20mM醋酸钠、10～30mM硫酸铵、10～20mM辛酸钠，1～5mM还原型谷胱甘肽，pH 7.0～7.5。将上述米粉与提取液的混合物用乙酸调pH为4.5，搅拌酸沉4h，加入2～5％的珍珠岩进行压滤或离心，再经0.22μm的膜过滤后即为OsrHSA-EGF的粗提液，结果见图6和图7。
实施例3作为粗纯的阳离子层析填料筛选
比较GE公司的SP Spharose Fast Flow、SP Spharose HP、Capto MMC、博格隆公司的SP FF、SP HP、Diamond MMC，Nano-micro公司的Nano Gel 50sp三个厂家共7种阳离子填料，发现在平衡缓冲液为20mM NaAC，pH 5.0条件下,上样5倍柱体积时，GE公司的填料SPFF、SP HP和纳微公司的填料Nano Gel 50sp作为层析介质时，目标蛋白都有轻微的流穿；目标蛋白在博格隆公司的填料SP FF、SP HF上都能完全挂柱。但在以NaCl进行线性洗脱的情况下，以上单一模式的层析介质都未能取得理想的纯化效果，特别是水稻种子宿主蛋白50kD的杂带，在进一步的单一模式的纯化介质层析中很难将目的蛋白与此杂蛋白完全分离，且上样量受到限制在5倍柱体积以内。通过实验发现MMC阳离子层析介质能除掉大部分50kD杂蛋白，而且上样量较高，达20倍柱体积，可考虑作为第一步的提纯介质。具体层析结果见图8，图9和图10。
实施例4作为粗纯的阴离子层析填料筛选
比较GE公司的Q spharose Fast Flow、Q spharose HP，博格隆公司的Q FF、Q HP，2个厂家共4种阴离子离子填料。在以20mM PB为缓冲液，pH 7.0的条件下，上样5倍柱体积时目标蛋白在上述介质中均可完全挂柱，使用含有0.5M的NaCl的缓冲液进行线性洗脱，纯化效果较为理想，而且阴离子层析对50kD的杂蛋白带也有明显的分离效果。但进一步的实验发现阴离子交换填料上样量不超过5倍柱体积，不适宜作为粗纯层析介质。层析收集液的SDS-PAGE结果见图11和图12。
实施例5作为粗纯的疏水层析填料筛选
比较GE公司的phenly HP、phenly FF、octyl 4FF、butyl 4FF，博格隆公司的phenyl HP、phenly FF、octyl 4FF、butyl 4FF等8种填料，发现在20mM PB，pH 6.5的缓冲液条件下，上样体积为3倍柱体积时，phenyl和octyl 4FF层析的上样缓冲液中硫酸铵浓度优化为0.8M。但实验结果表明目标蛋白在phenyl上保留较强，大部分目标蛋白需要用不含硫酸铵的20mM PB缓冲液进行洗脱，而且50kd的杂带去除不明显；butyl 4FF对目标蛋白的保留较弱，在1M硫酸铵条件下上样能检测到轻微的穿透，而且粗提液在1M硫酸铵条件下会有轻微的沉淀产生。octyl 4FF层析的表现优于phenyl和butyl 4FF，具体层析结果见图13，图14和图15。
实施例6作为粗纯的MMC层析条件优化
经过上述粗纯介质的实验对比，确定MMC阳离子层析作为粗纯方法。实施例中选用Bestarose Diamond MMC进行说明，对上样样品的pH，洗杂液的pH及NaCl浓度，洗脱液的pH及NaCl浓度进行组合实验设计，确定以下3组层析条件：
第一组：平衡缓冲液组分为20mM NaAc，34mM NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mMEDTA-2Na，pH 4.5；
上样体积为20～25CV(柱体积，下同)；
洗杂液Ⅰ组分为20mM NaAc，10％(V/V)异丙醇，pH 4.5，洗杂液体积为4CV；
洗杂液Ⅱ组分为20mM NaAc，15％(V/V)异丙醇，1.6～1.88M NaCl，pH4.5，电导为82～93mS/cm，洗杂液体积为20CV；
洗脱缓冲液组分为20mM PB，0.4～0.5M NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH为6.4～6.5；
第二组：平衡缓冲液组分为20mM NaAc，34mM NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mMEDTA-2Na，pH 5.0；
上样体积为15～20CV；
洗杂液Ⅰ组分为20mM NaAc，10％(V/V)异丙醇，pH 5.0；
洗杂液Ⅱ组分为20mM NaAc，15％(V/V)异丙醇，1.4～1.6M NaCl，pH 5.0,电导为73～83mS/cm，洗杂体积为20CV；
洗脱缓冲液组分为20mM PB，0.4～0.5M NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH 6.4～6.5；
第三组：平衡缓冲液组分为20mM NaAc，34mM NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mMEDTA-2Na，pH 5.79～6.0；
其中第一组和第二组均为捕获/洗脱模式，第三组为流穿模式。经实验结果分析，第一组层析条件能获得较大上样体积，但由于上样pH为酸沉pH，随着上样的进行，上样液偶尔会有轻微的沉淀出现，但不影响层析的进行，目标蛋白产率稍低；第二组层析条件下，上样液较为稳定，上样体积稍低，洗脱后目标蛋白纯度较好，适合工艺放大；第三组流穿模式上样量为25CV以上，能除掉几乎所有的50kD杂蛋白和绝大部分的35kD的的杂蛋白，批次处理大，而且层析时间短，但相比结合模式，对内毒素控制力度小。三种层析条件下的层析实验结果见图16，图17，图18所示。
实施例7作为第二步精纯的Q阴离子柱层析条件优化
实施例中选用GE公司的Q HP填料进行说明，上样液为MMC层析洗脱液，使用10～30kD的膜包超滤将洗脱液置换至电导为4～9mS/cm。
实验过程中发现上样液在pH大于5.0的条件下，OsrHSA-EGF均能与Q，DEAE，Adhere等阴离子填料结合。作为第二步的层析工艺，优选与MMC层析洗脱缓冲液pH相近的体系条件，确定Q HP层析条件如下：平衡缓冲液组分为20mM PB，2mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH 6.5；洗杂缓冲液组分为20mM PB，115mM NaCl，1mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH6.5，电导为13.5～13.9mS/cm；洗脱缓冲液组分为20mM PB，240mM NaCl，1mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH 6.5，电导为23.5～35mS/cm。
