CN104804183B - 一种从发酵液中分离纯化γ‑聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离纯化γ‑聚谷氨酸的方法。它利用在低pH值发酵液滤液中只有γ‑聚谷氨酸析出的特性，达到了分离纯化高纯度γ‑聚谷氨酸的目的。具体工艺为：用酸调pH3.0‑6.0，过滤除菌，然后用活性炭脱色，再用酸调pH2.0‑5.0，静置、析出沉淀，固液分离后用纯化水溶解沉淀得高浓度水溶液，最后经过带式干燥、粉碎得到γ‑聚谷氨酸成品。本发明工艺路线新颖、简单；完全不使用有机溶剂，产品无有机溶剂残留；生产成本低，成本降低30％以上；收率高，达到85％以上；产品品质好，纯度达到95％以上，更适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，属于工业微生物技术领域。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物合成的高分子氨基酸聚合物，其分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基(-COOH)，具有极高的吸水保湿性，易于和一些药物结合生成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的医药用高分子材料。其对环境无污染，为绿色生物产品，具极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性。在注重环保、强调可持续发展的今天，这种由生物合成的可降解型功能材料受到人们的青睐，正逐渐地被应用于医药制造，食品加工，蔬菜、水果、海产品的防冻、保鲜，也可开发应用于化妆品工业，烟草、皮革制造业及植物种子保护等许多领域，是一种有极大开发价值和广阔前景的多功能新型生物制品。
1942年Bovarnick等人研究发现芽孢杆菌属细菌能在培养基中积累γ-PGA，由此揭开了微生物发酵法生产γ-PGA的研究历史。目前，利用微生物发酵法生产γ-PGA一直是人们关注的热点，相关研究十分活跃。同化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产γ-PGA具有生产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、目标产物产量较高以及产物分子量适宜、环境友好等优点，已逐步成为研究和生产γ-PGA的主要方法和途径。
通过微生物发酵得到的高粘度γ-聚谷氨酸发酵液，可通过有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法提取γ-聚谷氨酸。(1)有机溶剂沉淀法：一般采用有机溶剂(甲醇或乙醇)沉淀后，通过离心、干燥得到纯品。细胞通过离心从发酵液分离出来，再通过冷冻干燥，加入4倍甲醇放置过夜沉淀离心收集粗品，粗品溶解于蒸馏水，离心去掉不溶性物质。(2)化学沉淀法：化学沉淀法是用饱和硫酸铜、氯化钠溶液代替低级醇类盐析沉淀获取γ-聚谷氨酸。(3)膜分离沉淀法：国内有人选用截留分子量1万的有机膜，取超滤压力0.06MPa进行膜过滤，也取得较好效果。膜分离技术是一种高效节能型分离技术，大多数膜分离过程在常温下进行，无相变，不产生二次污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单高效的从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，这种方法利用在低pH值发酵液滤液中只有γ-聚谷氨酸沉淀析出的特性，达到了分离纯化高纯度γ-聚谷氨酸的目的。本发明以控制pH值沉淀析出γ-聚谷氨酸的提取工艺为特征，解决了有机溶剂沉淀法提取γ-聚谷氨酸造成的有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高且产品有有机溶剂残留的问题。
本发明的技术方案是：一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，发酵液用酸调pH3.0-6.0，过滤除菌，然后用活性炭脱色，再用酸调pH2.0-5.0，静置、析出沉淀，固液分离后用纯化水溶解沉淀得高浓度水溶液，最后经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。具体步骤如下：
(1)发酵液预处理：将发酵液加热至60-100℃(优选70-90℃)，保温0-2h(优选1-2h)，降温至0-60℃后调pH3.0-6.0(优选pH3.5-4.0)，通过板框过滤除掉菌体；然后调pH4.0-6.0，加热至60-100℃(优选80-90℃)，加入活性炭并保温脱色0-1h(优选0.5-1h)，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
(2)析出沉淀：将清滤液用盐酸调pH2.0-5.0(优选pH2.5-3.0)，静置0-24h(优选10-24h)，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.0-5.0(优选pH2.5-3.0)的纯化水(事先用盐酸调好pH)洗至废水无色澄清为止；
(3)将白色粉末加入纯化水，并调pH3.0-6.0(优选pH4.0-4.5)，搅拌溶解，得到浓度为20％以上的溶液；
(4)再经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。
进一步的，所述步骤5)中带式干燥工艺条件为加热区温度为60-95℃，进样速度为10-25L/h，履带速度为5-15cm/min。
其中，步骤(1)中的发酵液是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCCNO.6772为生产菌株，通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸，得到的发酵液，其γ-聚谷氨酸产量≥65g/L。具体发酵过程可见本申请人自己的发明专利申请201210555304.5；申请日：2012.11.02；发明名称：一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法(见权利要求6及实施例5-6)。
本发明的机理为：本发明的发明人发现水可溶性的钠型γ-聚谷氨酸在低pH值条件下可转化为水不溶性的氢型γ-聚谷氨酸，而且，经过处理的清滤液中只有γ-聚谷氨酸沉淀析出，可以得到高纯度的γ-聚谷氨酸。利用这个特性对γ-聚谷氨酸提取工艺进行了改进，使γ-聚谷氨酸在常温、无相变的条件下就被分离出来，收率达到85％以上，得到了纯度达到95％以上、无有机溶剂残留的γ-聚谷氨酸产品。
本发明提供的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，优化了工艺，提高了产品质量，具有如下特点：
1.以控制pH值沉淀析出γ-聚谷氨酸的提取工艺为特征，彻底取代了有机溶剂沉淀法在提取γ-聚谷氨酸工艺中的应用，解决了有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高的问题；
