CN102382030A - L-色氨酸分离纯化的一种工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离纯化L-色氨酸的方法，稀释的L-色氨酸发酵液经微滤、超滤、调节pH值和离子强度后，采用反胶团萃取技术进行三级逆流萃取和三级逆流反萃取，富集L-色氨酸的水相经二次纳滤、结晶、离心干燥即得含量大于98.0％的L-色氨酸。本发明采用膜分离技术和反胶团萃取等技术，具有提取收率高、萃取工艺简单、快速有效、萃取剂可循环使用等特点，可节约操作成本，易于工业放大和连续化操作。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种从发酵液中分离纯化L-色氨酸的方法。
背景技术
色氨酸是人体内8种必需氨基酸之一，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，分子式C11H12N2O2，分子量204.23，为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度11.4g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱中稳定，在强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚，对人和动物的生长发育、新陈代谢其重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。根据联合国粮农组织测算，世界市场L-色氨酸年需求量约为120万吨以上，截止2009年，全球L-色氨酸产能水平在15000吨以上，随着蛋氨酸、赖氨酸的大量应用，L-色氨酸的市场需求旺盛。
目前生产L-色氨酸的方法主要有：1)有机合成法，该法以天然吲哚为原料，经曼里奇反应进行氨烷基化，然后酯化水解得到产物，该方法生产成本较高；2)天然物质提取法，该方法是对含有L-色氨酸的物质进行水解，由于L-色氨酸本身在蛋白质及谷物植物中含量不高，无法实现工业化生产；3)酶转化法，利用吲哚为前提的酶法合成L-色氨酸是较有效的工业生产方法，但生产成本偏高；4)发酵法，利用葡萄糖蜜为原料，利用优良的L-色氨酸生产菌发酵来生产L-色氨酸。
从原材料的来源和成本的因素考虑，发酵法制取L-色氨酸更具有竞争优势。和其他生物工程产品一样，L-色氨酸在生产成本的构成中，分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比例。因此，如何采取有效措施提高其收率，是目前需要进一步研究解决的问题。
L-色氨酸的传统发酵生产方法主要是采用离子交换法和结晶沉淀法对含氨基酸的料液进行分离和浓缩，而这些方法生产时间较长，只能间歇生产，且生产成本较高，因此改进现有技术及开发新技术势在必行。
膜分离过程是一种纯物理过程，具有无相变化，节能、体积小、可拆分等特点，使膜广泛应用在发酵、制药、植物提取、化工、水处理工艺过程及环保行业中。反胶团萃取法是一种新型、高效的生物活性物质分离技术，其突出优点是：(1)有很高的萃取率和反萃取率并且有选择性；(2)分离和浓缩同时进行，过程简单；(3)溶剂可反复使用，成本低；(4)易于放大和实现工业化生产。采用反胶束萃取技术可对氨基酸的分离实现连续生产，成本相对较低，优于传统方法，在工业化生产方面应用潜力巨大。本发明将膜分离技术和反胶团萃取技术综合运用于分离纯化L-色氨酸，为L-色氨酸的工业化规模生产提供了技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的从发酵液中分离纯化L-色氨酸的工艺，以解决现有技术上存在的问题。本发明具有工艺条件温和、操作简单、便于连续化运行、成本较低、收率高等特点，获得的L-色氨酸产品纯度高，满足企业标准要求。
本发明提供一种从发酵液中分离纯化色氨酸的工艺，包括以下步骤：
(1)发酵液前处理：L-色氨酸发酵液稀释1～2倍，搅拌加热到40～80℃，以孔径为0.05～0.2μm滤膜进行微滤，除去发酵液中的菌体；滤出液经过截留分子量为1000的超滤膜，除去蛋白、大分子杂质和色素；最后用工业盐酸调节pH为2.0～2.5，往滤出液添加KCl或NaCl将离子强度调为0.10～0.15M，作为萃取水相；
(2)制备反胶团溶液：以丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)为表面活性剂，异辛烷为有机溶剂，配制反胶团体系的浓度为40～80mmol/L；