进一步的实验表明在上样液和缓冲体系的pH为5.0～8.0时，均能通过实验找到接近最佳条件的洗杂液和洗脱液中的相应NaCl浓度和电导，例如另一种可选择的条件为pH7.0上样，洗杂液pH 7.0，电导为18.5～19.2mS/cm，洗脱液pH7.0，电导为25～35mS/cm。由于洗脱杂蛋白之后，挂柱的几乎全部为目标蛋白，所以洗脱的方式可以在合适的pH条件下进行洗脱，例如pH 4.5以下进行洗脱。具体实验结果见图19和图20。
MMC层析流穿液同样适用于串联Q，DEAE，Adhere等阴离子填料结合，但Q和DEAE类型阴离子填料同样受到载量的限制而不适用于工艺放大。一种可行方式是串联Adhere使用，同样能达到所需要的纯度，但由于成本因素，不在此进行说明。
实施例8Bestarose diamond MMC-Bestarose Q FF串联层析三批重复实验
按200g的米粉投料，进行连续的3批重复实验，所得目标蛋白的纯度，浓度，产率，活性见表1。从实验数据可知，本发明所提取的重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白纯度大于95％，且平均产率达686.4mg/kg米粉。
表1
三批Bestarose Diamond MMC–Bestarose Q FF串联层析各步骤的收集液的SDS-PAGE分析结果见图21、图22，目标蛋白的活性测定结果见图23。通过实验对比，本发明所得重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白与标准品Peprotech EGF的活性相当，具有较好的生物活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉禾元生物科技股份有限公司
<120> 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合
蛋白的方法
<130> WH1190-18P122266
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1977
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 经密码子优化的人血清白蛋白-表皮细胞生长因子基因
<400> 1
gacgcccaca agagcgaggt ggcccaccgc ttcaaggacc tcggcgagga gaacttcaag 60
gccctcgtgc tcatcgcctt cgcccagtac ctccagcagt gcccgttcga ggaccacgtg 120
aagctcgtga acgaggtgac cgagttcgcc aagacctgcg tggccgacga gagcgccgag 180
aactgcgaca agagcctcca caccctcttc ggcgacaagc tctgcaccgt ggccaccctc 240
cgcgagacct acggcgagat ggccgactgc tgcgccaagc aggagccgga gcgcaacgag 300
tgcttcctcc agcacaagga cgacaacccg aacctcccgc gcctcgtgcg cccggaggtg 360
gacgtgatgt gcaccgcctt ccacgacaac gaggagacct tcctcaagaa gtacctctac 420
gagatcgccc gccgccaccc gtacttctac gccccggagc tcctcttctt cgccaagcgc 480
tacaaggccg ccttcaccga gtgctgccag gccgccgaca aggccgcctg cctcctcccg 540
aagctcgacg agctccgcga cgagggcaaa gcctccagcg ccaagcagcg cctcaagtgc 600
gccagcctcc agaagttcgg cgagcgcgcc ttcaaagcct gggccgtggc ccgcctcagc 660
cagcgcttcc cgaaggccga gttcgccgag gtgtccaagc tcgtgaccga cctcaccaag 720
gtgcacaccg agtgctgcca cggcgacctc ctggagtgcg ccgacgaccg cgccgacctc 780
gccaagtaca tctgcgagaa ccaggacagc atctccagca agctcaagga gtgctgcgag 840
aagccgctcc tggagaagtc ccactgcatc gccgaggtgg agaacgacga gatgccggcc 900
gacctcccgt ccctcgccgc cgacttcgtg gagagcaagg acgtgtgcaa gaactacgcc 960
gaggccaagg acgtcttcct cggcatgttc ctctacgagt acgcccgccg ccacccggac 1020
tactccgtgg tgctcctcct ccgcctcgcc aagacctacg agaccaccct ggagaagtgc 1080
tgcgccgccg ccgacccgca cgagtgctac gccaaggtgt tcgacgagtt caagccgctc 1140
gtggaggagc cgcagaacct catcaagcag aactgcgagc tcttcgagca gctcggcgag 1200
tacaagttcc agaacgccct cctcgtgcgc tacaccaaga aggtgccgca ggtgtccacc 1260