2.控制pH值沉淀析出γ-聚谷氨酸的提取工艺很好的将产品和杂质分开，提高了产品收率和纯度，具有在常温下进行、无相变、不产生二次污染、工艺简便的优势；
3.本发明工艺路线新颖、简单；完全不使用有机溶剂，产品无有机溶剂残留；生产成本低，成本降低30％以上，更适合工业化生产；
4.最终γ-聚谷氨酸产品纯度达95％以上，总收率达85％以上。产品为白色无定型粉末，质量指标已达到化妆品级的要求。
具体实施方式
本实施例的发酵液为采用专利申请201210555304.5中的发酵方法，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC NO.6772为生产菌株，通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸得到的发酵液，其γ-聚谷氨酸产量为67.5g/L。
实施例1：
(1)发酵液预处理：将发酵液加热至90℃，保温1h，降温至60℃后调pH4.0，通过板框过滤除掉菌体，然后调pH5.0，加热至80℃，加入活性炭并保温脱色1h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
(2)析出沉淀：将清滤液用盐酸调pH2.5，静置24h、析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.5的纯化水洗至废水无色澄清为止；
(3)将白色粉末加入纯化水，并调pH4.0，搅拌溶解，得到浓度为30％的溶液；
(4)再经过带式干燥(带式干燥工艺条件为加热区温度为75-85℃，进样速度为15-20L/h，履带速度为10cm/min)、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品，纯度为96.5％，总收率87.5％。
实施例2：
(1)发酵液预处理：将发酵液加热至75℃，保温2h，降温至60℃后调pH3.5，通过板框过滤除掉菌体，然后调pH6.0，加热至85℃，加入活性炭并保温脱色0.5h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
(2)析出沉淀：将清滤液用盐酸调pH 3.0，静置12h、析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH3.0的纯化水洗至废水无色澄清为止；
(3)将白色粉末加入纯化水，并调pH 4.5，搅拌溶解，得到浓度为40％的溶液；
(4)再经过带式干燥(带式干燥工艺条件为加热区温度为75-85℃，进样速度为15-20L/h，履带速度为10cm/min)、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品，纯度为95.9％，总收率88.3％。
实施例3：
(1)发酵液预处理：将发酵液加热至80℃，保温1.5h，降温至60℃后调pH4.0，通过板框过滤除掉菌体，然后调pH6.0，加热至85℃，加入活性炭并保温脱色0.5h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
(2)析出沉淀：将清滤液用盐酸调pH 2.5，静置18h、析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.5的纯化水洗至废水无色澄清为止；
(3)将白色粉末加入纯化水，并调pH 4.5，搅拌溶解，得到浓度为35％的溶液；
(4)再经过带式干燥(带式干燥工艺条件为加热区温度为75-85℃，进样速度为15-20L/h，履带速度为10cm/min)、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品，纯度为96.2％，总收率88.0％。
Claims (6)
1.一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，发酵液用酸调pH3.0-6.0，过滤除菌，然后用活性炭脱色，再用酸调pH2.0-5.0，静置、析出沉淀，固液分离后用纯化水溶解沉淀得浓度为20%以上的高浓度水溶液，最后经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品；
所述发酵液是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）FRD518 CGMCC NO.6772为生产菌株，发酵生产γ-聚谷氨酸得到的发酵液，其γ-聚谷氨酸产量≥65g/L。
2.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，
（1）发酵液预处理：将发酵液加热至60-100℃，保温0-2h，降温至0-60℃后调pH3.0-6.0，通过板框过滤除掉菌体；然后调pH4.0-6.0，加热至60-100℃，加入活性炭并保温脱色0-1h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
（2）析出沉淀：将清滤液用盐酸调pH2.0-5.0，静置0-24h，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.0-5.0的纯化水洗至废水无色澄清为止；
（3）将白色粉末加入纯化水，并调pH3.0-6.0，搅拌溶解，得到浓度为20%以上的溶液；
（4）再经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。
3.如权利要求2所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤（1）发酵液预处理为：将发酵液加热至70-90℃，保温1-2h，降温至0-60℃后调pH3.5-4.0，通过板框过滤除掉菌体；然后调pH4.0-6.0，加热至80-90℃，加入活性炭并保温脱色0.5-1h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液。
4.如权利要求2所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤（2）析出沉淀为：将清滤液用盐酸调pH2.5-3.0，静置10-24h，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.5-3.0的纯化水洗至废水无色澄清为止。
5.如权利要求2所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤（3）白色粉末加入纯化水，并调pH4.0-4.5，搅拌溶解，得到浓度为20%以上的溶液。
6.如权利要求2-5中任意一项所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤（4）中带式干燥工艺条件为：加热区温度为60-95℃，进样速度为10-25L/h，履带速度为5-15cm/min。
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