CN102851265B - 一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法 - Google Patents

一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法，其工艺步骤如下：以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，绞成糜浆，超声波提取，离心，提取液经葡聚糖凝胶Sephadex？G-75层析，冷冻干燥，得到玻璃酸酶纯品。本产品活性达700U/mg以上，收率高达9.2％，产品质量大为改善。该工艺具有产品纯度高、提取收率高、安全无污染、节省时间等特点，适合于工业化生产，符合国际研究开发的潮流。

Description

一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，提供了一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法。
背景技术
1928年，DuranReynals发现了玻璃酸酶并将其称为扩散因子，1940年Chain和Duthie将其命名为透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)。玻璃酸酶为粘多糖的分解酶，能促进皮肤对水分、微量元素、维生素等营养成分的吸收，可增加组织的通透性，从而促使皮下注输液和局部积贮的渗出液或血液的吸收；在生化方面，此酶可用于透明质酸、玻璃酸钠及硫酸软骨素的鉴定等。
目前市场上使用的玻璃酸酶大多是从哺乳动物睾丸中提取的，从牛(羊)睾丸中提取玻璃酸酶通用工艺为：牛睾丸绞成糜浆后，用冰醋酸溶液提取，吊滤得到粗提液，之后用硫酸铵溶液分级盐析，得到精制液，再将其装入透析袋中透析，经磷酸钠、醋酸钙溶液，抽滤，冷冻干燥，得玻璃酸酶精品。该工艺繁琐，质量不稳定，收率低，且碱、盐易对环境造成污染；此外，部分玻璃酸酶的生产应用发酵法，主要工艺为链霉菌发酵、发酵液浓缩、沉淀粗品过色谱柱、分离得精制品、冷冻干燥，得冻干制剂成品，该工艺提取效率相对提高，但有机溶剂的引入使产品质量大打折扣。
玻璃酸酶用途广泛，市场需求量大，国外众多科学家专注于玻璃酸酶的提取，并申请了相关专利。Arat等人于1999年申请专利“透明质酸酶的制备方法”，其采用的技术是将牲畜睾丸制成匀浆，用冰醋酸以重量/体积比为1∶1.5提取，之后采用切向流超滤系统进行纯化分离，选择性膜包为截留分子量从15KD-20KD，最后使用乳酸和活性炭连续吸附杂质，得到纯化玻璃酸酶，所得产品产量有所增加。KulakovaEB等人于2002年申请发明专利“透明质酸酶的制备方法”，其方法是先磨碎睾丸，用醋酸溶液提取，浓缩，浓缩液经活性炭吸附杂质，之后在0.5-1.0摩尔/升氯化钠，2-5％氯仿的溶液中纯化，在2-4％氯化钠溶液中活性炭吸附纯化，得到玻璃酸酶，所得产品产量增加，纯度提高。上述发明专利中所采用的工艺都对玻璃酸酶的产量和纯度有一定提高，但提取步骤较繁琐，杂质去除不彻底，对产品纯度有较大影响。
发明内容
本发明的目的是通过工艺优化，提供一种牛睾丸制取玻璃酸酶的方法，以克服现有工艺提取步骤繁琐、时间长、收率低等问题。
1.本发明提供的一种牛睾丸制取玻璃酸酶的方法，包括以下步骤：
1)牛睾丸预处理
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；
2)超声波提取
将浓度为5～8％的NaCl提取液装入超声提取仪的容器内，加入牛睾丸糜浆，使牛睾丸与提取液比例为1∶8～1∶12，调节pH为4～5.5，温度为30～35℃，超声波强度为30～45W下提取30～40min，提取的玻璃酸酶的比活可达285.3U/mg；
3)离心
超声波处理后的提取液在3000r/min下离心15～20min，除去杂质，取上清液；
4)葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶SephadexG-75溶胀后装柱，从层析柱顶部加入玻璃酸酶清液，洗脱，控制洗脱温度为25～30℃，洗脱流速为25～40mL/h，洗脱时间为4～5h后，可有效去除杂质；
5)冷冻干燥
层析液经冷冻干燥，得到玻璃酸酶成品，纯度达到99.5％。
2.本发明提供的上述以牛睾丸制取玻璃酸酶的工艺，其特点在于：
1)超声波提取
超声波在生物活性物质的提取方面广泛应用，主要是利用超声波在溶液中产生的空穴效应作用，利用超声波提取具有提取时间短，原料提取充分，提取效率高的特点。本发明采用超声波提取玻璃酸酶，酶比活可达270U/mg以上，与通用提取方法相比，产品活性和产量明显提高。
2)葡聚糖凝胶过滤层析纯化
凝胶层析(gelchromatography)又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等，它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。本发明采用葡聚糖凝胶SephadexG-75纯化玻璃酸酶，有效去除杂质，可得到纯度达99.5％的产品。
本发明以新鲜牛睾丸为原料，采用清洁生产工艺，所得玻璃酸酶纯度高(≥700U/mg)、提取收率高(≥9.2％)、安全无污染、节省时间，适合于工业化生产，符合国际研究开发的潮流。
具体实施方式
提出以下实例来具体说明，以更好地理解本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；加入浓度为6％的NaCl提取液，牛睾丸与提取液比例为1∶10，调节pH为4.5，温度为35℃，40W超声波强度下提取40min，玻璃酸酶比活达283U/mg；提取液在3000r/min下离心15min，除去杂质；葡聚糖凝胶溶胀后装柱，去离子水洗脱，洗脱温度30℃，洗脱流速25mL/h，洗脱5h；层析液经冷冻干燥，得到成品。玻璃酸酶产品活性874.3U/mg，收率9.28％。
实施例2
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；加入浓度为7％的NaCl提取液，牛睾丸与提取液比例为1∶11，调节pH为4.5，温度为35℃，40W超声波强度下提取40min，玻璃酸酶比活达279.3U/mg；提取液在3000r/min下离心15min，除去杂质；葡聚糖凝胶溶胀后装柱，去离子水洗脱，洗脱温度30℃，洗脱流速25mL/h，洗脱5h；层析液经冷冻干燥，得到成品。玻璃酸酶产品活性869U/mg，收率9.25％。
实施例3
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；加入浓度为6％的NaCl提取液，牛睾丸与提取液比例为1∶10，调节pH为4.5，温度为35℃，45W超声波强度下提取40min，玻璃酸酶比活达286.8U/mg；提取液在3000r/min下离心15min，除去杂质；葡聚糖凝胶溶胀后装柱，去离子水洗脱，洗脱温度30℃，洗脱流速25mL/h，洗脱5h；层析液经冷冻干燥，得到成品。玻璃酸酶产品活性892.1U/mg，收率9.31％。
实施例4
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；加入浓度为6％的NaCl提取液，牛睾丸与提取液比例为1∶10，调节pH为4.5，温度为35℃，45W超声波强度下提取40min，玻璃酸酶比活达282.5U/mg；提取液在3000r/min下离心20min，除去杂质；葡聚糖凝胶溶胀后装柱，去离子水洗脱，洗脱温度30℃，洗脱流速30mL/h，洗脱5h；层析液经冷冻干燥，得到成品。玻璃酸酶产品活性913U/mg，收率9.35％。
实施例5
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；加入浓度为6％的NaCl提取液，牛睾丸与提取液比例为1∶10，调节pH为4.5，温度为35℃，45W超声波强度下提取40min，玻璃酸酶比活达283U/mg；提取液在3000r/min下离心20min，除去杂质；葡聚糖凝胶溶胀后装柱，去离子水洗脱，洗脱温度30℃，洗脱流速35mL/h，洗脱5h；层析液经冷冻干燥，得到成品。玻璃酸酶产品活性895U/mg，收率9.32％。
实施例6
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；加入浓度为7％的NaCl提取液，牛睾丸与提取液比例为1∶12，调节pH为5，温度为35℃，45W超声波强度下提取40min，玻璃酸酶比活达295.7U/mg；提取液在3000r/min下离心20min，除去杂质；葡聚糖凝胶溶胀后装柱，去离子水洗脱，洗脱温度30℃，洗脱流速35mL/h，洗脱5h；层析液经冷冻干燥，得到成品。玻璃酸酶产品活性936U/mg，收率9.38％。