ccgaccctcg tggaggtgtc ccgcaacctc ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac 1320
ccggaggcca agcgcatgcc gtgcgccgag gactacctct ccgtggtgct caaccagctc 1380
tgcgtgctcc acgagaagac cccggtgagc gaccgcgtga ccaagtgctg caccgagagc 1440
ctcgtgaacc gccgcccgtg cttctccgcc ctggaggtcg acgagaccta cgtcccgaag 1500
gagttcaacg ccgagacctt caccttccac gccgacatct gcaccctctc cgagaaggag 1560
cgccagatca agaagcagac cgccctcgtc gagctcgtga agcacaagcc gaaggccacc 1620
aaggagcagc tcaaggccgt gatggacgac ttcgccgcct tcgtggagaa gtgctgcaag 1680
gccgacgaca aggagacctg cttcgccgag gagggcaaga agctcgtggc cgccagccag 1740
gccgccctcg gcctcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1800
gacgacgacg accgcaacag cgacagcgag tgcccgctca gccacgacgg ctactgcctc 1860
cacgacggcg tgtgcatgta catcgaggcc ctcgacaagt acgcctgcaa ctgcgtggtg 1920
ggctacatcg gcgagcgctg ccagtaccgc gacctcaagt ggtgggagct ccgctga 1977
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 2
cacatccatc attatccatc cacc 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 3
cactcggtga aggcggcctt g 21
Claims (12)
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：
1)将含有重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的转基因水稻种子脱壳磨碎后加入提取液得到提取混合物；提取液组分为5～20mM磷酸盐，5～20mM醋酸钠，10～30mM硫酸铵，10～20mM辛酸钠，1～5mM还原型谷胱甘肽，pH6.0～8.0；将所述提取混合物的pH调节至4.5～5.9，搅拌酸沉后过滤得到含重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的粗提液；
2)将粗提液经阳离子交换层析得到初级产物Ⅰ；
3)将初级产物Ⅰ经阴离子交换层析得到纯化的重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)的方法为：
2a)将所述转基因水稻种子脱壳成半精米，并磨碎至细度为80～100目的米粉，将所述米粉与提取液按照比例为1：5～1：10(kg/L)混合得到提取混合物，提取时间为1～2h，提取温度为25～60℃；
2b)将所述提取混合物的pH用乙酸调整为4.5～5.9进行酸沉，酸沉时间为1～8h，酸沉温度为4℃～30℃，酸沉方式为慢速搅拌；
2c)将2b)步骤的提取混合物酸沉后离心或用2～5％重量的珍珠岩进行压滤后，经0.22～0.45μm滤膜微滤得到含重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的粗提液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取液组分为10mM磷酸盐，10mM醋酸钠，20mM硫酸铵，20mM辛酸钠，2mM还原型谷胱甘肽，pH为7.5；米粉与提取液的比例为1：5(kg/L)，提取时间为1.5h，提取温度为55～60℃。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述提取混合物酸沉的pH为4.5，酸沉时间为4h，酸沉方式为慢速搅拌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中阳离子交换层析填料为Capto MMC或Bestarose Diamond MMC。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中阴离子交换层析填料选自QBestarose Fast Flow、Q Bestarose HP、Bestarose DEAE、Q SepharoseTMHP、QSepharoseTMFast Flow和DEAE SepharoseTMFast Flow。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述阳离子交换层析填料为Capto MMC或Bestarose Diamond MMC，层析步骤为：
7a)使用平衡缓冲液以50-200cm/h的流速平衡层析柱，所述平衡缓冲液组分为20～50mM NaAc，0～40mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mM EDTA-2Na，pH为4.5～5.5，电导为5～10mS/cm；
7b)以步骤1)中的粗提液为上样样品，其电导为5～10mS/cm，pH为4.5～5.5，上样流速为100～170cm/h；
7c)使用7a)的缓冲液8～10倍柱体积再平衡层析柱，使用3～5倍柱体积的洗杂缓冲液I以100～170cm/h的流速洗脱杂蛋白，所述洗杂缓冲液I的组分为20～50mM NaAc，10％～15％(V/V)异丙醇，pH为4.5～5.5；
