CN112480394A - 一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分离纯化技术领域,具体涉及一种从高黏(>3000mpa·s)发酵液中分离纯化超高分子量(>2×106)聚γ‑谷氨酸的方法。通过发酵液稀释酸化、板框过滤、循环超滤以及低温干燥的四步单元操作,得到精制白色无定型状聚γ‑谷氨酸,得到的聚γ‑谷氨酸产品分子量大于3×106、纯度高于94.8%、总回收率高于57%。该方法具有工艺简单、成本低、产品超高分子量、产品纯度和回收率高的优点,极具工业化潜力。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域,具体涉及到一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法。
背景技术
聚γ-谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid, PGA)是一种由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键连接而成的微生物源高分子聚合物。由于生产菌种、培养基组分以及发酵条件的差异,PGA分子量表现出多样性,一般在1×105~8×106。PGA具有优良的水溶性、生物兼容性、生物降解性、化学可修饰性等,可广泛用于食品、医药、化妆品、农业以及环保等领域。然而,作为一种高分子聚合物,分子量是影响PGA应用范畴的主要因素。例如,低分子量PGA(<2×105)适合作为药物载体,中等分子量PGA(7×105)适合作为化妆品保湿剂,高分子量PGA(>1×106)适合作为肥料添加剂和絮凝剂,而超高分子量PGA(>2×106)适合作为增稠剂、抗肿瘤剂和免疫系统修复剂。
由于PGA的高分子特性导致其发酵液黏度大,特别是当PGA分子量高于2×106,其发酵液黏度可高达3000mpa·s以上(常温条件下,蜂蜜黏度约为3000mpa·s)。因此,如何从这种高黏度发酵液中分离纯化PGA是限制其广泛应用的关键瓶颈之一。为此国内外研究人员在PGA分离纯化方面开展了一系列工作。检索到相关的文献例如:
1. 申请号为201610329177.5的中国专利,公开了一种从发酵液中高效提取γ-聚谷氨酸的工艺,是利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)选择性沉淀发酵液中的PGA,然后将沉淀物在一定浓度的NaCl溶液中解离溶解、醇析、固液分离以及干燥等操作得到纯度较高的PGA。
2. 申请号为201510193843.2的中国专利,公开了一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法,是用酸调节pH 3~6,过滤除菌,然后用活性炭脱色,再用酸调pH 2~5,静置、析出沉淀,固液分离后用纯化水溶解沉淀得高浓度水溶液,最后经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。
3. 申请号为201310576404.0的中国专利,公开了一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法,是通过降低发酵液黏度后,采用硅藻土和红土混合进行板框过滤除菌,并采用加热与中空纤维膜超滤结合的方式除杂蛋白及大分子活性有机物,活性炭脱色后经纳滤膜重复过滤去除大部分氨基酸及盐离子,采用10kDa和100kDa超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤,最终得到杂质很少的PGA浓溶液,经真空冷冻干燥,得到精制白色PGA,其分子量为8×105。
4. 申请号为201310574779.3的中国专利,公开了一种利用超滤纳滤技术精制生物发酵液中聚谷氨酸的方法,是将发酵液降低黏度后硅藻土过滤除菌,加热结合超滤除杂蛋白及大分子活性有机物,阳离子交换树脂除金属离子及一些带正电荷杂质,脱色后纳滤除小分子氨基酸、离子杂质,超滤分级提取,得到不同分子量(<1×106)的精制聚谷氨酸。
5. 申请号为201210162697.3的中国专利,公开了一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法,采用乙醇提取、第一次脱水与第二次脱水等步骤,沉淀物经干燥后得到纯化>90%的PGA产品,其分子量为8×105。
6. 申请号为201210396366.6的中国专利,公开了一种从发酵液中分离纯化聚谷氨酸的方法,是采用三氯乙酸调pH至3.0~4.0以降低发酵液黏度,然后在发酵液中加入活性炭脱色和硅藻土吸附和抽滤,处理后的发酵液依次经过超滤浓缩和醇析纯化,最后经真空干燥得到纯度≥95%的γ-聚谷氨酸。