(3)多级逆流萃取：将已进行前处理的发酵滤出液打入多级逆流萃取器，进行三级逆流萃取，有机相∶水相＝1∶1～1∶5，混合时间为15～45min，之后以2500rpm转速离心分离两相，操作温度为15～25℃，取上层有机相溶液；
(4)配制反萃取水相溶液：配置pH为10～11、离子浓度为1.0～1.5mol/L的KCl溶液或NaCl溶液。
(5)多级逆流反萃取：将步骤(3)中获得的萃取相(有机相)打入多级逆流萃取器，进行三级逆流反萃取，有机相∶水相＝1∶1～5∶1，混合时间为15～45min，以转速2500rpm离心分离两相，操作温度为15～25℃，取下层富集L-色氨酸的水相溶液，而有机溶剂回收利用。
(6)纳滤：取步骤(5)中获得的下层水相调pH值至5.8～6.2，进行二次纳滤，一级纳滤截留分子量为300～400，除去残留的表面活性剂AOT，滤出液进行二级纳滤，截留分子量为150，除去小分子盐类。
(7)成品：向纳滤所得的浓缩液中加入等体积的95％乙醇，结晶，离心，干燥，可得精制L-色氨酸。
本发明采用膜分离技术对L-色氨酸发酵液进行前处理，采用微滤膜除菌体和超滤膜除蛋白、大分子杂质和色素，可以避免萃取过程中乳化现象的产生，使反胶团萃取能有效进行。本发明在应用反胶团萃取L-色氨酸时，采用多级逆流的方式，萃取率和反萃率最高可以达到95％以上，同时逆流的方式有效地减少了有机溶剂的使用。本发明在解决表面活性剂残留问题时，再次运用膜分离技术，即进行二次纳滤。本发明综合运用了膜分离技术和反胶团萃取技术从发酵液中分离纯化L-色氨酸，获得的L-色氨酸含量大于98.0％。
本发明提供了一种从发酵液中分离纯化L-色氨酸的方法，具有如下优点：
(1)采用二次膜过滤菌体、除去大分子杂质和色素，有效地解决了萃取过程中乳化问题，相比常规离心方法，降低机器维修费用，降低劳动强度；
(2)本发明应用反胶束萃取技术，工艺简单、快速有效、无毒害，纯化和浓缩可同时完成，萃取剂处理后可循环使用，节约了操作成本，易于工业放大和连续化操作，同时采用多级逆流萃取、反萃取的方式可以获得较高的提取率；
(3)二次纳滤有效除去残留的表面活性剂、盐类，弥补了反胶束萃取的不足，获得高纯度的L-色氨酸。
附图说明
附图为从发酵液中经微滤、超滤、萃取、纳滤和结晶后获得L-色氨酸的工艺路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
将5L浓度为28.4g/L的L-色氨酸发酵液稀释1倍后，用0.2μm的微滤膜于60℃，过滤除菌，得除菌液9.5L。
除菌液经过截留分子量为1000的膜超滤，超滤温度为60℃，除去蛋白、大分子杂质和色素，透过液用盐酸调pH为2.5，添加KCl将离子强度调为0.15M，得到9.3L的萃取水相，准备进行反胶团萃取。
采用离心式萃取器对调好离子浓度和pH值的滤液进行三级逆流萃取，萃取条件为：有机相∶水相＝1∶2，有机相为AOT/异辛烷(AOT浓度为60mmol/L)，进行三级逆流萃取，温度为20℃，混合时间为30min，以2500rpm转速离心分离两相，得含有L-色氨酸的上层有机相溶液4.7L，萃取率为91％。
进行三级逆流反萃取，反萃取条件为：反萃取水相为pH值为11、离子浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，有机相∶水相＝2∶1，取反萃取水相2.4L与上述的4.7L有机相溶液进行三级逆流反萃取，温度为20℃，混合时间为30min，以2500rpm转速离心分离两相，得含有L-色氨酸的下层水相2.5L，反萃取率为89％。
将含L-色氨酸的下层水相调pH值至6.0，再用一定量的去离子水溶解，进行二次纳滤，第二次纳滤后可以大大浓缩L-色氨酸至0.5L，再加入等体积的95％乙醇，结晶、离心、干燥，即得L-色氨酸晶体112.6g，纯度为98.3％。
实施例2
将4L浓度为32.5g/L的L-色氨酸发酵液稀释1倍后，用0.15μm的微滤膜于80℃，过滤除菌，得除菌液7.8L。
除菌液经过截留分子量为1000的膜超滤，超滤温度为60℃，除去蛋白、大分子杂质和色素，透过液用盐酸调pH为2.5，添加KCl将离子强度调为0.15M，得到7.5L的萃取水相，准备进行反胶团萃取。
采用离心式萃取器对调好离子浓度和pH值的滤液进行三级逆流萃取，萃取条件为：有机相∶水相＝1∶5，有机相为AOT/异辛烷(AOT浓度为80mmol/L)，将有机相和水相混合进行三级逆流萃取，温度为15℃，混合时间为45min，以2500rpm转速离心分离两相，得含有L-色氨酸的上层有机相溶液1.56L，萃取率为78％。