7d)使用20～25倍柱体积的洗杂缓冲液II以100～170cm/h的流速再次洗脱杂蛋白,所述洗杂缓冲液II组分为20～50mM NaAc，10％～15％(V/V)异丙醇，1.2～1.88M NaCl，pH为4.5～5.5；
7e)使用洗脱缓冲液以100～170cm/h的流速洗脱目标蛋白，所述洗脱缓冲液的组分为20～50mM磷酸盐，0.4～0.5M NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mM EDTA-2Na，pH为6.0～6.5，所得洗脱液即为初级产物I。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述阳离子交换层析条件为：
8a)使用平衡缓冲液以50-200cm/h的流速平衡层析柱，平衡缓冲液组分为20mM NaAc，34mM NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH为5.0；
8b)以步骤1)中的粗提液为上样样品，其电导为5～10mS/cm，pH为4.5～5.5，上样流速为100～170cm/h；
8c)使用8a)的缓冲液8～10倍柱体积再平衡层析柱，使用3～5倍柱体积的洗杂缓冲液I以100～170cm/h的流速洗脱杂蛋白，所述洗杂缓冲液I的组分为20mM NaAc，10％(V/V)异丙醇，pH为4.5；
8d)使用20～25倍柱体积的洗杂缓冲液II以100～170cm/h的流速再次洗脱杂蛋白,所述洗杂缓冲液II组分为20mM NaAc，15％(V/V)异丙醇，1.6M NaCl，pH为5.0；
8e)使用洗脱缓冲液以100～170cm/h的流速洗脱目标蛋白，所述洗脱缓冲液的组分为20mM磷酸盐，0.4～0.5M NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH为6.4～6.5，所得洗脱液即为初级产物I。
9.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于所述的阴离子交换填料为Q BestaroseFF，层析步骤为：
9a)使用平衡缓冲液以50-200cm/h的流速平衡层析柱，所述平衡缓冲液的组分为20～50mM磷酸盐，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mM EDTA-2Na，电导为2.5～9mS/cm，pH为6.0～8.0；
9b)以9a)中的平衡缓冲液为置换液，将7e)步骤所得的初级产物Ⅰ使用10～30kd的膜包超滤置换，置换后溶液电导为2.5～9mS/cm，调节pH为6.0～8.0，作为阴离子交换层析的上样液；
9c)使用4～8倍柱体积的9a)步骤的平衡缓冲液以40～70cm/h流速再平衡层析柱，使用9～12倍柱体积的洗杂缓冲液以40～70cm/h流速洗脱杂蛋白，所述洗杂缓冲液的组分为20～50mM磷酸盐，114～120mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mM EDTA-2Na，电导为13.5～14.5mS/cm，pH为6.4～6.6；
9d)使用洗脱缓冲液以40～70cm/h流速洗脱目标蛋白，所述洗脱缓冲液的组分为20～50mM磷酸盐，225～350mM NaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mM EDTA-2Na，电导为23.5～35mS/cm，pH为6.4～6.6，所得洗脱液即为纯化的重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述层析条件为：
10a)使用平衡缓冲液以50-200cm/h的流速平衡层析柱，所述平衡缓冲液的组分为20mM磷酸盐，2mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，电导为2.7～2.9mS/cm，pH为6.5；
10b)以10a)中的平衡缓冲液为置换液，将7e)步骤所得的初级产物Ⅰ使用10～30kd的膜包超滤置换，置换后溶液电导为2.5～9mS/cm，调节pH为6.0～8.0，作为阴离子交换层析的上样液；
10c)使用4～8倍柱体积的10a)步骤的平衡缓冲液以40～70cm/h流速再平衡层析柱，使用9～12倍柱体积的洗杂缓冲液以40～70cm/h流速洗脱杂蛋白，所述洗杂缓冲液的组分为20mM磷酸盐，115mM NaCl，1mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，电导为13.5～13.9mS/cm，pH为6.5；
10d)使用洗脱缓冲液以40～70cm/h流速洗脱目标蛋白，所述洗脱缓冲液的组分为20mM磷酸盐，240mM NaCl，1mM还原型谷胱甘肽，1mM EDTA-2Na，pH为6.5，所得洗脱液即为纯化的重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白。
11.一种用于制备权利要求1所述的基因工程水稻种子的植物表达载体，其特征在于，所述表达载体是将表达人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的基因与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。
12.根据权利要求11所述的植物表达载体，其特征在于所述表达人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所示质粒载体为pOsPMP767。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910074848.1A CN111484557B (zh) | 2019-01-25 | 2019-01-25 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910074848.1A CN111484557B (zh) | 2019-01-25 | 2019-01-25 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111484557A true CN111484557A (zh) | 2020-08-04 |
