CN102532254A - 一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从转基因水稻中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括步骤：1)将重组人血清白蛋白粗提取物进行阳离子交换层析，得到初级产物I；2)将初级产物I进行阴离子交换层析，得到中级产物II；3)将中级产物II进行疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。该方法成本低，易于操作，并且获得的rHSA达到99％以上的HPLC纯度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从水稻种子中规模化分离纯化重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。
背景技术
人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。
目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点：一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在问题，例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。因此，利用DNA重组技术生产人血清白蛋白成为当务之急。
随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(rHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产rHSA，例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta，M.etal.，Bio/Technology，5：1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders，C.W.et al，J.Bacteriol.169：2917-2925，(1987))，真核生物如酵母(WO 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产rHSA。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。
本发明人的中国专利申请No.200510019084公开了一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产rHSA的方法，包括利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导rHSA进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使rHSA能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。所得的rHSA的表达水平至少达到水稻种子重量的0.3％以上。该方法具有表达量高、成本低的优势，为蛋白药物的生产开辟了一条新途径。
利用任何表达体系生产重组蛋白在进入市场之前需要纯化，而纯化工艺的优劣不仅影响产品质量，还影响生产成本，在纯化与加工步骤的成本是整个成本的80-90％，尤其是从水稻种子中纯化重组人血清白蛋白还没有纯化工艺。因此，研究从水稻种子中纯化人血清白蛋白的简单纯化工艺和工艺流程，具有很大的技术难度和风险。
目前，国际上还没有从转基因水稻种子中提取rHSA的工艺，尽管有从酵母和植物悬浮细胞提取重组人血清白蛋白的技术，例如中国专利申请CN101768206A公开了一种毕赤酵母表达的rHSA的纯化方法，包括rHSA的发酵液经陶瓷膜处理，依次经过阳离子交换层析、疏水层析和弱阴离子交换层析，得到纯化的rHSA。然而，由于种子的杂蛋白与酵母和植物悬浮细胞存在很大差别，这些技术不能直接用于水稻种子的rHSA的分离与纯化，因此有必要研究和开发一种简单、高效地从水稻种子中分离纯化rHSA的工艺与流程，获得较高得率、高纯度的rHSA，为工业化生产提供基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种规模化的从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括步骤：
1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物I；
2)将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II；
3)将中级产物II经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。
步骤1)中，阳离子交换层析的填料可以选自UNO Sphere S、Nuvia S、CaptoMMC、MacroPrep-CM等强阳离子层析树脂。优选使用UNO Sphere S。阳离子交换层析可以采用pH梯度洗脱或者氯化钠浓度梯度洗脱，优选pH梯度洗脱。在一种实施方式中，阳离子交换层析的洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液，0.25M氯化钠，pH5.2。