7. 申请号为201010184001.8的中国专利,公开了一种发酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法,是将发酵液离心取上清液调pH 2~3,然后加入异丙醇静置沉淀后离心,所得的沉淀物进行真空冷冻干燥后,用蒸馏水溶解,透析去除小分子和有机溶剂,再将透析液用聚乙二醇浓缩,然后将浓缩液真空冷冻干燥得到PGA纯品。
8. 申请号为200910068053.6的中国专利,公开了一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法,是在常温下将聚乙二醇(PEG)1000溶液、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液、未除菌的原发酵液和水制成混合溶液,在3000r/min条件下离心5~10分钟分相,取上相用截留分子量为6000的超滤膜回收PEG,将聚谷氨酸浓缩液冷冻干燥得到聚谷氨酸粉末。
通过分析上述公开的专利文献可见,目前用于PGA分离纯化的方法主要有化学沉淀法、有机溶剂沉淀、双水相萃取法以及膜分离法。其中,化学沉淀法是采用NaCl、CTAB等无机盐通过盐析沉淀PGA,有机溶剂沉淀法是采用乙醇、异丙醇等低级醇来沉淀PGA,而双水相萃取法是采用聚乙二醇等亲水性高分子聚合物与某种盐溶液形成两相来分离PGA。这三种方法存在的主要问题是:(一)均会在分离体系中不同程度的带入无机盐、有机溶剂等外源物质,从而增加除去这些外源物质的工艺操作单元;(二)这些外源物质可能导致PGA分子量降低或变性,从而降低PGA回收率;(三)这些外源物质的使用不仅增加生产成本,而且在生产过程中有机溶剂存在较大安全隐患。为了克服上述问题,不少研究人员对膜分离法进行了研究,取得了一定的成效。但是仍存在一些问题有待解决:(一)分离纯化的PGA分子量均低于1×106,限制了PGA的应用范畴;(二)分离纯化工艺包括发酵液降黏、过滤除菌、加热法除蛋白质等大分子杂质、离子交换树脂法除金属离子、活性炭脱色、纳滤除小分子杂质、超滤浓缩和干燥,操作单元繁琐,处理效率较低,导致工业化应用较为困难。
发明内容
为了解决上述PGA分离纯化存在的问题,本发明的目的在于提供一种从高黏(>3000mpa·s)发酵液中分离纯化超高分子量(>2×106)聚γ-谷氨酸的方法,通过发酵液稀释酸化、板框过滤、循环超滤以及低温干燥的四步单元操作,得到的PGA产品分子量大于3×106、纯度高于94.8%、总回收率高于57%。该方法具有工艺简单、成本低、产品超高分子量、产品纯度和回收率高的优点,极具工业化潜力。
为了实现上述目的,本发明采用如下的技术方案:
一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,包括如下步骤:
(1)发酵液稀释酸化
采用黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量>2×106的聚γ-谷氨酸的高黏发酵液,在发酵罐中用蒸馏水将发酵液稀释至原体积的2~5倍,随后用3 M的HCl调节pH至3~5,在37~45℃、150~250r/min条件下酸化30~90min;
(2)板框过滤
将市售蛭石粉助滤剂以质量百分比含量为1~3%的比例加入至稀释酸化后的发酵液中,400~800目滤布,板框过滤除去菌体和色素,压力为0.2MPa;
(3)循环超滤
采用截留分子量为3×105~5×105的超滤膜对上述处理的清液进行超滤,操作温度25~35℃、操作压力0.1MPa;当超滤浓缩至原始体积的1/3~1/2时,补充蒸馏水至原始体积,重复上述步骤6~9次,最后一次浓缩至原始体积的1/5~1/4;
(4)低温干燥
将上述超滤浓缩液真空低温干燥,得到精制白色无定型状聚γ-谷氨酸。
(5)PGA分子量测定
将分离纯化的PGA溶解于蒸馏水中至浓度为1mg/mL,利用凝胶渗透色谱测定PGA分子量,色谱柱为TSK-GEL G6000PWXL(7.8mm×300mm, 5μm),色谱条件:流动相为水,流速1mL/min,进样量20μL,检测温度30℃,示差检测器。采用不同分子量的聚环氧乙烷作为标准对照品。
经过测定,上述从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,分离纯化得到的聚γ-谷氨酸的分子量大于3×106。