| CN111484557B CN111484557B (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=71791346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910074848.1A Active CN111484557B (zh) | 2019-01-25 | 2019-01-25 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111484557B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113880908A (zh) * | 2021-08-25 | 2022-01-04 | 北京伟德杰生物科技有限公司 | 纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法 |
| CN115236222A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-10-25 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004005340A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Nexgen Biotechnologies, Inc. | Fusion polypeptide comprising epidermal growth factor and human serum albumin |
| CN1896239A (zh) * | 2005-07-13 | 2007-01-17 | 杨代常 | 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白 |
| CN101121753A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-02-13 | 天津溥瀛生物技术有限公司 | 对多种皮肤细胞修复具持续作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
| CN101172091A (zh) * | 2007-09-25 | 2008-05-07 | 天津溥瀛生物技术有限公司 | 含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途 |
| CN101260145A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-09-10 | 北京未名福源基因药物研究中心有限公司 | 一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 |
| CN102532254A (zh) * | 2010-12-24 | 2012-07-04 | 武汉禾元生物科技有限公司 | 一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法 |
| CN103880947A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 武汉禾元生物科技有限公司 | 一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法 |
-
2019
- 2019-01-25 CN CN201910074848.1A patent/CN111484557B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004005340A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Nexgen Biotechnologies, Inc. | Fusion polypeptide comprising epidermal growth factor and human serum albumin |
| US20060195945A1 (en) * | 2002-07-03 | 2006-08-31 | Sun Lee | Method for preparing fusion polypeptide comprising epidermal growth factor and human serum albumin in plants |
| CN1896239A (zh) * | 2005-07-13 | 2007-01-17 | 杨代常 | 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白 |
| CN101121753A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-02-13 | 天津溥瀛生物技术有限公司 | 对多种皮肤细胞修复具持续作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
| CN101172091A (zh) * | 2007-09-25 | 2008-05-07 | 天津溥瀛生物技术有限公司 | 含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途 |
| CN101260145A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-09-10 | 北京未名福源基因药物研究中心有限公司 | 一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 |
| CN102532254A (zh) * | 2010-12-24 | 2012-07-04 | 武汉禾元生物科技有限公司 | 一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法 |