Claims (1)

1.一种牛睾丸制取玻璃酸酶的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)牛睾丸预处理
以新鲜牛睾丸为原料，除去内外副睾，蒸馏水洗净，绞成糜浆；
2)超声波提取
将浓度为5～8％的NaCl提取液装入超声提取仪的容器内，加入牛睾丸糜浆，使牛睾丸与提取液比例为1∶8～1∶12，调节pH为4～5.5，温度为30～35℃，超声波强度为30～45W下提取30～40min；
3)离心
超声波处理后的提取液在3000r/min下离心15～20min，除去杂质，取上清液；
4)葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶溶胀后装柱，从层析柱顶部加入玻璃酸酶清液，洗脱，控制洗脱温度为25～30℃，洗脱流速为25～40mL/h，洗脱时间为4～5h后，可有效去除杂质；
5)冷冻干燥
层析液经冷冻干燥，得到玻璃酸酶成品；
其中，步骤4)所述的葡聚糖凝胶为SephadexG-75；步骤4)所述的洗脱液为去离子水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103170B (zh) * 2013-02-06 2014-10-15 甘肃天森药业有限公司 牛或羊玻璃酸酶的生产方法
CN104419689B (zh) * 2013-08-22 2019-11-15 上海亨臻实业有限公司 玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法
CN103789288A (zh) * 2014-01-20 2014-05-14 江苏集贤绿色化学科技研究院有限公司 一种盐解法提取分离玻璃酸酶的方法
CN104531634A (zh) * 2014-12-23 2015-04-22 青岛康原药业有限公司 一种提取玻璃酸酶精品的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1058614A (zh) * 1991-09-02 1992-02-12 北京农业大学 利用芽孢杆菌生产超氧化物岐化酶的方法
CN101597344A (zh) * 2009-05-07 2009-12-09 张丽萍 一种肝素的提取、分离、纯化方法
CN101633931A (zh) * 2008-07-25 2010-01-27 山东省生物药物研究院 一种透明质酸酶表达载体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1058614A (zh) * 1991-09-02 1992-02-12 北京农业大学 利用芽孢杆菌生产超氧化物岐化酶的方法
CN101633931A (zh) * 2008-07-25 2010-01-27 山东省生物药物研究院 一种透明质酸酶表达载体及其应用
CN101597344A (zh) * 2009-05-07 2009-12-09 张丽萍 一种肝素的提取、分离、纯化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中国黑白花优良种公牛精子透明质酸酶的分离纯化及部分性质研究;杨国玲;《兰州大学学报（自然科学版）》;19921231;第117页表1 *
牛睾丸中透明质酸酶的提取及其临床应用;宋怡;《中国生物制品学杂志》;20100831;第860页第1节 *
透明质酸酶;钟读波等;《食品与药品》;20071231;74-76 *
透明质酸酶提取工艺的研究;王彦等;《黑龙江医药》;20021231;5-6 *

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