进行三级逆流反萃取，反萃取条件为：反萃取水相为pH值为11、离子浓度为1.5mol/L的KCl缓冲液，有机相∶水相＝1∶1，取1.56L反萃取水相与上述的7.5L有机相溶液进行三级逆流反萃取，温度为15℃，混合时间为45min，以2500rpm转速离心分离两相，得含有L-色氨酸的下层水相3.1L，反萃取率为95.5％。
将含L-色氨酸的下层水相调pH值至6.2，再用一定量的去离子水溶解，进行二次纳滤，第二次纳滤后可以大大浓缩L-色氨酸至0.6L，再加入等体积的95％乙醇，结晶、离心、干燥，即得L-色氨酸晶体94.9g，纯度为98.7％。
实施例3
将2L浓度为26g/L的L-色氨酸发酵液稀释1倍后，用0.05μm的微滤膜于40℃过滤除菌，得滤液3.8L。
滤液经过截留分子量为1000的膜超滤，超滤温度为40℃，除去蛋白、大分子杂质和色素，透过液用盐酸调pH为2.0，添加KCl将离子强度调为0.10M，得到3.5L的萃取水相，准备进行反胶团萃取。
采用离心式萃取器对调好pH值和离子浓度的滤液进行三级逆流萃取，萃取条件为：有机相∶水相＝1∶1，有机相为AOT/异辛烷(AOT浓度为40mmol/L)，将有机相和水相等体积比进行三级逆流萃取，温度为15℃，混合时间为15min，以2500rpm转速离心分离两相，得含有L-色氨酸的上层有机相溶液4.8L，萃取率为95％。
进行三级逆流反萃取，反萃取条件为：反萃取水相为pH值为10、离子浓度为1mol/L的KCl缓冲液，有机相∶水相＝5∶1，取0.76L反萃取水相与上述的4.8L有机相溶液进行三级逆流反萃取，温度为15℃，混合时间为15min，以2500rpm转速离心分离两相，得含有L-色氨酸的下层水相0.75L，反萃取率为87.5％。
将含L-色氨酸的下层水相调pH值至5.8，再用一定量的去离子水溶解，进行二次纳滤，第二次纳滤后可以大大浓缩L-色氨酸，再加入等体积的95％乙醇，结晶、离心、干燥，即得L-色氨酸晶体41.2g，纯度为99.6％。
Claims (8)
1.一种从发酵液中分离纯化色氨酸的方法，其特征在于：稀释L-色氨酸发酵液，进行微滤、超滤，调整滤液pH值和离子强度，制备反胶团体系和反萃取水相溶液，经多级逆流萃取、多级逆流反萃取、纳滤和结晶后获得含量高于98％的L-色氨酸。
2.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的L-色氨酸发酵液稀释为原体积的1～2倍，以孔径为0.05～0.2μm滤膜进行微滤，超滤膜截留分子量为1000。
3.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的超滤液用工业盐酸调节pH值为2.0～3.0，添加KCl或NaCl将离子强度调为0.10～0.20M。
4.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的反胶团体系为：以丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)为表面活性剂，异辛烷为有机溶剂，AOT的浓度为40～80mmol/L。
5.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的多级逆流萃取为三级逆流萃取，萃取条件为：有机相∶水相＝1∶1～1∶5，混合时间为15～45min，之后以2500rpm转速离心分离两相，操作温度为15～25℃。
6.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的反萃取水相溶液pH值为10～11、离子浓度为1.0～2.0mol/L的KCl溶液或NaCl溶液。
7.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的多级逆流反萃取为三级逆流反萃取，反萃取条件为：有机相∶水相＝1∶1～5∶1，混合时间为15～45min，以转速2500rpm离心分离两相，操作温度为15～25℃。
8.根据权利要求1所述的分离纯化色氨酸的方法，其特征在于，所述的纳滤为二次纳滤，一级纳滤截留分子量为300～400，滤出液进行二级纳滤，截留分子量为100～200。
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