CN108486074A - 一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，用盐酸调节破碎后的细菌发酵培养液pH值至酸性，静置后，离心取上清，将上清超滤浓缩后，分别加入沉淀剂和籽晶，混合均匀后放入控温箱中直至晶体析出，清洗晶体三次后，继续结晶两次以上后，冷冻干燥，得到成品。该方法不仅过程简单，成本低，而且不使用任何层析技术，避免了层析技术的缺陷。该方法在得到高纯度超氧化物歧化酶的同时，还获得了超氧化物歧化酶晶体。得到的超氧化物歧化酶纯度达到96％，比活力为4523U/mg。因此，该方法既是一种可替代层析法的新型分离纯化技术，还提供了一种制备超氧化物歧化酶晶体的方法，具有广阔的应用前景。

Description

一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法
技术领域
本发明属于蛋白质结晶和蛋白质纯化技术领域,涉及一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，尤其是在不经过层析法纯化的蛋白质溶液中利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法。
背景技术
蛋白质药物研发和生产是生物医药产业中非常重要的组成部分。在其研发和生产过程中，涉及到多种技术的综合应用。随着巨大研发资源的投入，上游技术已经取得重要进展。相比之下，蛋白质药物研发和生产的下游技术部分进展相对较缓，在上游技术不断取得进展的背景下，下游技术逐渐成为整个过程的瓶颈环节。其中，规模化分离纯化技术是蛋白质药物下游生产过程的关键，目前，广泛使用的层析法存在诸多问题，其柱效低、填料昂贵、使用寿命短、需要多级联用、整套设备需要巨大的资金投入的缺陷，已无法应对上游技术改善带来的高滴度和高产量。解决此问题是生物制药行业下游技术发展的迫切需求。因此，发展新型蛋白质规模化分离纯化技术不仅符合我国创新驱动发展战略，而且作为国家重大战略需求，已被列入《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中。
在新型分离纯化技术发展过程中，结晶以其独有的优势具有广阔的应用前景。结晶过程把分离、纯化、浓缩集合在一个步骤中，既缩短了生产流程，符合目前集约化生产的趋势，也不需要使用复杂昂贵的层析设备，资金及设备投入显著降低。蛋白质药物晶型制剂具有高活性、高纯度、高生物相容性、更长的半衰期、高浓度给药时更低的粘度等独特优势，这使得晶型蛋白质药物具有广阔的应用前景。
超氧化物酶(Superoxide dismutase,SOD,EC 1.15.1.1)是一种能够催化超氧阴离子自由基(O2ˉ)通过歧化反应转换成分子氧和过氧化氢的酶，广泛存在于微生物、植物以及动物中。临床上用于心脑血管疾病、类风湿性关节炎、烧伤、化疗等方面的治疗。目前，现有的超氧化物歧化酶分离纯化技术均采用传统的层析法，采用结晶法提纯超氧化物歧化酶在国内外均未见报道。
目前使用的层析法存在诸多问题，其柱效低、填料昂贵、使用寿命短、需要多级联用、整套设备需要巨大的资金投入的缺陷，已无法应对上游技术改善带来的高滴度和高产量。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，用盐酸调节破碎后的细菌发酵培养液pH值至酸性，静置后，离心取上清，将上清超滤浓缩后，分别加入沉淀剂和籽晶，混合均匀后放入控温箱中直至晶体析出，清洗晶体三次后，继续结晶两次以上后，冷冻干燥，得到成品。
技术方案
一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：利用超声破碎仪将细菌发酵培养液破碎后，离心取上清，用盐酸调节蛋白质溶液pH值至酸性，0℃–4℃静置1h–3h后，离心取上清，超滤浓缩后得到蛋白质溶液；
步骤2：将沉淀剂溶解在0.1–5mM，pH值为3.0–5.5的柠檬酸溶液中，与蛋白质溶液按1:1体积比混合后，加入10–200μL籽晶，置于控温箱中，在4℃–20℃中搅拌结晶；所述沉淀剂为PEG8000，浓度为20–80mg/mL；
步骤3：将结晶完成后的溶液离心后取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；
步骤4：加入超氧化物歧化酶晶体清洗溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程多次以彻底清洗晶体，得到超氧化物歧化酶晶体；所述晶体清洗溶液为20–100mg/mL的PEG8000溶液；
步骤5：将所得晶体冻干，得到白色粉末状超氧化物歧化酶成品，或不冻干，直接作为晶体制剂应用。
对于步骤4得到的超氧化物歧化酶晶体溶解后的溶液取代步骤2的蛋白质溶液，采用与步骤2相同的结晶条件重复结晶多次，使所制得的超氧化物歧化酶晶体纯度更高。
所述细菌发酵培养液为具有人源超氧化物歧化酶表达能力的工程菌的发酵液。
所述步骤1的pH值为4.0–6.0。
所述步骤1的超滤中所使用的超滤膜截留分子量为3–10KDa，压力为0.2–0.45MPa。
所述步骤4的多次为三次。
所述步骤5的多次为二次以上。
有益效果
本发明提出的一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，通过结晶法提纯超氧化物歧化酶蛋白是一种新型分离纯化超氧化物歧化酶的方法，该方法不仅过程简单，成本低，而且不使用任何层析技术，避免了层析技术的缺陷。该方法在得到高纯度超氧化物歧化酶的同时，还获得了超氧化物歧化酶晶体。得到的超氧化物歧化酶纯度达到96％，比活力为4523U/mg。因此，该方法既是一种可替代层析法的新型分离纯化技术，还提供了一种制备超氧化物歧化酶晶体的方法，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作进一步描述：
技术方案：用盐酸调节破碎后的细菌发酵培养液pH值至酸性，静置后，离心取上清，将上清超滤浓缩后，分别加入沉淀剂和籽晶，混合均匀后放入控温箱中直至晶体析出，清洗晶体三次后，继续结晶两次以上后，冷冻干燥，得到成品。
具体步骤如下：
(1)利用超声破碎仪破碎细菌发酵培养液(功率30％，开5s，停3s，破碎1h)，4℃，12000rpm离心40min，取上清，用盐酸调节蛋白质溶液pH值至酸性，4℃静置1h后，4℃，12000rpm离心40min离心取上清，超滤浓缩上清至10–50mg/mL；
(2)将沉淀剂溶解在0.1mM，pH 3.0的柠檬酸溶液中，配制成40mg/mL的PEG8000沉淀剂溶液，按1:1的体积比加入到步骤(1)中的蛋白溶液中，混合均匀后加入10–200μL籽晶，置于控温箱中，在1–30℃下搅拌结晶，搅拌速度设置为100–800rpm；
(3)4℃，12000rpm离心，弃上清，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；
(4)在晶体混合物中加入超氧化物歧化酶晶体清洗溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程三次以彻底清洗晶体。
(5)以相同的结晶条件，结晶方法，重复结晶两次以上，以得到更高纯度的超氧化物歧化酶晶体。
(6)将所得晶体冻干，得到白色粉末状超氧化物歧化酶成品。
实施例1：
(1)利用超声破碎仪破碎细菌发酵培养液(功率30％，开5s，停3s，破碎1h)，12000rpm离心40min，取上清，用盐酸调节溶液pH＝5.0，4℃静置1h后，12000rpm离心40min后取上清，在压力为0.5Mpa下，用截留分子量为3KDa的超滤膜，将上清浓缩至30mg/mL；
(2)将沉淀剂溶解在0.1mM，pH 3.0的柠檬酸溶液中，配制成40mg/mL的PEG8000沉淀剂溶液，按1:1的体积比加入到步骤(1)中的蛋白溶液中，混合均匀后加入200uL的籽晶，置于4℃控温箱中搅拌结晶，搅拌速度为200rpm；
(3)将步骤(2)结晶完成后的溶液4℃、12000rpm离心30min取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；
(4)在步骤(3)中所得的溶液中加入40mg/mL的PEG 8000溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程三次以彻底清洗晶体。
(5)以相同的结晶条件，结晶方法，重复结晶两次以上，以得到更高纯度的超氧化物歧化酶晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体溶液冷冻干燥，得到超氧化物歧化酶纯度为95％，比活力为4335U/mg。
实施例2：
(1)利用超声破碎仪破碎细菌发酵培养液(功率30％，开5s，停3s，破碎1h)，12000rpm离心40min，取上清，用盐酸调节溶液pH＝4.5，4℃静置1h后，12000rpm离心40min后取上清，在压力为0.5Mpa下，用截留分子量为3KDa的超滤膜，将上清浓缩至40mg/mL；
(2)将沉淀剂溶解在0.2mM，pH 3.5的柠檬酸溶液中，配制成40mg/mL的PEG8000沉淀剂溶液，按1:1的体积比加入到步骤(1)中的蛋白溶液中，混合均匀后加入200uL的籽晶，置于4℃控温箱中搅拌结晶，搅拌速度为250rpm；
(3)将步骤(2)结晶完成后的溶液4℃、12000rpm离心30min取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；
(4)在步骤(3)中所得的溶液中加入60mg/mL的PEG 8000溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程三次以彻底清洗晶体。
(5)以相同的结晶条件，结晶方法，重复结晶两次以上，以得到更高纯度的超氧化物歧化酶晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体溶液冷冻干燥，得到超氧化物歧化酶纯度为96％，比活力为4523U/mg。
实施例3：
(1)利用超声破碎仪破碎细菌发酵培养液(功率30％，开5s，停3s，破碎1h)，12000rpm离心40min，取上清，用盐酸调节溶液pH＝4.0，4℃静置1h后，12000rpm离心40min后取上清，在压力为0.5Mpa下，用截留分子量为3KDa的超滤膜，将上清浓缩至35mg/mL；
(2)将沉淀剂溶解在0.2mM，pH 3.5的柠檬酸溶液中，配制成60mg/mL的PEG8000沉淀剂溶液，按1:1的体积比加入到步骤(1)中的蛋白溶液中，混合均匀后加入200uL的籽晶，置于4℃控温箱中搅拌结晶，搅拌速度为250rpm；
(3)将步骤(2)结晶完成后的溶液4℃、12000rpm离心30min取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；
(4)在步骤(3)中所得的溶液中加入60mg/mL的PEG 8000溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程三次以彻底清洗晶体。
(5)以相同的结晶条件，结晶方法，重复结晶两次以上，以得到更高纯度的超氧化物歧化酶晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体溶液冷冻干燥，得到超氧化物歧化酶纯度为93％，比活力为3869U/mg。

Claims (7)

1.一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：利用超声破碎仪将细菌发酵培养液破碎后，离心取上清，用盐酸调节蛋白质溶液pH值至酸性，0℃–4℃静置1h–3h后，离心取上清，超滤浓缩后得到蛋白质溶液；
步骤2：将沉淀剂溶解在0.1–5mM，pH值为3.0–5.5的柠檬酸溶液中，与蛋白质溶液按1:1体积比混合后，加入10–200μL籽晶，置于控温箱中，在4℃–20℃中搅拌结晶；所述沉淀剂为PEG8000，浓度为20–80mg/mL；
步骤3：将结晶完成后的溶液离心后取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；
步骤4：加入超氧化物歧化酶晶体清洗溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程多次以彻底清洗晶体，得到超氧化物歧化酶晶体；所述晶体清洗溶液为20–100mg/mL的PEG8000溶液；
步骤5：将所得晶体冻干，得到白色粉末状超氧化物歧化酶成品，或不冻干，直接作为晶体制剂应用。
2.根据权利要求1所述利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：对于步骤4得到的超氧化物歧化酶晶体溶解后的溶液取代步骤2的蛋白质溶液，采用与步骤2相同的结晶条件重复结晶多次，使所制得的超氧化物歧化酶晶体纯度更高。
3.根据权利要求1或2所述利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述细菌发酵培养液为具有人源超氧化物歧化酶表达能力的工程菌的发酵液。
4.根据权利要求1所述利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述步骤1的pH值为4.0–6.0。
5.根据权利要求1所述利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述步骤1的超滤中所使用的超滤膜截留分子量为3–10KDa，压力为0.2–0.45MPa。
6.根据权利要求1所述利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述步骤4的多次为三次。
7.根据权利要求1所述利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述步骤5的多次为二次以上。
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