CN1058614A

CN1058614A - 利用芽孢杆菌生产超氧化物岐化酶的方法

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Publication number: CN1058614A
Application number: CN 91108549
Authority: CN
Inventors: 梅汝鸿; 夏立秋; 丁学知; 计平生; 陈璧; 唐文华; 吴加志; 严志农; 张守安; 奉公
Original assignee: Beijing Agricultural University
Current assignee: Beijing Agricultural University; Beijing University of Agriculture
Priority date: 1991-09-02
Filing date: 1991-09-02
Publication date: 1992-02-12

Abstract

本发明涉及超氧化物歧化酶(SOD)的一种新菌种及生产工艺。本发明利用芽孢杆菌(Bacillus)菌体生产SOD，其精制SOD含量高达0.278毫克/克生物量，比国际上八十年代末利用微生物生产SOD的原料含量高2.6—8.9倍。本发明包括SOD高含量菌株筛选、发酵、菌细胞离析破碎、粗酶生产和精制酶层析生产工艺。用本发明可以同时生产出Cu、 Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种SOD，且 SOD活性高。

Description

本发明涉及生产超氧化物歧化酶（SOD）的新菌种筛选和生产工艺。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）据其所含金属辅基的不同分为Cu、Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD三种，它们都具有相同的催化功能。在动物、植物和微生物体内都含有SOD。生物体在某些病理情况下衰老或遭受逆境胁迫等，能产生过量的并具有毒性更强的超氧物阴离子自由基（

），因

不能被及时清除而进一步衍生成毒性羟自由基（·OH）等氧自由基。

等自由基具有极强的氧化能力，在生物体内能引起生物分子激烈的连锁自发氧化，造成脂质过氧化而破坏膜系统，使核酸断裂，氨基酸分解、酶蛋白变性失活，蛋白质发生分解或聚合，生物体内一系列生理代谢和生化反应遭受干扰。

SOD是生物体内清除过量

的最重要的酶，其催化歧化反应速率比自发反应速率快10¹⁰倍，将

歧化成H₂O₂和O₂，再经过氧化氢酶等酶的作用将H₂O₂转化为H₂O和O₂，防御

对生物分子的破坏作用，维护细胞正常的生理代谢和生化反应。

自1969年美国McCord和Fridovich从牛红细胞中发现了SOD，并鉴定能歧化，保护生物分子免遭氧化降解的作用以来，有关SOD的分子生物学方面的研究一直成为生物学领域的前沿课题，受到各国科学工作者的重视，认为这一创造性的研究工作可以与1953年Watson和Crick发表了有名的DNA双螺旋结构学说所引起的结果相比拟。

特别是在近几年来对SOD的应用研究引起了国际上的重大关注。SOD作为治疗酶在临床应用上的成功给医学和分子药理学带来了新进展，能广泛用于治疗因O^- ₂及其衍生物氧自由基引起的各种较为难治的疾病具有特殊疗效。对自身免疫性疾病、回肠结肠炎、类风湿关节炎、皮肌炎，以及肺炎等炎症有很好疗效。对治疗膀胱癌、前列腺癌等多种癌症，以及癌症化疗引起骨髓损伤和白血球减少的恢复效果很好。对抗辐射损伤有特效。SOD在人类防衰老上有特殊作用，SOD可用于生产保健饮料和保护皮肤健美的日用化妆品。在农作物生产中，应用SOD可增强作物抗病、抗寒、抗旱、抗高温、抗过氧化等抗逆能力和延缓衰老，显著提高作物品质和产量。

SOD在医药、人类保健、饮料生产、日用化工和作物生产上具有广泛的应用前景，但从发现SOD近二十多年来国内外生产SOD至今未取得大的突破。该方面的现有技术存在以下问题。

1、生产SOD的原料

自1969年美国学者McCord和Fridovich从牛红细胞中发现SOD并鉴定其催化功能[见McCord，J.M.Fridovich，J.Biol.Chem.，1969，244，6049.]以来，随着SOD作为治疗酶在临床上广泛成功地应用，对SOD的需求量日益增大。在七十年代初，美国Bannister最初利用牛血为原料生产SOD[见Bannister，J.V.，et al，Eur.J.Biochem.，18（1971），178.]，直至八十年代至现在国际上主要用牛血生产SOD，[见Gartner，A.et al;Biochem，J.，221（1984），549.]大约100公斤牛血（14头牛）能生产1克SOD。由于牛血来源有限，开始研究试图利用人血和其他动物血液及动物肝脏等组织生产SOD，但均未正式投入生产[见Marklund，S.L.，Proc.Natl.Acod.Sci.USA，79（1982）和Rocha，H.A.，et al;Eur，J.Biochem.，145（1984），477]。牛血等动物血及组织和人血因价格昂贵和来源有限，国际上一些学者同时转向利用植物生产SOD。

七十年代日本学者Sawada等和美国学者Beauchamp等最初分别研究了菠菜叶和麦胚等植物的SOD[见Sawada，Y.，et al;Biochem.Biophys Acta，268（1972），305.和Beauchamp，C.O.et al;Biochem.Biophys.Acta，317（1973），50]。直到1986年日本Hagiwara利用稻叶为原料生产SOD，因生产原料不便于工业化生产和处理原料麻烦，未能实现工业化生产[见Japan，154549，82，09.07.]。

国际上一些学者在研究利用动物血和植物生产SOD的同时，也致力于研究利用微生物生产SOD。开展这方面工作最早的应首推美国Weser，他研究酿酒酵母生产SOD[见Weser，V.，et al，Physiol.Chem，353（1972），1821]。以后各国一些学者相继研究了大肠杆菌（E.Coli）、链球菌（S.mutans）、织线藻（P.boryanum）和螺旋藻（S.platensis）等多种微生物的SOD。而最早用于工业化生产是日本的Takeda化学工业公司在1980年利用沙雷铁氏菌属（Serratia）的菌株生产Mn-SOD[见Japan，105645，80.07.30]，但热稳定性差，37℃仅稳定60分钟。以后日本相继报道了利用葡萄糖细菌（Gluconobacter cerinus）和啤酒酵母（Nacardiopsis）生产热稳定Mn-SOD。但未获得高含量的菌株[分别见Japan，274299，84.12.28.和Japan，219166，85.10.03]。

1990年日本Idemitsu石油化工有限公司使用螺旋藻（S.subsalsa）生产SOD，但SOD含量太低，仅347U/g干重[见Japan.0269181，90.03.07]。

1987年苏联Lengd化学制药工业公司用深红酵母（Rhodcforula rubra）生产SOD。工艺流程复杂，且产量也较低（0.032mg/g生物量）[见SU，213365，87.03.18]。1988年德国Veb Berlin-kosmetik也报道了利用酵母提取Cn、Zn-SOD，但所用酵母的SOD含量不高，工业生产不经济[见DD，312216，88.03.13]。

2、生产SOD的工艺

目前国际上生产SOD主要是利用牛血为原料，提取SOD一直是采用McCord等创立的方法和工艺流程[见McCord，J.M.etal;J.Biol.Chem.，244（1969），6049]，该方法的一个最大的问题是除去溶血中的血红蛋白的技术不易掌握[见Gartner，A;etal，Biochem.J.，221（1984），549]。若采用Tsuchihashi改良的方法，因在溶血液中加入乙醇和氯仿等有机试剂多，增大成本[见Tsuc-hihashi，M.，Biochem.Z.，140（1972）1140.]。并且Hartz等认为该种方法损伤了SOD，造成酶结构改变和酶的辅基铜丧失达8%，影响酶活性。其次是该方法需用磷酸氢二钾量极大，造成经济成本增大[见Hartz，J.W.etal，J.Biol.Chem.，244（1969），4565.]。

若采用植物提取SOD，因其含量低，加之种植植物不利于工业化生产，而且处理原料困难，粗酶液制备透析工作量大、消耗化学试剂多，也未能正式工业化生产。利用微生物发酵法生产SOD，现利用的原料包括酵母，大肠杆菌、链球菌螺旋藻和织线藻等，这些原料都因缺乏高含量菌株经济效益不高，而且藻类培养还需照明等条件。特别是提取的SOD热稳定性差，有的需进行修饰才能供医疗用，有的需通过转螯金属离子造成程序复杂。

本项发明的目的是：开辟一种来源广泛、价格低廉、SOD含量高的生产SOD的新原料，并提供一种相应的便于工业化生产的新方法。

本发明开辟的生产SOD的新原料是芽孢杆菌（Bacillus Cereus），也可以利用其中的一种，如“作物增产菌”（一种芽孢杆菌;保存于CGMCC，保藏号为0137，保藏日期为1988年9月20日）。经11年的菌种筛选，获得的芽孢杆菌菌株-，精制SOD含量高达0.278mg/g生物量，比国际上八十年代末利用微生物生产SOD的原料含量高2.6-8.9倍。与SOD粗酶制剂相比较，要高10-50倍。筛选的该菌株并富含Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种SOD，其中Cu.Zn-SOD为SOD总量的21%，Mn-SOD为52%，Fe-SOD为27%。

本发明创立的SOD综合层析生产工艺流程不仅能为医药、兽药、饮料、日用化工和作物生产，分别提供SOD粗制剂和精制剂，而且通过该流程能生产三种SOD。

利用芽孢杆菌生产SOD新方法其特征在于本法包括以下过程：高SOD含量菌株筛选、发酵、菌细胞离析破碎、粗酶生产工艺和精制酶层析生产工艺。

（一）、高SOD含量菌株筛选

1、分离

图1是高SOD含量的芽孢杆菌的分离筛选示意图，根据不同的需要或不同用途首先从人、动物、植物体表用30-50ml灭菌水淋洗，或取动物、植物组织，土壤1-10g经研磨转入放有40ml灭菌水的三角瓶中按200-300rpm/min振荡10分钟，静置半分钟后以上清液作为菌源水。用灭菌吸管吸取菌源水25ml注入灭菌试管;将试管置80℃水中处理10分钟，用接种环醮菌液在牛肉汁蛋白胨培养基（蛋白胨5g，牛肉汁3g、氯化钠5g、琼脂粉15g、配1000ml水）平板上划线，置28-35℃下培养24小时，仔细选取不同菌落，进行涂片、染色镜检，为蜡质芽孢杆菌的，转移到上述培养基斜面上编号以待酶活力测定。

2、上清液的制备

将菌株接种于装有150ml-250ml液体牛肉汁蛋白胨培养基的灭菌三角瓶中（培养基成份以上述成份不含琼脂粉），在27-34℃下摇床振荡培养24-30小时。采用4000rpm/min、4℃离心20分钟，收集菌细胞2克以上，用0.9%NaCl溶液洗涤3次，对菌糊称重后用50mmol/L、pH7.8磷酸钠缓冲液（内含2mmol/L EDTA、2mmol/L巯基乙醇）按菌∶液为1∶1-2比例加入，搅拌成悬浮液，按每克菌加入0.05mg溶菌酶在冰浴上处理30分钟，并轻轻搅拌，用100w功率超声波发生器于冰浴上超声处理共10分钟，每次处理1分钟间隔1分钟。4000rpm/min，4℃离心20分钟，取上清液（粗酶液）供测SOD活性。

3.酶活力测定

采用本发明改进的高灵敏度的氯化硝基氮蓝四唑（NBT）光还原测定SOD活力是最经济、最简便易行的适于大量菌株筛选的方法。

SOD活力测定方法：在3ml0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液反应液中（内含有2.7ml 13×10^-3mol/L的Met、0.1ml 75×10^-6mol/L的NBT、0.1ml 100×10^-9mol/L的EDTA、0.1ml2×10^-6mol/L的VB2）加入5-30μl粗酶液后在30℃、4000lux光照条件下经30分钟，在560nm下测定光密度，以缓冲液代替酶液作空白测定酶活性（酶活性单位采用抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位）。

经SOD活力测定筛选出酶活性最高的菌株，进行中试，SOD含量高，在50℃和pH4-9条件下酶活力稳定，即可用于生产。

3、菌种培养、换代、保藏：

将菌种划线接种于牛肉蛋白胨培养基（蛋白胨5g，牛肉汁3g、NaCl5g，琼脂粉15g，配1000ml水）斜面，4℃（短期）或-10℃（长期）冰箱或冷库保存，用划线法定期转管传代。

4、芽孢杆菌生物学特性：

芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌体直杆状、成链、光镜下长2.5-3.5μm，宽1μm，革兰氏反应阴性，芽孢椭圆或柱状，中长，孢囊不膨大，原生质内含有不着色颗粒。琼脂平板培养，菌落圆形，直径0.2cm，边缘整齐，稍隆起，无光泽，不透明，蜡质;液体培养，形成菌膜。生长温度15-45℃，置27-32℃，适宜pH6.0-7.5。适宜碳源麦芽糖、蔗糖。适宜氮源为蛋白胨，无机氮源为NH⁺ ₄，发酵葡萄糖、麦芽糖产酸，木糖、乳糖、甘露琼不产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐成亚硝酸盐，7%NaCl中生长，pH5.7生长，V.P阳性，V.P液培养后pH4.56。能厌氧生长，接触酶阳性，碳水化合物产气阴性，不产生吲哚，苯丙氨酸脱氨阴性。

（二）、发酵

图2是芽孢杆菌生产SOD的发酵工艺流程示意图，主要包括菌种活化、种子罐发酵及发酵罐培养。

1、菌种活化

将高SOD含量的芽孢杆菌（Bacillus cereus）原菌种划线接种于上述固体牛肉胨斜面培养基，接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28-32℃条件下培养30-48小时，然后配成孢子液，用于种子罐接种。

2、种子罐发酵

将种子罐灭菌后，装入培养液再次灭菌，冷却至30℃时，将孢子液接入培养液中，然后通入无菌空气培养，即得种子罐发酵菌液。

3、发酵罐培养

将发酵罐先灭菌，在装入培养液后灭菌，然后保压降温至25-30℃，按1-2%的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐培养液中培养，然后放罐供菌细胞离析。

4、灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸气灭菌，即在121℃、压力0.3-0.5Kg/cm²条件下，灭菌30分钟，种子罐、发酵罐培养液灭菌搅拌速度230-250rpm/min，种子罐接种后，在28-35℃条件下培养8-10小时。发酵罐接种后，在28-35℃条件下培养18-30小时。通气量1-2Vols/Vol/min，氧气含量30-40%。

种子罐配方为：蛋白胨0.4-0.6%，牛肉汁0.3-0.4%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.2-0.4%，葡萄糖0.2-0.4%，pH值消毒前7.5，消毒后7.0-7.4。

发酵罐配方为：牛肉汁0.3-0.5%，蛋白胨0.4-0.6%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.3-0.5%，葡萄糖0.1-0.3%，淀粉0.3-0.5%，硫酸镁0.05-0.1%，磷酸二氢钾0.03-0.04%，碳酸钙0.3-0.5%，500-1000μM的Cu、Zn、Mn、Fe，搅拌，pH值消毒前7.5-7.8，消毒后7.0-7.4。

5、发酵液要求：

发酵菌液含菌量在每毫升45亿以上，芽孢成熟前放罐。pH值7.3-7.9。无杂菌污染。

（三）、菌细胞离析破碎

图3是芽孢杆菌细胞SOD粗提液工艺流程示意图，主要包括细胞离析，细胞破碎等工艺。

1、菌细胞离析

发酵罐菌液在控制流量200-400L/h注入离心机，离心机以4000-5000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀，以菌糊自动流出，进入生理盐水槽，经三次洗涤，离心后收集菌糊。

2、菌细胞破碎

按菌糊与缓冲液以1∶1-2体积比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液，搅拌成菌液，按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在0-4℃低温条件下搅拌30分钟。用250W功率超声波细胞粉碎机在0-5℃低温条件下对菌液处理10分钟，每处理1分钟间隔1分钟。超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况。然后将菌液以4000-5000rpm/min离心收集上清液作为SOD的粗提液。同时对粗提液方法进行SOD活性测定和蛋白浓度测定，计算SOD比活（U/mg）。

（四）、粗酶生产工艺

图4是芽孢杆菌SOD粗酶制剂生产工艺流程示意图，由55%硫酸沉淀、75%硫酸沉淀及Sephadex G-75柱层析三步工艺组成。

1、55%硫酸铵沉淀

将粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵达到55%饱和度。在22-28℃下利用搅拌器搅拌90分钟，并静置2-12小时。以10000×g离心30分钟，分离出上清液，或采用膜过滤系统过滤得到滤液。

2、75%硫酸铵沉淀

在55%硫酸铵沉淀后的上清液或滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到75%，在室温下利用搅拌器搅拌90分钟。以10000Xg离心30分钟，或采用过滤系统过滤。将沉淀溶于最小量的5m mol/L、pH7.8磷酸钾缓冲液中（内含2m mol/L EDTA），然后用上述缓冲液和透析袋（分子量8000）进行动态透析，除去硫酸铵。透析时间24-48小时。

3、SephadexG-75柱层析

用Sephadex G-75柱，预先用pH7.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex G-75柱，将透析后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述缓冲液洗脱。采用全自动分步收集系统收集洗脱液，通过检测SOD活力，合并SOD活力高的收集液部分。对合并液检测SOD活力和蛋白浓度;同时采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳检测SOD纯度。

4、粗酶制剂质量要求

粗酶提取液经Sephadex G-75层析收集的SOD高活力峰液，要求SOD比活达600以上，产率达50%以上。电泳检测主要呈现SOD蛋白带。

5、粗酶制剂产品

经Sephadex G-75柱层析后的SOD酶液为粗酶制剂以液体制剂为产品，或通过冷冻干燥以粉末晶体制剂为产品。

（五）、精制酶层析生产工艺

图5是芽孢杆菌精制SOD制剂生产工艺流程示意图，包括DE-52柱层析和不同种类SOD制剂的层析工艺。

1、DE-52柱层析

将经Sephadex G-75柱层析后的粗酶液通过预先用pH7.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用上述缓冲液洗脱至洗脱液中蛋白吸收（280nm）光密值低于0.05以下，并用0.005-0.3mol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，并同时开始收集，经SOD活力检测，将酶活力高的收集液合并，检测SOD活力和蛋白浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳，检测SOD纯度。

2、精制酶质量要求

经DE-52柱层析后收集的酶液，其SOD纯度要求达到电泳纯，SOD比活达3000以上。

3、不同种类SOD的层析工艺

（1）Cu、Zn-SOD的层析工艺：按前述层析生产工艺生产的SOD为Cu、Zn-SOD。

（2）Mn-SOD的层析工艺：

将上述经DE-52柱梯度洗脱前的洗脱液收集后，加热到65℃，5分钟后置于低温下迅速冷却，后又迅速加热，依此重复3次。以10000×g离心分离出上清液，或通过加压过滤分离出滤液。将上清液或滤液用聚乙二醇浓缩。

将浓缩液通过用pH5.5、40m mol/L的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱，同时进行收集，将酶活性高的收集液合并一起，检测SOD活力，采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳进行Mn-SOD纯度鉴定，得到纯Mn-SOD精酶制剂。

（3）Fe-SOD的层析工艺

将经75%饱和度的硫酸铵沉淀、并已透析的粗酶液通过预先用pH5.5、0.01mol/L醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，以上述缓冲液洗脱，收集酶活力高的洗脱液，用pH7.8、50m mol/L磷酸钾缓冲液透析。将透析液通过预先用pH2.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用同样缓冲液洗柱，并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将符合纯Fe-SOD标准的酶活力高的收集液合并，进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳，检查Fe-SOD纯度。将符合纯酶标准的收集液混合，加硫酸铵使达到80%饱和度，再经离心或过滤得到的沉淀为纯Fe-SOD，将沉淀用pH7.8、50mmol/L磷酸钾缓冲液透析，后经浓缩或通过加压过滤为Fe-SOD精酶液。

4、精制酶层析生产过程要求在4℃条件下进行。对生产的产品作SOD电泳图谱、原子吸收光谱、紫外和可见光吸收光谱能达到均一性的高活性纯SOD。比活在3000u/mg以上。经最后层析得到的各种纯SOD采用水透析、抽真空冷冻，干燥，即得纯SOD晶体粉末产品。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）菌株SOD含量高：精制SOD含量高达0.278mg/g生物量，比国际上八十年代末利用微生物生产SOD的原料含量高2.6-8.9倍。与SOD粗酶制剂相比较，要高10-50倍。

（2）筛选的该菌株并富含Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种SOD，其中Cu.Zn-SOD为SOD总量的21%，Mn-SOD为52%，Fe-SOD为27%。

（3）本发明创立的SOD综合层析生产工艺先进，不仅能为医药、兽药、饮料、日用化工和作物生产，分别提供SOD粗制剂和精制剂，而且通过该流程能生产三种SOD。

（4）由于原料来源容易、低廉，便于工业化生产。

下面是本发明的实施例：用100公斤芽孢杆菌菌糊生产5.7克SOD。

1、从植物体组织中筛选出SOD含量达0.27mg/g的芽孢杆菌株。

2、用15吨发酵罐生产发酵菌液14吨。将发酵罐先灭菌，装入培养液后再灭菌。

灭菌采用高压蒸气灭菌，即在121℃、压力0.5Kg/cm²条件下，灭菌30分钟，发酵罐培养液灭菌搅拌速度250rpm/min。然后降温至28℃f，按2%的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐。发酵罐接种后，在32℃条件下培养24小时。通气量2Vols/Vol/min，氧气含量40%。

发酵罐培养液配方为：牛肉汁0.5%，蛋白胨0.5%，NaCl0.5%，豆油0.5%，葡萄糖0.2%，淀粉0.4%，硫酸镁0.08%，磷酸二氢钾0.04%，碳酸钙0.5%，800μM的Cu、Zn、Mn、Fe，搅拌。pH值消毒前7.6，消毒后7.4。

发酵菌液含菌量在每毫升50亿以上，芽孢成熟前放罐，pH为值7.5，无杂菌污染。

3、将菌细胞离析。发酵罐菌液在控制流量400L/h注入离心机，离心机以4000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀以菌糊自动流出，进入生理盐水槽，经三次洗涤，离心后收集到100公斤菌糊。

4、将菌细胞破碎。按菌糊与缓冲液以1∶1.5体积比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液，搅拌成菌液。按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在4℃低温条件下搅拌30分钟。用250W功率超声波细胞粉碎机在2℃低温条件下对菌液处理10分钟，每处理1分钟间隔1分钟。超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况。然后将菌液以4000rpm/min离心。收集到115kg上清液作为SOD的粗提液。

5、提取粗酶。

（1）55%硫酸铵沉淀。将粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵达到55%饱和度。在22℃下利用搅拌器搅拌90分钟，并静置2小时，采用膜过滤系统过滤得到滤液。

（2）75%硫酸铵沉淀。在55%硫酸铵沉淀后的滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到75%，在室温下利用搅拌器搅拌90分钟，采用过滤系统过滤，将过滤物溶于最小量的5m mol/L、pH7.8磷酸钾缓冲液中（内含2mmol/L EDTA），然后用上述缓冲液和透析袋（分子量8000）进行动态透析，除去硫酸铵。透析时间40小时，得到108kg粗酶提取液。

（3）SephadexG-75柱层析。用Sephadex G-75柱，预先用pH7.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex G-75柱，将透析后的粗酶提取液72kg加入到柱中，并用上述缓冲液洗脱。采用全自动分步收集系统收集洗脱液，合并SOD活力高的收集液部分。

6、SOD精制酶的制备

（1）DE-52柱层析

将经Sephadex G-75柱层析后的粗酶液通过预先用pH7.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用上述缓冲液洗脱，将酶活力高的收集液合并，得到Cu.Zn-SOD纯酶液。

7、不同种类SOD的精制酶的制备

（1）Cu、Zn-SOD：将CU.Zn-SOD纯酶液浓缩、冷冻干燥可得到Cu.Zn-SOD纯酶粉剂1.45kg。

（2）Mn-SOD：将上述经DE-52柱梯度洗脱前的洗脱液收集，加热到65℃，5分钟后置于低温下迅速冷却，后又迅速加热，依此重复3次，通过加压过滤分离出滤液，将滤液浓缩。

将浓缩液通过用pH5.5、40m mol/L的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱，同时进行收集，将酶活性高的收集液合并一起，得到Mn-SOD纯酶液，再经浓缩、冷冻干燥得到Mn-SOD纯酶粉＜3.5克。

（3）Fe-SOD：将经75%饱和度的硫酸铵沉淀、并已透析的粗酶液36kg通过预先用pH5.5、0.01mol/L醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，以上述缓冲液洗脱，收集酶活力高的洗脱液，用pH7.8、50m mol/L磷酸钾缓冲液透析。将透析液通过预先用pH2.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用同样缓冲液洗柱，并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将符合纯Fe-SOD标准的酶活力高的收集液合并，将符合纯酶标准的收集液混合，加硫酸铵使达到80%饱和度，再经过滤得到的为纯Fe-SOD，将过滤物用pH7.8、50mmol/L磷酸钾缓冲液透析，通过加压过滤得到Fe-SOD纯酶液，再经浓缩、冷冻干燥得到Fe-SOD纯酶粉剂0.75克。

共获得SOF纯酶粉剂5.7克。

Claims

1、一种利用芽孢杆菌生产超氧化物歧化酶(SOD)的方法，特征在于本法包括：

(1)SOD高含量菌株筛选

(2)发酵

(3)菌细胞离析破碎

(4)粗酶生产工艺和精制酶层析生产工艺。

2、根据权利要求1所述的SOD生产方法，其特征在于所述的SOD高含量芽孢杆菌的筛选按以下步骤进行：

（1）分离：根据不同的用途或需要，从人、动物、植物体表用30-50ml灭菌水淋洗，或取动物、植物组织，土壤1-10g经研磨转入放有40ml灭菌水的三角瓶中按200-300rpm/min振荡10分钟，静置半分钟后以上清液作为菌源水，用灭菌吸管吸取菌源水25ml注入灭菌试管，将试管置80℃水中处理10分钟，用接种环醮菌液在牛肉汁蛋白胨培养基（蛋白胨5g，牛肉汁3g、氯化钠5g、琼脂粉15g、配1000ml水）平板上划线，置28-35℃下培养24小时，仔细选取不同菌落，进行涂片、染色镜检，为芽孢杆菌的，转移到牛肉蛋白胨培养基斜面上编号以待酶活力测定;