步骤2)中，阴离子交换层析的填料可以选自UNOsphere Q、Q Sepharose FF和DEAE sepharose FF等强阴离子层析树脂。优选使用Q Sepharose FF。在一种实施方式中，阴离子交换层析的洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.2M氯化钠，pH7.5。
步骤3)中，疏水层析的填料可以选自Phenyl sepharose HP、Phenyl sepharoseFF、macro-prep t-butyl和macro-prep methyl等。优选使用Phenyl sepharose HP。
经疏水层析获得的目标洗脱组分可用已知的方法，例如超滤浓缩、冷冻干燥等方法制成成品。
在阳离子交换层析中，使用的上样缓冲液包括醋酸盐缓冲液，其pH小于5.0。
阳离子交换层析中使用的目标物(即重组人血清白蛋白)的洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液和氯化钠，或者磷酸盐缓冲液和氯化钠；缓冲液的pH为5.0～pH6.7。优选的氯化钠的浓度为0.25M，缓冲液的pH为5.2。
在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为UNO Sphere S时，使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、0.25M氯化钠，pH5.2。
在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为nuvia S时，洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液、0.25M氯化钠，pH5.0。
在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为Capto MMC时，洗脱杂质使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、1M氯化钠，pH4.7；洗脱目标物使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，1M氯化钠，pH6.7。
在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为MacroPrep-CM时，洗脱杂质使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、1M氯化钠，pH4.7；洗脱目标物使用的磷酸盐缓冲液，0.1M氯化钠，pH6.5。
在一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为Q Sepharose FF时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.25M氯化钠。
在一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为DEAE sepharose FF时，洗脱杂质使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.1M氯化钠，洗脱目标物使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.25M氯化钠。
在疏水层析中，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.1M～1M。
在一种实施方式中，当疏水层析的填料为Phenyl sepharose HP时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.4M。
在一种实施方式中，当疏水层析的填料为Phenyl sepharose FF时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.1M。
在一种实施方式中，当疏水层析的填料为MacroPrep-t-Butyl时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.6～1.0M。
本发明的所述重组人血清白蛋白可以通过本申请人的中国专利申请No.200510019084.4中公开的方法利用水稻胚乳细胞作为生物反应器来生产。在转基因水稻中表达的重组人血清白蛋白可以通过本发明人于2010年12月20日提交的中国专利申请No.201010597544.2中公开的方法提取，优选地包括步骤：
i)将含有重组人血清白蛋白的转基因稻米与提取缓冲液按重量/体积比(kg/l)1∶5混合，在55～60℃下提取1～1.5小时；提取缓冲液包含10～30mM磷酸盐缓冲液、10～20mM醋酸钠、15～30mM硫酸铵与5～20mM辛酸钠，其pH为6.5～8；
ii)将步骤i)的提取混合物的pH用醋酸调节至4.0～4.5，并沉淀3～12小时；