| CN103880947A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 武汉禾元生物科技有限公司 | 一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113880908A (zh) * | 2021-08-25 | 2022-01-04 | 北京伟德杰生物科技有限公司 | 纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法 |
| CN113880908B (zh) * | 2021-08-25 | 2024-05-14 | 北京伟德杰生物科技有限公司 | 纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法 |
| CN115236222A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-10-25 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
| CN115236222B (zh) * | 2022-06-29 | 2023-12-22 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111484557B (zh) | 2023-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU773736B2 (en) | Novel expression cassette for expressing genes in plant seed | |
| US6777591B1 (en) | Legume-like storage protein promoter isolated from flax and methods of expressing proteins in plant seeds using the promoter | |
| US6329567B1 (en) | Methods for improving seeds | |
| CN108949753B (zh) | 基因表达载体Wxb-10T的构建、转基因水稻的制备及引物 | |
| CA2587092C (en) | A method of expressing small peptides using cereal non-storage proteins as fusion carrier in endosperm and the use thereof | |
| AU782218B2 (en) | Flax seed specific promoters | |
| Cho et al. | Cassettes for seed-specific expression tested in transformed embryogenic cultures of soybean | |
| CN101218347A (zh) | 产率增加的植物及其制备方法 | |
| CN111484557B (zh) | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 | |
| CN113150120A (zh) | 发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法 | |
| WO2019190130A1 (ko) | 파라고무나무 유래의 라텍스 분비 조직 특이적 ＰＥＰ１６ 유전자 프로모터 (ｐＰＥＰ１６) 및 이의 용도 | |
| US20240279668A1 (en) | Modified plant endosperm specific promoter and use thereof | |
| CA2890659C (en) | Method for producing, isolating and purifying recombinant human antitryptase (osraat) from rice seeds | |
| JP7312830B2 (ja) | 遺伝子改良水稲の子実から組換えヒトフィブロネクチンを分離精製する方法 | |
| KR20150117645A (ko) | 쌀 종자로부터 재조합 인간 염기성 섬유아세포성장인자를 생성하는 방법 | |
| CN113736784B (zh) | 银杏长链非编码RNA Lnc2L和Lnc2S及其载体和应用 | |
| CN112646044B (zh) | TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法 | |
| CN108342400B (zh) | 重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN111285929B (zh) | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法 | |
| WO2013062258A2 (ko) | 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도 | |
| CN112159465B (zh) | Drn蛋白质及相关生物材料与其在提高植物体细胞再生效率上的应用 | |
| CN111500623B (zh) | 一种提高农杆菌介导的植物遗传转化效率的方法 | |
| KR100974302B1 (ko) | 페투인이 발현된 감자 식물체 | |
| JP3512217B2 (ja) | エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子 | |
| KR20240146162A (ko) | 라이스 캘러스를 이용한 bmp 10 단백질 생산 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |