CN113735963A - 一种重组人血清白蛋白纯化过程去除色素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人血清蛋白纯化过程去除色素的方法，所述采用脱色树脂结合硼酸填料作为脱色剂，可快速有效的脱除重组人血白蛋白生产中产生的杂质色素，并且不影响蛋白收率和活性，具有广阔的应用前景。

Description

一种重组人血清白蛋白纯化过程去除色素的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更为具体的，本发明涉及一种快速有效的在基因重组白蛋白纯化过程去除色素的方法。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的50％～60％，浓度达38～48g/L，是人体血浆中最主要的蛋白质，维持机体营养与渗透压，在机体中具有重要的生理功能。肝脏每天约合成12g的白蛋白。HSA属于一种单链无糖基化蛋白质，组成为585个氨基酸，分子量是66.5kD，等电点介于4.7～4.9。人血清白蛋白被称为血液里的“黄金救命药”，临床上主要被用于以下适应症：(1)失血创伤、烧伤引起的休克；(2)晚期癌症患者的维持治疗；(3)脑水肿及损伤引起的颅压升高；(4)癌症、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；(5)低蛋白血症的防治；(6)新生儿高胆红素血症；(7)心肺分流术、烧伤或血液透析的辅助治疗、成人呼吸窘迫综合征，是临床急救的一种特殊药品。
在生物医药领域，人血清白蛋白不仅可以作为药物直接经静脉注射使用，而且还可以作为优良的药物载体，延长药物的体内半衰期，实现药物长效，也可以作为疫苗等生物制剂的稳定剂使用，或作为CHO等细胞的培养基使用。但由于人血清白蛋白来源于血液制品，而在我国血液资源相对紧缺，所以人血清白蛋白的价格也比较昂贵。而运用基因技术人工培育人血白蛋白替代传统人血提取办法有效拓宽了人血白蛋白的获取来源。
美国哈佛大学E.J.Cohn教授与其工作小组发明出一种被称为低温乙醇法的工艺，第一次从人血中提纯了人血清白蛋白。目前基因重组人血清白蛋白(rHSA)主要是用甲醇酵母生产的，在其生产过程中产生的杂质有两种：一种是与白蛋白没有直接相互作用的杂质，这些杂质可以使用常规的沉淀、色谱分离等方法去除。另一种是包裹在白蛋白内部或与白蛋白有很强相互作用的小分子，如色素等。色素类杂质一旦输入到人体内，就可能对生命造成威胁。因此，去除色素是达到医药级纯度必须要解决的难题，也是最关键的环节。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供了一种简便的去除rHSA纯化过程中存在的色素的方法，所述方法为经大孔阴离子脱色树脂和硼酸填料结合，高效地进行脱色。
本发明的第一个方面，提供一种用于重组人血清白蛋白纯化过程去除色素的填料组合物，所述填料组合物包括阴离子脱色树脂和硼酸填料，所述阴离子脱色树脂和硼酸填料的组合比例为1-8:1，优选的，所述组合比例为4：1。
本发明的第二个方面，提供一种重组人血清白蛋白纯化过程去除色素的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将含有HSA基因的重组酵母菌株经活化培养得到的种子液进行发酵培养；
(2)发酵结束后，取含有rHSA的发酵液，通过离心去除酵母细胞，得到rHSA浓缩发酵上清液；
(3)将步骤(2)获得的rHSA浓缩发酵上清液过脱色柱，所述脱色柱内的填料为如权利要求1所述的填料组合物。
在一种实施方式中，所述填料组合物与rHSA浓缩发酵上清液的体积比为1:10-1:20，优选的，所述体积比为1：20。
在一种实施方式中，所述步骤(2)包括如下步骤：取含有rHSA的发酵液，通过叠片离心机去除酵母细胞，转速：12000rpm，料液温度：15℃，固含量：20-30％，离心上清液过微滤，泵频25-35HZ；入口压力不超过0.2MPa，透过液过30KD浓缩，浓缩液中加入体积比为40％的酒精、辛酸钠至15mM，68℃加热30min，得到30KD浓缩液。
在一种实施方式中，所述步骤(3)包括如下步骤：阴离子脱色树脂用纯化水浸泡24小时，充分涨溶；硼酸填料以NaCl浓度从低到高的梯度进行洗脱，NaCl浓度梯度设置在0.1M-1M之间，洗脱后以20mMPB、PH7.0磷酸钠缓冲液平衡；将阴离子脱色树脂+硼酸填料，按4:1比例充分混匀，装入填料柱中，将获得的浓缩发酵上清液过脱色柱，阴离子脱色树脂+硼酸填料的组合物与上样液的体积比为1:20。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例中脱色样品的SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1纯化条件的筛选
纯化试剂A选择阴离子脱色树脂(型号：POSITISIL脱色2#)，购于北京英莱克科技发展有限公司。
纯化试剂B选择硼酸填料(Phenyl borate group，以下简称pb填料)，购于上海国药集团沪试AR级(货号10004818)。硼酸填料是一种新型的去糖基化填料，主要用于纯化蛋白质过程中，对于糖基化蛋白质的去除。
实施例2去除色素实验过程
1.将含有HSA基因的重组毕赤酵母菌株经活化培养得到的种子液接种于一级种子罐进行培养；罐中含有YPD培养基(YPD培养基的成分包括葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨，按比例混合即可，或者购买市售品)，一级种子罐的容量可选30L，一般培养12小时，当罐内溶氧开始回升时转入二级种子罐中；
2.二级种子罐中含有YPD培养基，二级种子罐的容量可选300L，培养8小时左右，溶氧开始回升时转入发酵罐；
3.发酵罐中加入有机合成培养基F121.6kg、磷酸18690mL、氢氧化钾2.891kg、甘油28kg，转入发酵液前还加入维生素C和合成p1补充液，合成p1补充液的配方为：硫酸铜2g，碘化钠0.02g，硫酸锰一水1g，钼酸钠二水0.1g，硼酸0.005g，氯化锌5g，硫酸亚铁25g，硫酸5ml，水定容至1L；所述有机合成培养基F1的组分为酵母粉：蛋白胨＝2:1。当发酵液的湿重比(发酵液和菌体的比例)大于26时，进行甲醇诱导。当发酵液的湿重比(发酵液和菌体的比例)≥50，OD≥2.0时停止发酵。发酵总时长约192h；
4.发酵结束后，取含有rHSA的发酵液，通过叠片离心机去除酵母细胞，转速：12000rpm，料液温度：15℃，固含量：20-30％。离心清液过微滤，泵频25-35HZ；入口压力不超过0.2MPa。透过液过30KD浓缩，浓缩液中加入酒精(按照40％的体积比加入)，加入辛酸钠至终浓度15mM，68℃加热30min，得到30KD浓缩液；
5.利用分光光度计对获得的浓缩液杂质含量进行三次平行检测，具体检测结果如下表1：
表1
Figure BDA0003255950300000041
Figure BDA0003255950300000051
备注：不同型号的光度计测量结果有误差
当A350/A280的比值≤0.05，表示溶液中色素和杂质的含量可以忽略，比值越大，色素和杂质的含量越多，而当A450/A280、A500/A280的比值越大，色素和杂质的含量越多。因此由上表可知，发酵浓缩液中含有较多杂质和色素。
6.脱色柱装柱
①阴离子脱色树脂用纯化水浸泡24小时，充分涨溶；
②硼酸填料以NaCl浓度从低到高的梯度进行洗脱，NaCl浓度梯度设置在0.1M-1M之间，洗脱后以20mMPB、PH7.0磷酸钠缓冲液平衡；
③将阴离子脱色树脂+硼酸填料，按1:1,2:1,4:1,8:1比例充分混匀，装入填料柱中(设置两种填料分别单独装柱作为对照)；
④选择步骤③中的优选比例，将前述步骤4获得的浓缩发酵上清液过脱色柱，阴离子脱色树脂+硼酸填料的组合物与上样液的体积比为：1:10-1:20，验证脱色效果和收率。
实施例3脱色结果
1.单独使用阴离子脱色树脂对发酵液的脱色情况，具体如下表2：(流速50ml/min)
表2
Figure BDA0003255950300000052
Figure BDA0003255950300000061
2.单独使用硼酸对发酵液的脱色情况，具体如下表3：(流速50ml/min)
表3
Figure BDA0003255950300000062
如上结果所示，当单独使用阴离子脱色树脂或硼酸作为填料时，对发酵液的脱色效果并不明显。
3.几种阴离子脱色树脂和硼酸的组合填料对发酵液的60min脱色情况，具体如下表4：
表4
Figure BDA0003255950300000063
结果表明，采用阴离子脱色树脂复合硼酸填料可以显著降低发酵液的杂质和色 素。阴离子树脂和硼酸填料的质量比为4:1混合均匀，对发酵液进行预处理，其A350/A280可 降至0.05，A450/A280和A500/A280均为0或低于检测线，各项指标达到要求。
4.不同体积比的上样液与脱色树脂复合硼酸填料(阴离子脱色树脂：硼酸填料＝4:1)在洗脱60min时的脱色情况，具体如下表5：
表5
Figure BDA0003255950300000071
结果可见，上样液与脱色树脂复合硼酸填料体积比为1:20时脱色效果最佳。
5.脱色样品的SDS-PAGE结果如图1所示，从结果来看，上述脱色树脂/硼酸填料对目标蛋白基本不吸附。
6.蛋白收率
①将上样液与脱色树脂复合硼酸填料按1：20的比例混匀后装柱
②用注射用水冲洗脱色柱2个BV
③取200ml纯化后的浓缩液样品上样，取样检测PH及液相，蛋白质收率
检测结果如下：
Figure BDA0003255950300000072
Figure BDA0003255950300000081
结果可见，当脱色树脂/硼酸填料比例为4：1时，蛋白收率相对较高。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种用于重组人血清白蛋白纯化过程去除色素的填料组合物，所述填料组合物包括阴离子脱色树脂和硼酸填料，所述阴离子脱色树脂和硼酸填料的组合比例为1-8:1。
2.一种重组人血清白蛋白纯化过程去除色素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将含有HSA基因的重组酵母菌株经活化培养得到的种子液进行发酵培养；
(2)发酵结束后，取含有rHSA的发酵液，通过离心去除酵母细胞，得到rHSA浓缩发酵上清液；
(3)将步骤(2)获得的rHSA浓缩发酵上清液过脱色柱，所述脱色柱内的填料为如权利要求1所述的填料组合物。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述填料组合物与rHSA浓缩发酵上清液的体积比为1:10-1:20。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述填料组合物中阴离子脱色树脂和硼酸填料的组合比例为4:1。
5.如权利要求3所述的方法，其中,所述填料组合物与rHSA浓缩发酵上清液的体积比为1:20。
6.如权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(2)包括如下步骤：取含有rHSA的发酵液，通过叠片离心机去除酵母细胞，转速：12000rpm，料液温度：15℃，固含量：20-30％，离心上清液过微滤，泵频25-35HZ；入口压力不超过0.2MPa，透过液过30KD浓缩，浓缩液中按体积比为40％的比例加入无水乙醇，加入辛酸钠至终浓度为15mM，68℃加热30min，得到30KD浓缩液。
7.如权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(3)包括如下步骤：
阴离子脱色树脂用纯化水浸泡24小时，充分涨溶；硼酸填料以NaCl浓度从低到高的梯度进行洗脱，NaCl浓度梯度设置在0.1M-1M之间，洗脱后以20mMPB、PH7.0磷酸钠缓冲液平衡；将阴离子脱色树脂+硼酸填料，按4:1比例充分混匀，装入填料柱中，将获得的浓缩发酵上清液过脱色柱，阴离子脱色树脂+硼酸填料的组合物与上样液的体积比为1:20。
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