CN1302175C - 一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法。其特征是对微生物发酵制备的纳米纤维素发酵液分别采用高温灭菌，离心除菌，等电点法与有机溶剂萃取法结合除蛋白，有机溶剂萃取除小分子有机物，对所得产物进行无机盐脱除，色谱分离法除异形多糖后，再对纤维素进行分级即可获得不同粒度的细菌纳米纤维素。本发明所提供的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法工艺简单、生产成本低、生产周期短的，可高收率得到高纯度、粒度可控的细菌纳米纤维素。

Description

一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法
                      技术领域
本发明涉及一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法。
                      背景技术
细菌纳米纤维素是一种由微生物发酵制备的具有纳米尺寸和纳米效应的微生物纤维素，由于在生物发酵液中存在大量活体细菌、蛋白质、无机盐、小分子有机物以及酸性多糖，会直接影响产品的质量，因此分离提纯是细菌纳米纤维素生产的关键环节。
                      发明内容
本发明的目的是提供一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法。
本发明是这样实现的：在生物发酵液中采用煮沸或水蒸汽灭菌进行除菌，然后高速离心分离灭活细菌；通过调整pH值来将生物发酵液中蛋白沉淀，离心分离后，以Sevage法和蛋白酶法结合脱蛋白；利用有机溶剂萃取脱小分子有机物；将离子交换法、半透膜分离法和不同浓度有机溶剂溶解法结合除无机盐，色谱分离法除异形多糖，再对纤维素以超滤膜或有机溶剂沉降进行分级制备不同粒度的细菌纳米纤维素，冷冻干燥即得白色细菌纳米纤维素粉。
本发明所提供的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法工艺简单、生产成本低、生产周期短的，可高收率得到高纯度、粒度可控的细菌纳米纤维素。
                    附图说明
图1是本发明实施例一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法的工艺流程图。
                    具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施作进一步描述：
本发明所提供的分离提纯细菌纳米纤维素的方法包括除菌过程、分离蛋白过程、有机小分子分离过程、脱无机物过程和脱除异形多糖及分级过程。
1除菌过程：将纳米微生物纤维素发酵液煮沸3-15min或通入水蒸汽在40-80℃保温10-60min灭菌，离心去除死菌，得除菌液。
2分离蛋白过程：调节除菌液的pH值至3-12之间，然后离心除掉沉淀的蛋白，再向离心清液按体积比为1∶0.1-1的比例加入正丁醇与氯仿的混合液，于25-50℃萃取蛋白，萃取过程2-5次，直到蛋白完全脱除，保留水相，即为除蛋白液；回收正丁醇和氯仿，循环使用。也可在离心清液中加入固定化蛋白酶在20-50℃处理2-24h，然后离心分离除去蛋白酶，取上层清液，即为除蛋白液。所述正丁醇与氯仿的混合液中按体积比为1∶0.5-4。
3有机小分子分离过程：在除蛋白液中按体积比为1∶0.1-1加入有机溶剂为萃取剂进行萃取有机小分子物质，接着分离保留水相，即得除有机液；回收有机溶剂，循环使用。所述有机溶剂是乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇中的一种或两种以上组合。
4脱无机物过程：采用离子交换法、半透膜分离法和不同浓度有机溶剂溶解法中的一种或二种以上结合除无机盐。所说的离子交换法是将除有机液先后按2-5L/kg的上载量通过阴阳离子交换树脂脱除溶液中的无机盐，连续1-5次重复上述处理，即可得到脱无机液。所说的半透膜分离法是将纳米纤维素水溶液放入半透膜分隔的容器中，另一侧放置5-200倍体积的蒸馏水，放置2-24h，然后以纯净蒸馏水替换平衡后的蒸馏水，重复1-5次即可得到脱无机液。所说的不同浓度有机溶剂溶解法是向除有机液中加入无水乙醇、丙酮(或二者任何浓度组合)沉降纳米纤维素，再以75-90％乙醇、丙酮、甲醇或三者的任何组合，洗涤沉降所得纳米纤维素2-5次，再以蒸馏水溶解纳米纤维素，即可得到脱无机液。
5脱除异形多糖及分级过程：通过DEAE色谱柱分离脱除异形多糖，再将所得纳米纤维素液先后通过50、100、200nm的超滤膜，或以不同浓度乙醇50-100％溶液进行分级处理，得不同粒度的细菌纳米纤维素，冷冻干燥即可得到不同粒度的白色细菌纳米纤维素干粉。
实施例一：
取1L细菌纳米纤维素发酵液，煮沸3min，冷却后离心分离去除死菌；调溶液pH至9，离心取上层清液；按1∶0.3加入正丁醇∶氯仿(1∶3)混合溶液萃取两次后；将上层清液先后通过300g树脂装柱的阴阳离子交换树脂，重复三次；将所得溶液通过DEAE分离柱，收集流出液，再以500mL蒸馏水洗脱，合并流出液和洗脱液，将上述溶液先后以50、100、200nm的超滤膜分离得到50-100nm，100-200nm两种产品，浓缩干燥后各得0.2g白色细菌纳米纤维素粉。
实施例二：
取1L细菌纳米纤维素发酵液，向发酵液通入水蒸汽于80℃30min，冷却后离心分离去除死菌；调溶液pH至8，离心取上层清液；加入2g固定化蛋白酶，反应5h，离心分离，取上清液用无水乙醇沉降纳米纤维素，离心分离，以80％乙醇洗涤3遍，再将纳米纤维素溶解于水溶液中；将所得溶液通过DEAE分离柱，收集流出液，再以500mL蒸馏水洗脱，合并流出液和洗脱液，将上述溶液先后以50、100、200nm的超滤膜分离得到50-100nm，100-200nm两种产品，浓缩干燥后各得0.2g白色细菌纳米纤维素粉。