（2）上清液制备：将菌株接种于装有150ml-250ml液体牛肉汁蛋白胨培养基的灭菌三角瓶中（培养基成份以上述成份不含琼脂粉），在27-34℃下摇床振荡培养24-30小时，采用4000rpm/min、4℃离心20分钟，收集菌细胞2克以上，用0.9%NaCl溶液洗涤3次，对菌糊称重后用5mmol/L、pH7.8磷酸钠缓冲液（内含2mmol/LEDTA、2mmol/L巯基乙醇）按菌∶液为1∶1-2比例加入，搅拌成悬浮液，按每克菌加入0.05mg溶菌酶，在冰浴上处理30分钟，并轻轻搅拌，用100w功率超声波发生器于冰浴上超声处理共10分钟，每次处理1分钟间隔1分钟，4000rpm/min，4℃离心20分钟，取上清液供测SOD活性;

（3）酶活力测定：本发明采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮蓝四唑（NBT）光还原法测定SOD活力，即在3ml0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液反应液中（内含有2.7ml 13×10^-3mol/L的Met、0.1ml 75×10^-6mol/L的NBT、0.1ml 100×10^-9mol/L的EDTA、0.1ml2×10^-6mol/L的VB₂）加入5-30μl酶液，在30℃、4000lux光照条件下处理30分钟，在580nm下测定光密度，以缓冲液代替酶液作空白测定酶活性（酶活性单位采用抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位），筛选出酶活性最高的菌株，进行中试，SOD含量高，在50℃和pH4-9条件下酶活力稳定，即可用于生产;

（4）菌种培养、换代、保藏：将菌种划线接种于牛肉蛋白胨培养基（蛋白胨5g，牛肉汁3g、NaCl5g，琼脂粉15g，配1000ml水）斜面，4℃（短期）或-10℃（长期）冰箱或冷库保存，用画线法定期转管传代。

3、根据权利要求1所述的SOD生产方法，其特征在于所述的发酵过程按以下工艺进行：

（1）菌种活化：将高SOD含量的芽孢杆菌（Bacillus cereus）原菌种划线接种于固体牛肉胨斜面培养基，接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28-32℃条件下培养30-48小时，然后配成孢子液，用于种子罐接种;

（2）种子罐发酵：将种子罐灭菌后，装入培养液再次灭菌，冷却至30℃时，将孢子液接入培养液中，然后通入无菌空气培养，即得种子罐发酵菌液;

（3）发酵罐培养：将发酵罐先灭菌，在装入培养液后灭菌，然后保压降温至25-30℃，按1-2%的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐培养液中培养，当发酵菌液含菌量在每毫升45亿以上，芽孢成熟前有少量芽孢脱落时放罐供菌细胞离析：

灭菌及培养条件：

a.灭菌采用高压蒸气灭菌，即在121℃、压力0.3-0.5Kg/cm²条件下，灭菌30分钟，种子罐、发酵罐培养液灭菌搅拌速度230-250rpm/min，种子罐接种后，在28-35℃条件下培养8-10小时。发酵罐接种后，在28-35℃条件下培养18-30小时，通气量1-2Vols/Vol/min，氧气含量30-40%;

b.种子罐配方为：蛋白胨0.4-0.6%，牛肉汁0.3-0.4%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.2-0.4%，葡萄糖0.2-0.4%，pH值消毒前7.5，消毒后7.0-7.4;

c.发酵罐配方为：牛肉汁0.3-0.5%，蛋白胨0.4-0.6%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.3-0.5%，葡萄糖0.1-0.3%，淀粉0.3-0.5%，硫酸镁0.05-0.1%，磷酸二氢钾0.03-0.04%，碳酸钙0.3-0.5%，500-1000μM的Cu、Zn、Mn、Fe，搅拌。pH值消毒前7.5-7.8，消毒后7.0-7.4;

发酵液要求：当发酵菌液含菌量在每毫升45亿以上，芽孢成熟前放罐，pH值7.3-7.9，无杂菌污染。

4、根据权利要求1所述的SOD生产方法，其特征在于所述的菌细胞离析破碎主要包括以下工艺过程：

（1）菌细胞离析：发酵罐菌液以200-400L/h的控制流量注入离心机，离心机以4000-5000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀以菌糊自动流出，进入生理盐水槽，经三次洗涤，离心后收集菌糊;

