CN1058614A - 利用芽孢杆菌生产超氧化物岐化酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及超氧化物歧化酶(SOD)的一种新菌 种及生产工艺。本发明利用芽孢杆菌(Bacillus)菌体 生产SOD,其精制SOD含量高达0.278毫克/克生 物量,比国际上八十年代末利用微生物生产SOD的 原料含量高2.6—8.9倍。本发明包括SOD高含量 菌株筛选、发酵、菌细胞离析破碎、粗酶生产和精制酶 层析生产工艺。用本发明可以同时生产出Cu、 Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种SOD,且 SOD活性高。

Description

本发明涉及生产超氧化物歧化酶(SOD)的新菌种筛选和生产工艺。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)据其所含金属辅基的不同分为Cu、Zn-SOD,Mn-SOD和Fe-SOD三种,它们都具有相同的催化功能。在动物、植物和微生物体内都含有SOD。生物体在某些病理情况下衰老或遭受逆境胁迫等,能产生过量的并具有毒性更强的超氧物阴离子自由基(
Figure 911085491_IMG1
),因
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不能被及时清除而进一步衍生成毒性羟自由基(·OH)等氧自由基。
Figure 911085491_IMG3
等自由基具有极强的氧化能力,在生物体内能引起生物分子激烈的连锁自发氧化,造成脂质过氧化而破坏膜系统,使核酸断裂,氨基酸分解、酶蛋白变性失活,蛋白质发生分解或聚合,生物体内一系列生理代谢和生化反应遭受干扰。
SOD是生物体内清除过量
Figure 911085491_IMG4
的最重要的酶,其催化 歧化反应速率比自发反应速率快1010倍,将
Figure 911085491_IMG6
歧化成H2O2和O2,再经过氧化氢酶等酶的作用将H2O2转化为H2O和O2,防御
Figure 911085491_IMG7
对生物分子的破坏作用,维护细胞正常的生理代谢和生化反应。
自1969年美国McCord和Fridovich从牛红细胞中发现了SOD,并鉴定能歧化 ,保护生物分子免遭氧化降解的作用以来,有关SOD的分子生物学方面的研究一直成为生物学领域的前沿课题,受到各国科学工作者的重视,认为这一创造性的研究工作可以与1953年Watson和Crick发表了有名的DNA双螺旋结构学说所引起的结果相比拟。
特别是在近几年来对SOD的应用研究引起了国际上的重大关注。SOD作为治疗酶在临床应用上的成功给医学和分子药理学带来了新进展,能广泛用于治疗因O- 2及其衍生物氧自由基引起的各种较为难治的疾病具有特殊疗效。对自身免疫性疾病、回肠结肠炎、类风湿关节炎、皮肌炎,以及肺炎等炎症有很好疗效。对治疗膀胱癌、前列腺癌等多种癌症,以及癌症化疗引起骨髓损伤和白血球减少的恢复效果很好。对抗辐射损伤有特效。SOD在人类防衰老上有特殊作用,SOD可用于生产保健饮料和保护皮肤健美的日用化妆品。在农作物生产中,应用SOD可增强作物抗病、抗寒、抗旱、抗高温、抗过氧化等抗逆能力和延缓衰老,显著提高作物品质和产量。
SOD在医药、人类保健、饮料生产、日用化工和作物生产上具有广泛的应用前景,但从发现SOD近二十多年来国内外生产SOD至今未取得大的突破。该方面的现有技术存在以下问题。
1、生产SOD的原料
自1969年美国学者McCord和Fridovich从牛红细胞中发现SOD并鉴定其催化功能[见McCord,J.M.Fridovich,J.Biol.Chem.,1969,244,6049.]以来,随着SOD作为治疗酶在临床上广泛成功地应用,对SOD的需求量日益增大。在七十年代初,美国Bannister最初利用牛血为原料生产SOD[见Bannister,J.V.,et  al,Eur.J.Biochem.,18(1971),178.],直至八十年代至现在国际上主要用牛血生产SOD,[见Gartner,A.et  al;Biochem,J.,221(1984),549.]大约100公斤牛血(14头牛)能生产1克SOD。由于牛血来源有限,开始研究试图利用人血和其他动物血液及动物肝脏等组织生产SOD,但均未正式投入生产[见Marklund,S.L.,Proc.Natl.Acod.Sci.USA,79(1982)和Rocha,H.A.,et  al;Eur,J.Biochem.,145(1984),477]。牛血等动物血及组织和人血因价格昂贵和来源有限,国际上一些学者同时转向利用植物生产SOD。
七十年代日本学者Sawada等和美国学者Beauchamp等最初分别研究了菠菜叶和麦胚等植物的SOD[见Sawada,Y.,et  al;Biochem.Biophys  Acta,268(1972),305.和Beauchamp,C.O.et  al;Biochem.Biophys.Acta,317(1973),50]。直到1986年日本Hagiwara利用稻叶为原料生产SOD,因生产原料不便于工业化生产和处理原料麻烦,未能实现工业化生产[见Japan,154549,82,09.07.]。
国际上一些学者在研究利用动物血和植物生产SOD的同时,也致力于研究利用微生物生产SOD。开展这方面工作最早的应首推美国Weser,他研究酿酒酵母生产SOD[见Weser,V.,et  al,Physiol.Chem,353(1972),1821]。以后各国一些学者相继研究了大肠杆菌(E.Coli)、链球菌(S.mutans)、织线藻(P.boryanum)和螺旋藻(S.platensis)等多种微生物的SOD。而最早用于工业化生产是日本的Takeda化学工业公司在1980年利用沙雷铁氏菌属(Serratia)的菌株生产Mn-SOD[见Japan,105645,80.07.30],但热稳定性差,37℃仅稳定60分钟。以后日本相继报道了利用葡萄糖细菌(Gluconobacter  cerinus)和啤酒酵母(Nacardiopsis)生产热稳定Mn-SOD。但未获得高含量的菌株[分别见Japan,274299,84.12.28.和Japan,219166,85.10.03]。
1990年日本Idemitsu石油化工有限公司使用螺旋藻(S.subsalsa)生产SOD,但SOD含量太低,仅347U/g干重[见Japan.0269181,90.03.07]。
1987年苏联Lengd化学制药工业公司用深红酵母(Rhodcforula  rubra)生产SOD。工艺流程复杂,且产量也较低(0.032mg/g生物量)[见SU,213365,87.03.18]。1988年德国Veb  Berlin-kosmetik也报道了利用酵母提取Cn、Zn-SOD,但所用酵母的SOD含量不高,工业生产不经济[见DD,312216,88.03.13]。
2、生产SOD的工艺
目前国际上生产SOD主要是利用牛血为原料,提取SOD一直是采用McCord等创立的方法和工艺流程[见McCord,J.M.etal;J.Biol.Chem.,244(1969),6049],该方法的一个最大的问题是除去溶血中的血红蛋白的技术不易掌握[见Gartner,A;etal,Biochem.J.,221(1984),549]。若采用Tsuchihashi改良的方法,因在溶血液中加入乙醇和氯仿等有机试剂多,增大成本[见Tsuc-hihashi,M.,Biochem.Z.,140(1972)1140.]。并且Hartz等认为该种方法损伤了SOD,造成酶结构改变和酶的辅基铜丧失达8%,影响酶活性。其次是该方法需用磷酸氢二钾量极大,造成经济成本增大[见Hartz,J.W.etal,J.Biol.Chem.,244(1969),4565.]。
若采用植物提取SOD,因其含量低,加之种植植物不利于工业化生产,而且处理原料困难,粗酶液制备透析工作量大、消耗化学试剂多,也未能正式工业化生产。利用微生物发酵法生产SOD,现利用的原料包括酵母,大肠杆菌、链球菌螺旋藻和织线藻等,这些原料都因缺乏高含量菌株经济效益不高,而且藻类培养还需照明等条件。特别是提取的SOD热稳定性差,有的需进行修饰才能供医疗用,有的需通过转螯金属离子造成程序复杂。
本项发明的目的是:开辟一种来源广泛、价格低廉、SOD含量高的生产SOD的新原料,并提供一种相应的便于工业化生产的新方法。
本发明开辟的生产SOD的新原料是芽孢杆菌(Bacillus  Cereus),也可以利用其中的一种,如“作物增产菌”(一种芽孢杆菌;保存于CGMCC,保藏号为0137,保藏日期为1988年9月20日)。经11年的菌种筛选,获得的芽孢杆菌菌株-,精制SOD含量高达0.278mg/g生物量,比国际上八十年代末利用微生物生产SOD的原料含量高2.6-8.9倍。与SOD粗酶制剂相比较,要高10-50倍。筛选的该菌株并富含Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种SOD,其中Cu.Zn-SOD为SOD总量的21%,Mn-SOD为52%,Fe-SOD为27%。
本发明创立的SOD综合层析生产工艺流程不仅能为医药、兽药、饮料、日用化工和作物生产,分别提供SOD粗制剂和精制剂,而且通过该流程能生产三种SOD。
利用芽孢杆菌生产SOD新方法其特征在于本法包括以下过程:高SOD含量菌株筛选、发酵、菌细胞离析破碎、粗酶生产工艺和精制酶层析生产工艺。
(一)、高SOD含量菌株筛选
1、分离
图1是高SOD含量的芽孢杆菌的分离筛选示意图,根据不同的需要或不同用途首先从人、动物、植物体表用30-50ml灭菌水淋洗,或取动物、植物组织,土壤1-10g经研磨转入放有40ml灭菌水的三角瓶中按200-300rpm/min振荡10分钟,静置半分钟后以上清液作为菌源水。用灭菌吸管吸取菌源水25ml注入灭菌试管;将试管置80℃水中处理10分钟,用接种环醮菌液在牛肉汁蛋白胨培养基(蛋白胨5g,牛肉汁3g、氯化钠5g、琼脂粉15g、配1000ml水)平板上划线,置28-35℃下培养24小时,仔细选取不同菌落,进行涂片、染色镜检,为蜡质芽孢杆菌的,转移到上述培养基斜面上编号以待酶活力测定。
2、上清液的制备
将菌株接种于装有150ml-250ml液体牛肉汁蛋白胨培养基的灭菌三角瓶中(培养基成份以上述成份不含琼脂粉),在27-34℃下摇床振荡培养24-30小时。采用4000rpm/min、4℃离心20分钟,收集菌细胞2克以上,用0.9%NaCl溶液洗涤3次,对菌糊称重后用50mmol/L、pH7.8磷酸钠缓冲液(内含2mmol/L  EDTA、2mmol/L巯基乙醇)按菌∶液为1∶1-2比例加入,搅拌成悬浮液,按每克菌加入0.05mg溶菌酶在冰浴上处理30分钟,并轻轻搅拌,用100w功率超声波发生器于冰浴上超声处理共10分钟,每次处理1分钟间隔1分钟。4000rpm/min,4℃离心20分钟,取上清液(粗酶液)供测SOD活性。
3.酶活力测定
采用本发明改进的高灵敏度的氯化硝基氮蓝四唑(NBT)光还原测定SOD活力是最经济、最简便易行的适于大量菌株筛选的方法。
SOD活力测定方法:在3ml0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液反应液中(内含有2.7ml 13×10-3mol/L的Met、0.1ml 75×10-6mol/L的NBT、0.1ml 100×10-9mol/L的EDTA、0.1ml2×10-6mol/L的VB2)加入5-30μl粗酶液后在30℃、4000lux光照条件下经30分钟,在560nm下测定光密度,以缓冲液代替酶液作空白测定酶活性(酶活性单位采用抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位)。
经SOD活力测定筛选出酶活性最高的菌株,进行中试,SOD含量高,在50℃和pH4-9条件下酶活力稳定,即可用于生产。
3、菌种培养、换代、保藏:
将菌种划线接种于牛肉蛋白胨培养基(蛋白胨5g,牛肉汁3g、NaCl5g,琼脂粉15g,配1000ml水)斜面,4℃(短期)或-10℃(长期)冰箱或冷库保存,用划线法定期转管传代。
4、芽孢杆菌生物学特性:
芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌体直杆状、成链、光镜下长2.5-3.5μm,宽1μm,革兰氏反应阴性,芽孢椭圆或柱状,中长,孢囊不膨大,原生质内含有不着色颗粒。琼脂平板培养,菌落圆形,直径0.2cm,边缘整齐,稍隆起,无光泽,不透明,蜡质;液体培养,形成菌膜。生长温度15-45℃,置27-32℃,适宜pH6.0-7.5。适宜碳源麦芽糖、蔗糖。适宜氮源为蛋白胨,无机氮源为NH+ 4,发酵葡萄糖、麦芽糖产酸,木糖、乳糖、甘露琼不产酸,水解淀粉,利用柠檬酸盐,还原硝酸盐成亚硝酸盐,7%NaCl中生长,pH5.7生长,V.P阳性,V.P液培养后pH4.56。能厌氧生长,接触酶阳性,碳水化合物产气阴性,不产生吲哚,苯丙氨酸脱氨阴性。
(二)、发酵
图2是芽孢杆菌生产SOD的发酵工艺流程示意图,主要包括菌种活化、种子罐发酵及发酵罐培养。
1、菌种活化
将高SOD含量的芽孢杆菌(Bacillus  cereus)原菌种划线接种于上述固体牛肉胨斜面培养基,接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟,接种后在28-32℃条件下培养30-48小时,然后配成孢子液,用于种子罐接种。
2、种子罐发酵
将种子罐灭菌后,装入培养液再次灭菌,冷却至30℃时,将孢子液接入培养液中,然后通入无菌空气培养,即得种子罐发酵菌液。
3、发酵罐培养
将发酵罐先灭菌,在装入培养液后灭菌,然后保压降温至25-30℃,按1-2%的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐培养液中培养,然后放罐供菌细胞离析。
4、灭菌及培养条件
上述灭菌采用高压蒸气灭菌,即在121℃、压力0.3-0.5Kg/cm2条件下,灭菌30分钟,种子罐、发酵罐培养液灭菌搅拌速度230-250rpm/min,种子罐接种后,在28-35℃条件下培养8-10小时。发酵罐接种后,在28-35℃条件下培养18-30小时。通气量1-2Vols/Vol/min,氧气含量30-40%。
种子罐配方为:蛋白胨0.4-0.6%,牛肉汁0.3-0.4%,NaCl0.4-0.6%,豆油0.2-0.4%,葡萄糖0.2-0.4%,pH值消毒前7.5,消毒后7.0-7.4。
发酵罐配方为:牛肉汁0.3-0.5%,蛋白胨0.4-0.6%,NaCl0.4-0.6%,豆油0.3-0.5%,葡萄糖0.1-0.3%,淀粉0.3-0.5%,硫酸镁0.05-0.1%,磷酸二氢钾0.03-0.04%,碳酸钙0.3-0.5%,500-1000μM的Cu、Zn、Mn、Fe,搅拌,pH值消毒前7.5-7.8,消毒后7.0-7.4。
5、发酵液要求:
发酵菌液含菌量在每毫升45亿以上,芽孢成熟前放罐。pH值7.3-7.9。无杂菌污染。
(三)、菌细胞离析破碎
图3是芽孢杆菌细胞SOD粗提液工艺流程示意图,主要包括细胞离析,细胞破碎等工艺。
1、菌细胞离析
发酵罐菌液在控制流量200-400L/h注入离心机,离心机以4000-5000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀,以菌糊自动流出,进入生理盐水槽,经三次洗涤,离心后收集菌糊。
2、菌细胞破碎
按菌糊与缓冲液以1∶1-2体积比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液,搅拌成菌液,按每升菌糊加入50mg溶菌酶,在0-4℃低温条件下搅拌30分钟。用250W功率超声波细胞粉碎机在0-5℃低温条件下对菌液处理10分钟,每处理1分钟间隔1分钟。超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况。然后将菌液以4000-5000rpm/min离心收集上清液作为SOD的粗提液。同时对粗提液方法进行SOD活性测定和蛋白浓度测定,计算SOD比活(U/mg)。
(四)、粗酶生产工艺
图4是芽孢杆菌SOD粗酶制剂生产工艺流程示意图,由55%硫酸沉淀、75%硫酸沉淀及Sephadex  G-75柱层析三步工艺组成。
1、55%硫酸铵沉淀
将粗提液加入硫酸铵,使粗提液中硫酸铵达到55%饱和度。在22-28℃下利用搅拌器搅拌90分钟,并静置2-12小时。以10000×g离心30分钟,分离出上清液,或采用膜过滤系统过滤得到滤液。
2、75%硫酸铵沉淀
在55%硫酸铵沉淀后的上清液或滤液中,加入硫酸铵使其饱和度达到75%,在室温下利用搅拌器搅拌90分钟。以10000Xg离心30分钟,或采用过滤系统过滤。将沉淀溶于最小量的5m  mol/L、pH7.8磷酸钾缓冲液中(内含2m  mol/L  EDTA),然后用上述缓冲液和透析袋(分子量8000)进行动态透析,除去硫酸铵。透析时间24-48小时。
3、SephadexG-75柱层析
用Sephadex  G-75柱,预先用pH7.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex  G-75柱,将透析后的粗酶提取液加入到柱中,并用上述缓冲液洗脱。采用全自动分步收集系统收集洗脱液,通过检测SOD活力,合并SOD活力高的收集液部分。对合并液检测SOD活力和蛋白浓度;同时采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳检测SOD纯度。
4、粗酶制剂质量要求
粗酶提取液经Sephadex  G-75层析收集的SOD高活力峰液,要求SOD比活达600以上,产率达50%以上。电泳检测主要呈现SOD蛋白带。
5、粗酶制剂产品
经Sephadex  G-75柱层析后的SOD酶液为粗酶制剂以液体制剂为产品,或通过冷冻干燥以粉末晶体制剂为产品。
(五)、精制酶层析生产工艺
图5是芽孢杆菌精制SOD制剂生产工艺流程示意图,包括DE-52柱层析和不同种类SOD制剂的层析工艺。
1、DE-52柱层析
将经Sephadex  G-75柱层析后的粗酶液通过预先用pH7.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱,用上述缓冲液洗脱至洗脱液中蛋白吸收(280nm)光密值低于0.05以下,并用0.005-0.3mol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱,并同时开始收集,经SOD活力检测,将酶活力高的收集液合并,检测SOD活力和蛋白浓度,并进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳,检测SOD纯度。
2、精制酶质量要求
经DE-52柱层析后收集的酶液,其SOD纯度要求达到电泳纯,SOD比活达3000以上。
3、不同种类SOD的层析工艺
(1)Cu、Zn-SOD的层析工艺:按前述层析生产工艺生产的SOD为Cu、Zn-SOD。
(2)Mn-SOD的层析工艺:
将上述经DE-52柱梯度洗脱前的洗脱液收集后,加热到65℃,5分钟后置于低温下迅速冷却,后又迅速加热,依此重复3次。以10000×g离心分离出上清液,或通过加压过滤分离出滤液。将上清液或滤液用聚乙二醇浓缩。
将浓缩液通过用pH5.5、40m  mol/L的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱,并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱,同时进行收集,将酶活性高的收集液合并一起,检测SOD活力,采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳进行Mn-SOD纯度鉴定,得到纯Mn-SOD精酶制剂。
(3)Fe-SOD的层析工艺
将经75%饱和度的硫酸铵沉淀、并已透析的粗酶液通过预先用pH5.5、0.01mol/L醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱,以上述缓冲液洗脱,收集酶活力高的洗脱液,用pH7.8、50m  mol/L磷酸钾缓冲液透析。将透析液通过预先用pH2.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱,用同样缓冲液洗柱,并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱,将符合纯Fe-SOD标准的酶活力高的收集液合并,进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳,检查Fe-SOD纯度。将符合纯酶标准的收集液混合,加硫酸铵使达到80%饱和度,再经离心或过滤得到的沉淀为纯Fe-SOD,将沉淀用pH7.8、50mmol/L磷酸钾缓冲液透析,后经浓缩或通过加压过滤为Fe-SOD精酶液。
4、精制酶层析生产过程要求在4℃条件下进行。对生产的产品作SOD电泳图谱、原子吸收光谱、紫外和可见光吸收光谱能达到均一性的高活性纯SOD。比活在3000u/mg以上。经最后层析得到的各种纯SOD采用水透析、抽真空冷冻,干燥,即得纯SOD晶体粉末产品。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
(1)菌株SOD含量高:精制SOD含量高达0.278mg/g生物量,比国际上八十年代末利用微生物生产SOD的原料含量高2.6-8.9倍。与SOD粗酶制剂相比较,要高10-50倍。
(2)筛选的该菌株并富含Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种SOD,其中Cu.Zn-SOD为SOD总量的21%,Mn-SOD为52%,Fe-SOD为27%。
(3)本发明创立的SOD综合层析生产工艺先进,不仅能为医药、兽药、饮料、日用化工和作物生产,分别提供SOD粗制剂和精制剂,而且通过该流程能生产三种SOD。
(4)由于原料来源容易、低廉,便于工业化生产。
下面是本发明的实施例:用100公斤芽孢杆菌菌糊生产5.7克SOD。
1、从植物体组织中筛选出SOD含量达0.27mg/g的芽孢杆菌株。
2、用15吨发酵罐生产发酵菌液14吨。将发酵罐先灭菌,装入培养液后再灭菌。
灭菌采用高压蒸气灭菌,即在121℃、压力0.5Kg/cm2条件下,灭菌30分钟,发酵罐培养液灭菌搅拌速度250rpm/min。然后降温至28℃f,按2%的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐。发酵罐接种后,在32℃条件下培养24小时。通气量2Vols/Vol/min,氧气含量40%。
发酵罐培养液配方为:牛肉汁0.5%,蛋白胨0.5%,NaCl0.5%,豆油0.5%,葡萄糖0.2%,淀粉0.4%,硫酸镁0.08%,磷酸二氢钾0.04%,碳酸钙0.5%,800μM的Cu、Zn、Mn、Fe,搅拌。pH值消毒前7.6,消毒后7.4。
发酵菌液含菌量在每毫升50亿以上,芽孢成熟前放罐,pH为值7.5,无杂菌污染。
3、将菌细胞离析。发酵罐菌液在控制流量400L/h注入离心机,离心机以4000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀以菌糊自动流出,进入生理盐水槽,经三次洗涤,离心后收集到100公斤菌糊。
4、将菌细胞破碎。按菌糊与缓冲液以1∶1.5体积比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液,搅拌成菌液。按每升菌糊加入50mg溶菌酶,在4℃低温条件下搅拌30分钟。用250W功率超声波细胞粉碎机在2℃低温条件下对菌液处理10分钟,每处理1分钟间隔1分钟。超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况。然后将菌液以4000rpm/min离心。收集到115kg上清液作为SOD的粗提液。
5、提取粗酶。
(1)55%硫酸铵沉淀。将粗提液加入硫酸铵,使粗提液中硫酸铵达到55%饱和度。在22℃下利用搅拌器搅拌90分钟,并静置2小时,采用膜过滤系统过滤得到滤液。
(2)75%硫酸铵沉淀。在55%硫酸铵沉淀后的滤液中,加入硫酸铵使其饱和度达到75%,在室温下利用搅拌器搅拌90分钟,采用过滤系统过滤,将过滤物溶于最小量的5m  mol/L、pH7.8磷酸钾缓冲液中(内含2mmol/L  EDTA),然后用上述缓冲液和透析袋(分子量8000)进行动态透析,除去硫酸铵。透析时间40小时,得到108kg粗酶提取液。
(3)SephadexG-75柱层析。用Sephadex  G-75柱,预先用pH7.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex  G-75柱,将透析后的粗酶提取液72kg加入到柱中,并用上述缓冲液洗脱。采用全自动分步收集系统收集洗脱液,合并SOD活力高的收集液部分。
6、SOD精制酶的制备
(1)DE-52柱层析
将经Sephadex  G-75柱层析后的粗酶液通过预先用pH7.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱,用上述缓冲液洗脱,将酶活力高的收集液合并,得到Cu.Zn-SOD纯酶液。
7、不同种类SOD的精制酶的制备
(1)Cu、Zn-SOD:将CU.Zn-SOD纯酶液浓缩、冷冻干燥可得到Cu.Zn-SOD纯酶粉剂1.45kg。
(2)Mn-SOD:将上述经DE-52柱梯度洗脱前的洗脱液收集,加热到65℃,5分钟后置于低温下迅速冷却,后又迅速加热,依此重复3次,通过加压过滤分离出滤液,将滤液浓缩。
将浓缩液通过用pH5.5、40m  mol/L的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱,并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱,同时进行收集,将酶活性高的收集液合并一起,得到Mn-SOD纯酶液,再经浓缩、冷冻干燥得到Mn-SOD纯酶粉<3.5克。
(3)Fe-SOD:将经75%饱和度的硫酸铵沉淀、并已透析的粗酶液36kg通过预先用pH5.5、0.01mol/L醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱,以上述缓冲液洗脱,收集酶活力高的洗脱液,用pH7.8、50m  mol/L磷酸钾缓冲液透析。将透析液通过预先用pH2.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱,用同样缓冲液洗柱,并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱,将符合纯Fe-SOD标准的酶活力高的收集液合并,将符合纯酶标准的收集液混合,加硫酸铵使达到80%饱和度,再经过滤得到的为纯Fe-SOD,将过滤物用pH7.8、50mmol/L磷酸钾缓冲液透析,通过加压过滤得到Fe-SOD纯酶液,再经浓缩、冷冻干燥得到Fe-SOD纯酶粉剂0.75克。
共获得SOF纯酶粉剂5.7克。

Claims (6)

1、一种利用芽孢杆菌生产超氧化物歧化酶(SOD)的方法,特征在于本法包括:
(1)SOD高含量菌株筛选
(2)发酵
(3)菌细胞离析破碎
(4)粗酶生产工艺和精制酶层析生产工艺。
2、根据权利要求1所述的SOD生产方法,其特征在于所述的SOD高含量芽孢杆菌的筛选按以下步骤进行:
(1)分离:根据不同的用途或需要,从人、动物、植物体表用30-50ml灭菌水淋洗,或取动物、植物组织,土壤1-10g经研磨转入放有40ml灭菌水的三角瓶中按200-300rpm/min振荡10分钟,静置半分钟后以上清液作为菌源水,用灭菌吸管吸取菌源水25ml注入灭菌试管,将试管置80℃水中处理10分钟,用接种环醮菌液在牛肉汁蛋白胨培养基(蛋白胨5g,牛肉汁3g、氯化钠5g、琼脂粉15g、配1000ml水)平板上划线,置28-35℃下培养24小时,仔细选取不同菌落,进行涂片、染色镜检,为芽孢杆菌的,转移到牛肉蛋白胨培养基斜面上编号以待酶活力测定;
(2)上清液制备:将菌株接种于装有150ml-250ml液体牛肉汁蛋白胨培养基的灭菌三角瓶中(培养基成份以上述成份不含琼脂粉),在27-34℃下摇床振荡培养24-30小时,采用4000rpm/min、4℃离心20分钟,收集菌细胞2克以上,用0.9%NaCl溶液洗涤3次,对菌糊称重后用5mmol/L、pH7.8磷酸钠缓冲液(内含2mmol/LEDTA、2mmol/L巯基乙醇)按菌∶液为1∶1-2比例加入,搅拌成悬浮液,按每克菌加入0.05mg溶菌酶,在冰浴上处理30分钟,并轻轻搅拌,用100w功率超声波发生器于冰浴上超声处理共10分钟,每次处理1分钟间隔1分钟,4000rpm/min,4℃离心20分钟,取上清液供测SOD活性;
(3)酶活力测定:本发明采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮蓝四唑(NBT)光还原法测定SOD活力,即在3ml0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液反应液中(内含有2.7ml 13×10-3mol/L的Met、0.1ml 75×10-6mol/L的NBT、0.1ml 100×10-9mol/L的EDTA、0.1ml2×10-6mol/L的VB2)加入5-30μl酶液,在30℃、4000lux光照条件下处理30分钟,在580nm下测定光密度,以缓冲液代替酶液作空白测定酶活性(酶活性单位采用抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位),筛选出酶活性最高的菌株,进行中试,SOD含量高,在50℃和pH4-9条件下酶活力稳定,即可用于生产;
(4)菌种培养、换代、保藏:将菌种划线接种于牛肉蛋白胨培养基(蛋白胨5g,牛肉汁3g、NaCl5g,琼脂粉15g,配1000ml水)斜面,4℃(短期)或-10℃(长期)冰箱或冷库保存,用画线法定期转管传代。
3、根据权利要求1所述的SOD生产方法,其特征在于所述的发酵过程按以下工艺进行:
(1)菌种活化:将高SOD含量的芽孢杆菌(Bacillus  cereus)原菌种划线接种于固体牛肉胨斜面培养基,接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟,接种后在28-32℃条件下培养30-48小时,然后配成孢子液,用于种子罐接种;
(2)种子罐发酵:将种子罐灭菌后,装入培养液再次灭菌,冷却至30℃时,将孢子液接入培养液中,然后通入无菌空气培养,即得种子罐发酵菌液;
(3)发酵罐培养:将发酵罐先灭菌,在装入培养液后灭菌,然后保压降温至25-30℃,按1-2%的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐培养液中培养,当发酵菌液含菌量在每毫升45亿以上,芽孢成熟前有少量芽孢脱落时放罐供菌细胞离析:
灭菌及培养条件:
a.灭菌采用高压蒸气灭菌,即在121℃、压力0.3-0.5Kg/cm2条件下,灭菌30分钟,种子罐、发酵罐培养液灭菌搅拌速度230-250rpm/min,种子罐接种后,在28-35℃条件下培养8-10小时。发酵罐接种后,在28-35℃条件下培养18-30小时,通气量1-2Vols/Vol/min,氧气含量30-40%;
b.种子罐配方为:蛋白胨0.4-0.6%,牛肉汁0.3-0.4%,NaCl0.4-0.6%,豆油0.2-0.4%,葡萄糖0.2-0.4%,pH值消毒前7.5,消毒后7.0-7.4;
c.发酵罐配方为:牛肉汁0.3-0.5%,蛋白胨0.4-0.6%,NaCl0.4-0.6%,豆油0.3-0.5%,葡萄糖0.1-0.3%,淀粉0.3-0.5%,硫酸镁0.05-0.1%,磷酸二氢钾0.03-0.04%,碳酸钙0.3-0.5%,500-1000μM的Cu、Zn、Mn、Fe,搅拌。pH值消毒前7.5-7.8,消毒后7.0-7.4;
发酵液要求:当发酵菌液含菌量在每毫升45亿以上,芽孢成熟前放罐,pH值7.3-7.9,无杂菌污染。
4、根据权利要求1所述的SOD生产方法,其特征在于所述的菌细胞离析破碎主要包括以下工艺过程:
(1)菌细胞离析:发酵罐菌液以200-400L/h的控制流量注入离心机,离心机以4000-5000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀以菌糊自动流出,进入生理盐水槽,经三次洗涤,离心后收集菌糊;
(2)菌细胞破碎:按菌糊与缓冲液以1∶1-2体积比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液,搅拌成菌液,按每升菌糊加入50mg溶菌酶,在0-4℃低温条件下搅拌30分钟,用250W功率超声波细胞粉碎机在0-5℃低温条件下对菌液处理10分钟,每处理1分钟间隔1分钟,超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况,然后将菌液以4000-5000rpm/min离心,收集上清液作为SOD的粗提液,同时对粗提液方法进行SOD活性测定和蛋白浓度测定,计算SOD比活(U/mg)。
5、根据权利要求1所述的SOD生产方法,其特征在于所述的粗酶生产工艺过程如下:
(1)55%硫酸铵沉淀:将粗提液加入硫酸铵,使粗提液中硫酸铵达到55%饱和度,在22-28℃下利用搅拌器搅拌90分钟,并静置2-12小时,以10000×g离心30分钟,分离出上清液(或采用膜过滤系统过滤得到滤液);
(2)75%硫酸铵沉淀:在55%硫酸铵沉淀后的上清液或滤液中,加入硫酸铵使其饱和度达到75%,在室温下利用搅拌器搅拌90分钟,以10000Xg离心30分钟(或采用过滤系统过滤),将沉淀溶于最小量的5m  mol/L、pH7.8磷酸钾缓冲液中(内含2m  mol/L  EDTA),然后用上述缓冲液和透析袋(分子量8000)进行动态透析,除去硫酸铵,透析时间24-48小时;
(3)SephadexG-75柱层析:先用pH7.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex  G-75柱,将透析后的粗酶提取液加入到柱中,并用上述缓冲液洗脱,采用全自动分步收集系统收集洗脱液,通过检测SOD活力,合并SOD活力高的收集液部分;对合并液检测SOD活力和蛋白浓度;同时采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳检测SOD纯度,要求SOD比活达800以上,产率达50%以上,电泳检测主要呈现SOD蛋白带;
粗酶制剂产品:经Sephadex  G-75柱层析后的SOD酶液为粗酶制剂以液体制剂为产品,或通过冷冻干燥以粉末晶体制剂为产品。
6、根据权利要求1所述的SOD生产方法,其特征在于所述的精制酶层析生产工艺包括DE-52柱层析和不同种类SOD制剂的层析工艺:
(1)DE-52柱层析:将经Sephadex  G-75柱层析后的粗酶液通过预先用pH7.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱,用上述缓冲液洗脱至洗脱液中蛋白吸收(280nm)光密值低于0.05以下,并用0.005-0.3mol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱,并同时开始收集,经SOD活力检测,将酶活力高的收集液合并,检测SOD活力和蛋白浓度,并进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳,检测SOD纯度;其纯度要求达到电泳纯,SOD比活达3000以上;
(2)不同种类SOD的层析工艺:
(a)Cu、Zn-SOD的层析工艺:按DE-52柱层析生产工艺生产的SOD即为Cu、Zn-SOD;
(b)Mn-SOD的层析工艺:将上述经DE-52柱梯度洗脱前的洗脱液收集后,加热到65℃,5分钟后置于低温下迅速冷却,后又迅速加热,依此重复3次。以10000×g离心分离出上清液(或通过加压过滤分离出滤液),将上清液(或滤液)用聚乙二醇浓缩,将浓缩液通过用pH5.5、40m  mol/L的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱,并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱,同时进行收集,将酶活性高的收集液合并一起,检测SOD活力,采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳进行Mn-SOD纯度鉴定,得到纯Mn-SOD精酶制剂;
(c)Fe-SOD的层析工艺:将经75%饱和度的硫酸铵沉淀、并已透析的粗酶液通过预先用pH5.5、0.01mol/L醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱,以上述缓冲液洗脱,收集酶活力高的洗脱液,用pH7.8、50m  mol/L磷酸钾缓冲液透析,将透析液通过预先用pH2.8、5m  mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱,用同样缓冲液洗柱,并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱,将符合纯Fe-SOD标准的酶活力高的收集液合并,进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳,检查Fe-SOD纯度,将符合纯酶标准的收集液混合,加硫酸铵使达到80%饱和度,再经离心或过滤得到的沉淀为纯Fe-SOD,将沉淀用pH7.8、50mmol/L磷酸钾缓冲液透析,后经浓缩或通过加压过滤为生产的Fe-SOD;
(3)、精制酶层析生产过程要求在4℃条件下进行,对生产的产品作SOD电泳图谱、原子吸收光谱、紫外和可见光吸收光谱能达到均一性的高活性纯SOD,比活在3000u/mg以上,经最后层析得到的各种纯SOD采用水透析、抽真空冷冻干燥,即得纯SOD晶体粉末产品。
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