Claims (7)

1、一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：它包括除菌过程、分离蛋白过程、有机小分子分离过程、脱无机物过程和脱除异形多糖及分级过程；所述除菌过程是将纳米微生物纤维素发酵液煮沸3-15min或通入水蒸汽在40-80℃保温10-60min灭菌，离心去除死菌，得除菌液；所述分离蛋白过程是调节除菌液的pH值至3-12之间，然后离心除掉沉淀的蛋白，再向离心清液按体积比为1∶0.1-1的比例加入正丁醇与氯仿的混合液，于25-50℃萃取蛋白，萃取过程2-5次，直到蛋白完全脱除，保留水相，即为除蛋白液；所述有机小分子分离过程是在除蛋白液中按体积比为1∶0.1-1加入有机溶剂为萃取剂进行萃取有机小分子物质，接着分离保留水相，即得除有机液；所述脱无机物过程是采用离子交换法、半透膜分离法和不同浓度有机溶剂溶解法中的一种或二种以上结合除无机盐；所述脱除异形多糖过程是通过DEAE色谱柱分离脱除异形多糖，再将所得纳米纤维素液先后通过50、100、200nm的超滤膜，或以50-100％乙醇溶液进行分级处理，得不同粒度的细菌纳米纤维素，冷冻干燥即可得到不同粒度的白色细菌纳米纤维素干粉。
2、根据权利要求1所说的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：所述正丁醇与氯仿混合液中正丁醇与氯仿的比例按体积比为1∶0.5至1∶4。
3、根据权利要求1所说的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：在所述分离蛋白过程中也可以在离心清液中加入固定化蛋白酶在20-50℃处理2-24h，然后离心分离除去蛋白酶，取上层清液，即为除蛋白液。
4、根据权利要求1所说的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：所述的有机溶剂是乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇中的一种或两种以上组合。
5、根据权利要求1所说的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：所述的离子交换法是将除有机液先后按2-5L/kg的上载量通过阴阳离子交换树脂脱除溶液中的无机盐，连续1-5次重复上述处理，即可得到脱无机液。
6、根据权利要求1所说的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：所述的半透膜分离法是将纳米纤维素水溶液放入半透膜分隔的容器中，另一侧放置5-200倍体积的蒸馏水，放置2-24h，然后以纯净蒸馏水替换平衡后的蒸馏水，重复1-5次即可得到脱无机液。
7、根据权利要求1所说的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法，其特征在于：所述的不同浓度有机溶剂溶解法是向除有机液中加入无水乙醇、丙酮中的一种或二者任何浓度组合进行沉降纳米纤维素，再以75-90％乙醇、丙酮、甲醇或三者的任何组合，洗涤沉降所得纳米纤维素2-5次，再以蒸馏水溶解纳米纤维素，即可得到脱无机液。
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