iii)过滤步骤ii)的混合物，通过压滤或等同方法去除淀粉，然后收集滤液，获得含有高浓度重组人血清白蛋白的粗提溶液。
在一种实施方式中，步骤iii)的过滤包括用滤布式板框压滤机压滤，接着用中空纤维膜微滤。所述中空纤维膜为孔径0.20μm～0.45μm的聚醚砜材质中空纤维膜，优选为孔径0.20μm的聚醚砜中空纤维膜。
本发明的技术方案具有以下有益效果：
1、本发明针对水稻种子中具有较高含量色素和多糖类物质，在第一步使用阳离子交换层析，能有效地提高了捕获重组人血清白蛋白的载量，提高了层析效率，若使用阴离子作为第一步层析，捕获重组人血清白蛋白的载量是理论载量的20％左右；同时由于在UNO Sphere S在氢氧化钠中具有极高的稳定性和很长的寿命，延长了填料的折旧期和简化了清洗操作，进一步降低了目标产品的成本。
2、本发明在第二步使用阴离子交换层析，加之洗脱的优化条件，可以去除80％以上的水稻种子的杂蛋白，能有效地去除杂蛋白质和回收重组人血清白蛋白；种子中色素和多糖类物质通过第一步阳离子交换层析给予去除，消除了种子中色素和多糖类物质在第二步阴离子层析的载量和纯度的影响。
3、本发明在第三步使用疏水介质层析，通过三步层析法，使纯化的目标产品的HPLC纯度达到99.0％以上。
附图说明
图1：以阳离子交换层析作为初级纯化，用不同填料进行层析时的电泳图谱，其中A为UNOsphere S填料，B为Nuvia S填料，C为Capto MMC填料，D为MacroPrep-CM填料。
图2：Nuvia S和UNO Sphere S填料在不同流速下(300cm/h和600cm/h)对rHSA提取液样品的载量比较图；
图3：以阴离子交换层析作为初级纯化，用不同填料进行层析时的电泳图谱，其中A为UNO Sphere Q填料；B为Q Sepharose FF填料；
图4：透析前后Q Sepharose FF填料对rHSA提取液的载量变化和提取液样品的多糖含量变化图；
图5：以阴离子交换层析作为中级纯化，用不同填料进行层析时的电泳图谱，其中A为Q Sepharose FF填料；B为DEAE sepharose FF填料；
图6：以疏水层析作为末级纯化，用不同填料进行层析时的电泳图谱，其中A为Phenyl Sepharose HP填料，B为Phenyl Sepharose FF填料，C为MacroPrep-t-Butyl填料；
图7：含有rHSA的粗提取液依次经阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析进行纯化的电泳图谱，其中使用的填料依次为UNOsphere S、Q SepharoseFF和Phenyl Sepharose HP；
图8：纯化后获得的rHSA产品的HPLC纯度图谱(HPLC-SEC)；
上述附图中，S：上样样品，FT：穿透峰，Elu：rHSA洗脱峰，Elu1：杂质洗脱峰，Elu2：rHSA洗脱峰，CIP：在位清洗。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
阳离子交换层析中层析介质和洗脱条件的筛选
本发明人将所需要筛选的填料限定为具有较高工作流速的阳离子交换树脂，包括伯乐公司生产的UNO Sphere S、Nuvia S、Capto MMC等填料。
通过实验发现，Capto MMC蛋白纯化效果最好；Nuvia S与UNO Sphere S次之，Nuvia S与UNO Sphere S对白蛋白纯化无明显区别，三者均可用于重组人血清白蛋白的纯化。但是，在工作流速下UNO Sphere S的载量是Capto MMC的1.5倍；UNO Sphere S的工作流速与Capto MMC相同；该填料比即使在高浓度的氢氧化钠中也具有极佳的稳定性，清洗工艺、使用寿命和价格优于CaptoMMC。
Nuvia S和UNO Sphere S是性质极为接近的两种填料，区别在于配基延伸的长度和基质颗粒大小。在各自最佳工作流速下Nuvia S的载量为UNO S的1.4倍；但是Nuvia S工作流速为UNO Sphere S的一半，UNO Sphere S在同样流速下载量反而比Nuvia S大；且两者之间纯化能力相当。
综合各种因素，将UNO Sphere S作为优选的阳离子层析介质。
将含有rHSA的提取液以较低的pH值(pH＝4.4)上样于装有UNO SphereS的层析柱上，以确保rHSA能够完全被吸附在柱子上，然后分别采用pH梯度和氯化钠梯度两种方法经行洗脱，了解基本的洗脱条件。
结果发现，在pH梯度洗脱中，吸附在UNO Sphere S层析柱上的rHSA，当pH大于5.5时开始微弱地解吸附，预示料液的上样pH不能大于5.5；当洗脱液pH为5.68时，rHSA完全从柱上被洗脱下来。因此rHSA在UNO Sphere S层析柱上对pH洗脱十分敏感。在氯化钠浓度梯度洗脱中，目标蛋白rHSA在35％氯化钠浓度到60％1M氯化钠浓度梯度范围内都有rHSA被洗脱下来，据此认为rHSA在UNO Sphere S层析柱上对氯化钠浓度梯度洗脱并不敏感。结果证明pH梯度和氯化钠梯度均可用于洗脱rHSA：pH梯度能够较快洗脱rHSA，洗脱体积小，而氯化钠梯度则不易洗脱rHSA，所需氯化钠浓度较高，而且洗脱体积大。
综合考虑纯化效果和回收率，以0.25M氯化钠，pH 5.2作为优选的洗脱条件。
阴离子交换层析中层析介质和洗脱条件的筛选