（2）菌细胞破碎：按菌糊与缓冲液以1∶1-2体积比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液，搅拌成菌液，按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在0-4℃低温条件下搅拌30分钟，用250W功率超声波细胞粉碎机在0-5℃低温条件下对菌液处理10分钟，每处理1分钟间隔1分钟，超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况，然后将菌液以4000-5000rpm/min离心，收集上清液作为SOD的粗提液，同时对粗提液方法进行SOD活性测定和蛋白浓度测定，计算SOD比活（U/mg）。

5、根据权利要求1所述的SOD生产方法，其特征在于所述的粗酶生产工艺过程如下：

（1）55%硫酸铵沉淀：将粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵达到55%饱和度，在22-28℃下利用搅拌器搅拌90分钟，并静置2-12小时，以10000×g离心30分钟，分离出上清液（或采用膜过滤系统过滤得到滤液）;

（2）75%硫酸铵沉淀：在55%硫酸铵沉淀后的上清液或滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到75%，在室温下利用搅拌器搅拌90分钟，以10000Xg离心30分钟（或采用过滤系统过滤），将沉淀溶于最小量的5m mol/L、pH7.8磷酸钾缓冲液中（内含2m mol/L EDTA），然后用上述缓冲液和透析袋（分子量8000）进行动态透析，除去硫酸铵，透析时间24-48小时;

（3）SephadexG-75柱层析：先用pH7.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex G-75柱，将透析后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述缓冲液洗脱，采用全自动分步收集系统收集洗脱液，通过检测SOD活力，合并SOD活力高的收集液部分;对合并液检测SOD活力和蛋白浓度;同时采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳检测SOD纯度，要求SOD比活达800以上，产率达50%以上，电泳检测主要呈现SOD蛋白带;

粗酶制剂产品：经Sephadex G-75柱层析后的SOD酶液为粗酶制剂以液体制剂为产品，或通过冷冻干燥以粉末晶体制剂为产品。

6、根据权利要求1所述的SOD生产方法，其特征在于所述的精制酶层析生产工艺包括DE-52柱层析和不同种类SOD制剂的层析工艺：

（1）DE-52柱层析：将经Sephadex G-75柱层析后的粗酶液通过预先用pH7.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用上述缓冲液洗脱至洗脱液中蛋白吸收（280nm）光密值低于0.05以下，并用0.005-0.3mol/L、pH7.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，并同时开始收集，经SOD活力检测，将酶活力高的收集液合并，检测SOD活力和蛋白浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳，检测SOD纯度;其纯度要求达到电泳纯，SOD比活达3000以上;

（2）不同种类SOD的层析工艺：

（a）Cu、Zn-SOD的层析工艺：按DE-52柱层析生产工艺生产的SOD即为Cu、Zn-SOD;

（b）Mn-SOD的层析工艺：将上述经DE-52柱梯度洗脱前的洗脱液收集后，加热到65℃，5分钟后置于低温下迅速冷却，后又迅速加热，依此重复3次。以10000×g离心分离出上清液（或通过加压过滤分离出滤液），将上清液（或滤液）用聚乙二醇浓缩，将浓缩液通过用pH5.5、40m mol/L的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱，同时进行收集，将酶活性高的收集液合并一起，检测SOD活力，采用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳进行Mn-SOD纯度鉴定，得到纯Mn-SOD精酶制剂;

（c）Fe-SOD的层析工艺：将经75%饱和度的硫酸铵沉淀、并已透析的粗酶液通过预先用pH5.5、0.01mol/L醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，以上述缓冲液洗脱，收集酶活力高的洗脱液，用pH7.8、50m mol/L磷酸钾缓冲液透析，将透析液通过预先用pH2.8、5m mol/L的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用同样缓冲液洗柱，并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将符合纯Fe-SOD标准的酶活力高的收集液合并，进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳和SOD电泳，检查Fe-SOD纯度，将符合纯酶标准的收集液混合，加硫酸铵使达到80%饱和度，再经离心或过滤得到的沉淀为纯Fe-SOD，将沉淀用pH7.8、50mmol/L磷酸钾缓冲液透析，后经浓缩或通过加压过滤为生产的Fe-SOD;

（3）、精制酶层析生产过程要求在4℃条件下进行，对生产的产品作SOD电泳图谱、原子吸收光谱、紫外和可见光吸收光谱能达到均一性的高活性纯SOD，比活在3000u/mg以上，经最后层析得到的各种纯SOD采用水透析、抽真空冷冻干燥，即得纯SOD晶体粉末产品。