和阳离子一样，阴离子也可以用于重组人血清白蛋白的纯化，本发明限定流速和载量都很高的阴离子填料，包括UNOsphere Q、Q Sepharose FF和DEAEsepharose FF等。实验发现，它们均可用于纯化重组人血清白蛋白，UNOsphere Q比Q Sepharose FF流速更大，但Q Sepharose FF比UNOsphere Q的纯化效果更好；而DEAE Sepharose FF与Q Sepharose FF纯化效果相似，但是流速较慢。
如前所述，UNO-sphere S作为阳离子交换层析中的介质，其具有纯化能力相对于Capto MMC略显不足的缺点，然而，通过实验证明，这种不良影响可以被系统纯化能力的提升所消除。UNO-sphere S不会对下一步阴离子交换层析造成其他不良影响。在阴离子交换层析中，优选用Q sepharose FF作为层析介质；例如，洗脱目标物的缓冲液包括磷酸盐缓冲液和0.2M氯化钠，pH6.8。
阴阳离子交换层析顺序的确定
阴阳离子交换层析均可以用于重组人血清白蛋白的初步纯化，但是实验发现，阴离子交换层析Q Sepharose FF用于初步纯化时，载量远远低于理论载量，疑为水稻中大量可溶性多糖和核酸有关，因为可溶性多糖和核酸带负电荷，可以与阴离子交换层析Q Sepharose FF结合而降低其载量，实验证实通过透析可以降低提取液中的可溶性多糖的含量，而提高Q Sepharose FF的载量。
而阳离子交换层析填料UNOsphere S，Nuvia S和Capto MMC则不与可溶性多糖和核酸相互结合，不出现载量下降的情况。因此确定阳离子交换层析作为初步纯化，而阴离子交换层析作为中度纯化。
疏水层析中层析介质的筛选
本发明分别用多种具有相近性质的疏水性填料来进行该纯化步骤，包括Phenyl sepharose HP、Phenyl sepharose FF(LS)、macro-prep t-butyl和macro-prepmethyl。
Phenyl sepharose HP疏水填料的疏水性较强；纯化能力突出，能够去除相当部分的杂蛋白和原料中的非蛋白质成分，是决定工艺纯化效果的最重要步骤。但是由于该填料颗粒较细、流速低，工作模式特殊，在应用上也带来了不便。
Phenyl sepharose FF(LS)与Phenyl sepharose HP相比，具有相同的配基和基质，不同之处在于球状基质的直径和配基的密度。前者的基质平均粒径比后者大3倍左右，因此具备较高的工作流速。应用于rHSA生产，则可以缩短生产周期。MacroPrep-Butyl则比Phenyl sepharose FF，Phenyl sepharose HP疏水性更弱。而Macro-prep methyl的疏水性比MacroPrep-Butyl弱。
Phenyl sepharose FF拟采用和Phenyl sepharose HP相同的收集穿透的工作方式。在上样盐浓度的筛选中，当以25mM PB+0.5M(NH4)2SO4PH6.8的平衡液上样，以100％水洗脱时，发现有超过50％的rHSA都挂在柱上，平衡液的盐浓度需要调低。
将经过UNOsphere S和Q sepharose FF处理后的样品调整硫酸铵浓度分别为0.2M和0.1M后，上样于装有Phenyl sepharose FF(LS)的层析柱上，收集穿透液和纯水洗脱液，并进行电泳检测。结果发现，Phenyl sepharose FF(LS)和Phenylsepharose HP相比具有更高的疏水性，在上样料液中硫酸铵浓度低至0.1M时仍然对样品的杂蛋白具有较好的去除效果，得到纯度为93.5％的样品，但经检测，仍有30％rHSA左右的样品损失于Phenyl sepharose FF(LS)。用氯化钠取代硫酸铵进行上述实验，得到与硫酸铵相似的结果，吸附在柱子上而损失的rHSA有所减少，但是HPLC纯度93％。
将经过UNO sphere S和Q sepharose FF处理后的样品调整硫酸铵浓度分别为1M、0.8M或0.6M后，上样于分别装有macro-prep t-butyl和macro-prep methyl的层析柱上，收集穿透液和纯水洗脱液，并进行电泳检测。结果发现，macro-prept-butyl和macro-prep methyl的疏水性较差。两者对rHSA的纯化能力均较差，纯化的得到的rHSA经HPLC检测结果纯度为90％。
综上所述，其他填料与Phenyl sepharose HP相比的优点是可以在高流速下工作，然而它们都不能达到与Phenyl sepharose HP相当的纯化效果。Phenylsepharose HP的处理速度较慢，但可以确保目标蛋白质有大于98％的纯度，优选用Phenyl sepharose HP作为疏水层析介质。
实施例
材料及仪器：
滤布式板框压滤机，型号XMS4/500-UB，制造商上海天立压滤机技术有限公司
0.20μm中空纤维柱，购自湖州科滤膜技术有限公司
UNO Sphere S、nuvia S、Capto MMC，MacroPrep-CM，MacroPrep-methyl，MacroPrep-Butyl填料，生产商是伯乐(BIO-RAD)公司
Q sepharose，Phenyl sepharose HP，Phenyl sepharose FF，DEAE-sepharoseFF填料，生产商是通用电气(GE Healthcare)公司
C10//10，XK 16/20层析柱，购自通用电气(GE Healthcare)公司
Biological 15/200层析柱，购自伯乐(BIO-RAD)公司
【实施例1】从转基因稻米中提取rHSA
参考本发明人的中国专利申请No.200510019084的方法制备含有rHSA的转基因水稻。将转基因稻谷脱壳成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1∶5(重量/体积，kg/l)的比例混合，于60℃提取1.5小时。提取缓冲液的成分为：25mM磷酸盐缓冲液、20mM醋酸钠、10mM硫酸铵、10mM辛酸钠，pH7.5。将上述得到的混合物用醋酸调节pH至4.5，并放置沉淀至少3小时，依次经滤布式板框压滤机压滤和孔径0.20μm的聚醚砜中空纤维柱过滤，得到澄清的rHSA提取液。目标蛋白rHSA的浓度约为0.66mg/ml。
【实施例2】通过阳离子交换层析进行初级纯化
1、利用UNO Sphere S进行阳离子交换层析
将UNO Sphere S填料约8.7ml装于XK16/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2g/L，醋酸调节pH为4.5)以300cm/h的流速平衡柱子，直到其pH值无变化。将实施例1中获得的含有rHSA的提取液样品250ml以600cm/h的流速上柱。样品电导为6.1ms/cm。样品的pH为4.53。上样结束后，用缓冲液(醋酸钠2g/L、醋酸pH 5.2、氯化钠14.61g/L)以300cm/h的流速洗脱样品，收集洗脱液，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图1A所示。
2、利用Nuvia S进行阳离子交换层析
将Nuvia S填料约9.3ml装于XK16/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2g/L，以醋酸调节至pH 4.5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH值稳定。将实施例1中获得的含有rHSA的提取液样品250ml以300cm/h的流速上柱。样品电导为6.3ms/cm。样品的pH为4.56。上样结束后，用缓冲液(醋酸钠2g/L、醋酸pH5.0、氯化钠14.61g/L)以300cm/h的流速洗脱样品，收集洗脱液，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图1B所示。
3、利用Capto MMC进行阳离子交换层析
将Capto MMC填料约15.1ml装于XK16/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2g/L，以醋酸调节至pH4.5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到4.5左右，并稳定。将实施例1中获得的含有rHSA的提取液样品250ml以600cm/h的流速上柱。样品电导为6.3ms/cm。样品的pH为4.56。上样结束后，用缓冲液(醋酸钠2g/L、醋酸pH4.7、氯化钠58.44g/L)以300cm/h的流速洗脱杂质，杂质峰洗脱完毕之后，用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L、氯化钠58.44g/L，pH6.7)洗脱样品，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图1C所示。
4、MacroPrep-CM进行阳离子交换层析
将MacroPrep-CM填料约10ml装于16/100层析柱上，用300ml缓冲液(无水醋酸钠2g/L，以醋酸调节至pH4.5)以流速200cm/h平衡柱子，直到其pH达到4.5左右，并稳定。将实施例1中获得的含有rHSA的提取液样品250ml以300cm/h的流速上柱。样品电导为6.3ms/cm。样品的pH为4.56。上样结束后，用缓冲液(醋酸钠2g/L、醋酸pH4.7、氯化钠58.44g/L)以200cm/h的流速洗脱杂质，杂质峰洗脱完毕之后，用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L、氯化钠5.84g/L，pH6.5)洗脱样品，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图1D所示。
5、Nuvia S和UNO Sphere S对提取液的载量比较
将Nuvia S，UNO Sphere S填料约5ml分别装于C10/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2g/L，以醋酸调节至pH4.5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到4.5左右，并稳定，将实施例1获得的含有rHSA的提取液样品以300cm/h分别上到Nuvia S和UNO Sphere S上，记录上样过程的UV280，直到UV280超过平台期10％为止，记录上样量，计算出300cm/h流速下，每毫升Nuvia S，UNO Sphere S的实际载量。同时，再用缓冲液(无水醋酸钠2g/L，以醋酸调节至pH 4.5)以流速300cm/h平衡UNO Sphere S，直到其pH达到4.5左右，并稳定，将实施例1获得的含有rHSA的提取液样品以600cm/h上到UNOSphere S上，记录上样过程的UV280，直到UV280超过平台期10％为止，记录上样量，计算出600cm/h流速下，每毫升UNO Sphere S的实际载量。载量比较如图2所示。
【实施例3】通过阴离子交换层析进行初级纯化
1、利用UNO Sphere Q进行阴离子交换层析
将UNO Sphere Q填料约10ml装于Biological 15/200层析柱上，用200ml缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，用氢氧化钠或者盐酸调节其pH为7.5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到7.0左右，并稳定。将实施例1中的提取液pH调至7.5，并用缓冲液稀释直到其电导低于10.0ms，将该样品以300cm/h的流速上到UNO Sphere Q上，用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠11.68g/L)洗脱杂质，杂质峰洗脱完毕后，再用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠23.36g/L)洗脱并收集，得到含rHSA组分。电泳图谱如图3A所示。
2、利用Q Sepharose FF进行阴离子交换层析
将Q Sepharose FF填料约10ml装于Biological15/200层析柱上，用200ml缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，用氢氧化钠或者盐酸调节其pH为7.0)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到7.0左右，并稳定。将实施例1中的提取液pH调至6.8，并用缓冲液稀释直到其电导低于10.0ms，将该样品以300cm/h的流速上到Q Sepharose FF上，用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠5.84g/L)洗脱并收集，得到含rHSA的组分。电泳图谱如图3B所示。
3、Q Sepharose FF的实际载量测试
将Q Sepharose FF填料约5ml装于10/100层析柱上，用200ml缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，用氢氧化钠或者盐酸调节其pH为7.0)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到7.5左右，并稳定。将实施例1中的提取液pH调至7.5，并用缓冲液稀释直到其电导低于10.0ms，总体积1000ml，将该样品以300cm/h的流速上到Q Sepharose FF上，记录上样过程的UV280，直到UV280超过平台期10％为止，记录上样量，计算出300cm/h流速下，每毫升Q Sepharose FF的对提取液实际载量；结束并再生树脂。将实施例1中的提取液的pH调至7.0，并用缓冲液稀释直到其电导低于10.0ms，通过GE 30KD膜包浓缩到400ml，用硫酸-苯酚法测定透析前后的多糖含量，再将该样品上到平衡好的Q Sepharose FF填料中，记录上样过程的UV280，直到UV280超过平台期10％为止，记录上样量，计算出300cm/h流速下，每毫升Q Sepharose FF的对透析后提取液的实际载量。载量变化和提取液中多糖含量的变化如图4所不。
【实施例4】通过阴离子交换层析进行中级纯化
将实施例2中得到的含有rHSA的组分，平均分成两等分，作为料液。
1、利用Q Sepharose FF进行阴离子交换层析
将Q Sepharose FF填料约7ml装于15/200层析柱上，用200ml缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，用氢氧化钠或者盐酸调节其pH为7.0)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到7.0左右，并稳定。将上述其中一份料液的pH调至7.0，并用缓冲液稀释直到其电导低于10.0ms，将该样品以300cm/h的流速上到Q Sepharose FF上，用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠5.84g/L)洗脱杂质，杂质峰洗脱完毕后，再用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠11.68g/L)洗脱并收集，得到含rHSA的组分。电泳图谱如图5A所示。
2、利用DEAE Sepharose FF进行阴离子交换层析
将DEAE Sepharose FF填料约8ml装于Biological15/200层析柱上，用200ml缓冲液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，用氢氧化钠或者盐酸调节其pH为7.0)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH达到7.0左右，并稳定。将上述另一份料液的pH调至7.5，并用缓冲液稀释直到其电导低于10.0ms，将该样品以300cm/h的流速上到DEAE Sepharose FF上，用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠5.84g/L)洗脱杂质，杂质峰洗脱完毕后，再用洗脱液(磷酸二氢钠0.3g/L，磷酸氢二钠3.5g/L，氯化钠11.68g/L)洗脱并收集，得到含rHSA的组分。电泳图谱如图5B所示。
【实施例5】通过疏水层析进行末级纯化
1、利用Phenyl sepharose HP进行疏水层析
将Phenyl sepharose HP填料约8ml装于XK16/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2.32g/L，磷酸二氢钠2.81g/L，硫酸铵66g/L)以流速100cm/h平衡柱子。将上述实施例4(Q Sepharose FF)获得的含有rHRA的洗脱馏分20ml加入硫酸铵(0.4M)，使其电导为80.0ms，以100cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图6A所示。
2、利用Phenyl sepharose FF进行疏水层析
将Phenyl sepharose FF填料约10ml装于XK16/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2.32g/L，磷酸二氢钠2.81g/L，硫酸铵13.2g/L)以流速150cm/h平衡柱子。将上述实施例4(Q Sepharose FF)获得的含有rHRA的洗脱馏分20ml加入硫酸铵(0.1M)，使其电导为80.0ms，以150cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图6B所示。
3、利用MacroPrep-t-Butyl进行疏水层析
将MacroPrep-t-Butyl填料约6ml装于15/200层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2.32g/L，磷酸二氢钠2.81g/L，硫酸铵13.2g/L)以流速150cm/h平衡柱子。将上述实施例3(Q Sepharose FF)获得的含有rHRA的洗脱组分分别加入硫酸铵至1.0、0.8、0.6M，使其电导分别为130.0，90.0，70.0ms，以150cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图6C所示。
【实施例6】从含有rHSA的提取液中分离纯化rHSA
阳离子交换层析作为初级纯化：将UNO Sphere S填料约12ml装于XK16/20层析柱上，用500ml缓冲液(无水醋酸钠2g/L，以醋酸调节至pH 4.5)以流速300cm/h平衡柱子。将实施例1中获得的含有rHSA的溶液样品300ml以600cm/h的流速上柱。样品电导为6.5ms/cm。样品的pH为4.5。上样结束后，用缓冲液(醋酸钠2g/L、醋酸pH 5.0、氯化钠14.61g/L)以200cm/h的流速洗脱样品，收集洗脱液，获得含有rHRA的洗脱液。电泳图谱如图7A所示。
阴离子交换层析作为中级纯化：将Q sepharose FF填料约13ml装于16/100层析柱上，用400ml缓冲液(无水醋酸钠6.51g/L，磷酸二氢钠0.72g/L，调至pH6.8)以流速300cm/h平衡柱子。将上述获得的含有rHRA的洗脱馏分稀释到电导小于10.0ms，约200ml，以300cm/h的流速上柱。样品电导为8.3ms/cm。样品的pH为6.8。上样结束后，用缓冲液(磷酸氢二钠6.51g/L、磷酸二氢钠0.72g/L、氯化钠11.69g/L)以100cm/h的流速洗脱样品，收集洗脱液，获得含有rHRA的洗脱液。电泳图谱如7B所示。
疏水层析作为末级纯化：将Phenyl sepharose填料约12ml装于XK16/100层析柱上，用200ml缓冲液(无水醋酸钠2.32g/L，磷酸二氢钠2.81g/L，硫酸铵66g/L)以流速100cm/h平衡柱子。将上述获得的含有rHRA的洗脱组分加入硫酸铵，使其电导为90ms，以100cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的组分。电泳图谱如图7C所示。HPLC检测结果如图8所示。rHSA的HPLC纯度为99％。
Claims (20)
1.一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括步骤：
1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物I；
2)将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II；
3)将中级产物II经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白目标物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子交换层析的填料选自UNOSphere S、Capto MMC、Nuvia S和MacroPrep-CM。
3.根据权利要求2所述的方法，其中阳离子交换层析的填料为UNO SphereS。
4.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换层析的填料选自QSepharose FF、UNO Sphere Q和DEAE sepharose FF。
5.根据权利要求4所述的方法，其中阴离子交换层析的填料为Q SepharoseFF。
6.根据权利要求1所述的方法，其中疏水层析的填料选自Phenyl sepharoseHP、Phenyl sepharose FF、macro-prep t-butyl 和macro-prep methyl。
7.根据权利要求6所述的方法，其中疏水层析的填料为Phenyl sepharose HP。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组人血清白蛋白粗提取物是通过下述方法制备，包括步骤：
i)将含有重组人血清白蛋白的转基因稻米与提取缓冲液按重量/体积比(kg/l)1∶5混合，在55～60℃下提取1～1.5小时；提取缓冲液包含10～30mM磷酸盐缓冲液、10～20mM醋酸钠、15～30mM硫酸铵与5～20mM辛酸钠，其pH为6.5～8；
ii)将步骤i)的提取混合物的pH调节至4.0～4.5，并沉淀3～12小时；
iii)过滤步骤ii)的混合物，收集滤液，获得含有高浓度重组人血清白蛋白的粗提溶液；所述过滤包括用滤布式板框压滤机压滤，接着用中空纤维膜微滤；所述中空纤维膜为孔径0.20μm～0.45μm的聚醚砜材质中空纤维膜。
9.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子交换层析中使用的上样缓冲液包括醋酸盐缓冲液，其pH小于5.0。
10.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子交换层析中使用的洗脱目标物的缓冲液包括醋酸盐缓冲液和氯化钠，或者磷酸盐缓冲液和氯化钠；缓冲液的pH为5.0～6.7。
11.根据权利要求2所述的方法，其中当阳离子交换层析的填料为UNOSphere S时，使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、0.25M氯化钠，pH5.2。
12.根据权利要求2所述的方法，其中当阳离子交换层析的填料为Nuvia S时，洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液、0.25M氯化钠，pH5.0。
13.根据权利要求2所述的方法，其中当阳离子交换层析的填料为CaptoMMC时，洗脱杂质使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、1M氯化钠，pH4.7；洗脱目标物使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，1M氯化钠，pH6.7。
14.根据权利要求2所述的方法，其中当阳离子交换层析的填料为MacroPrep-CM时，洗脱杂质使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、1M氯化钠，pH4.7；洗脱目标物使用的磷酸盐缓冲液，0.1M氯化钠，pH6.5。
15.根据权利要求4所述的方法，其中当阴离子交换层析的填料为QSepharose FF时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.25M氯化钠。
16.根据权利要求4所述的方法，其中当阴离子交换层析的填料为DEAEsepharose FF时，洗脱杂质使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.1M氯化钠，洗脱目标物使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.25M氯化钠。
17.根据权利要求6所述的方法，其中在疏水层析中，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.1M～1M。
18.根据权利要求6所述的方法，其中当疏水层析的填料为Phenyl sepharoseHP时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.4M。
19.根据权利要求6所述的方法，其中当疏水层析的填料为Phenyl sepharoseFF时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.1M。
20.根据权利要求6所述的方法，其中当疏水层析的填料为MacroPrep-t-Butyl时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0.6～1.0M。
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