进一步的,上述从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法步骤(1)中所用的发酵液为:以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28为生产菌株,通过发酵罐液体发酵获得的含有超高分子量聚γ-谷氨酸的发酵液,该发酵液的粘度大于3000mpa·s,发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量大于3×106。具体是,按照专利号:ZL201210371783.5,专利名称:枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法中公开的方法,在发酵罐中液体发酵后收集得到的成熟的发酵液,该发酵液中含有超高分子量的聚γ-谷氨酸,其粘度大于3000mpa·s,发酵液中含有的聚γ-谷氨酸的分子量大于3×106。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28的保藏编号为CCTCC NO: M 2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
1、相对于利用膜分离技术从发酵液中分离纯化聚γ-谷氨酸,本发明一种从高黏(>3000mpa·s)发酵液中分离纯化超高分子量(>2×106)聚γ-谷氨酸的方法,通过采用发酵液稀释酸化、板框过滤、循环超滤以及干燥的四步单元操作,实现了超高分子量聚γ-谷氨酸的分离纯化,得到的PGA产品纯度高于94.8%、总回收率高于57%。相对于现有技术,在保证了纯度和回收率不降低的情况下,减少了操作单元,具有工艺简单、成本低、产品超高分子量、产品纯度和回收率高的优点,极具工业化潜力。
2、相对于利用有机溶剂沉淀法从发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸,本发明专利无需使用有机溶剂,不仅避免了有机溶剂可能导致聚γ-谷氨酸变性,从而降低聚γ-谷氨酸回收率的问题,而且减少了生产成本。
3、相对于现有技术需要在发酵液中加入活性炭脱色和硅藻土过滤除菌,本发明采用蛭石粉助滤剂,一步完成了发酵液脱色和除菌,减少了操作单元。超滤操作单元中采用的超滤膜的截留分子量达到3×105~5×105,更容易去除低分子量杂质。
4、本发明一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法适用于分离纯化发酵液黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量大于2×106的聚γ-谷氨酸的高黏发酵液,采用本发明方法进行分离纯化得到的聚γ-谷氨酸(PGA)产品的分子量大于3×106,这种超高分子量PGA适合作为增稠剂、抗肿瘤剂和免疫系统修复剂,有效拓宽了PGA的应用范畴。本发明方法解决了现有从高黏度发酵液中分离纯化PGA存在的操作单元繁琐、处理效率低、成本高、分离纯化得到的PGA分子量低于1×106等问题,具有显著的进步。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤(1)中采用的黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量>2×106的聚γ-谷氨酸的高黏发酵液;
图2为本发明实施例1分离纯化得到的白色的超高分子量聚γ-谷氨酸产品图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,包括如下步骤:
(1)发酵液稀释酸化
采用黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量>2×106的聚γ-谷氨酸的高黏发酵液,在发酵罐中用蒸馏水将发酵液稀释至原体积的2倍,随后用3 M的HCl调节pH至3,在37℃、150r/min条件下酸化30min;
(2)板框过滤
将市售蛭石粉助滤剂以质量百分比含量为1%的比例加入至稀释酸化后的发酵液中,400目滤布,板框过滤除去菌体和色素,压力为0.2MPa;
(3)循环超滤
采用截留分子量为3×105的超滤膜对上述处理的清液进行超滤,操作温度25℃、操作压力0.1MPa;当超滤浓缩至原始体积的1/3时,补充蒸馏水至原始体积,重复上述步骤6次,最后一次浓缩至原始体积的1/5;
(4)低温干燥
将上述超滤浓缩液真空低温干燥,得到精制白色无定型状聚γ-谷氨酸(PGA),经测定,其分子量为3.1×106、纯度达到94.8%、总回收率达到57%。
实施例2
一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,包括如下步骤:
(1)发酵液稀释酸化
采用以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28(保藏编号为CCTCC NO: M2012347,保藏单位:中国典型培养物保藏中心)为生产菌株,通过发酵罐液体发酵获得的含有超高分子量聚γ-谷氨酸的高黏发酵液,该发酵液的黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量>3×106;在发酵罐中用蒸馏水将发酵液稀释至原体积的5倍,随后用3M的HCl调节pH至5,在45℃、250r/min条件下酸化90min;
(2)板框过滤
将市售蛭石粉助滤剂以质量百分比含量为3%的比例加入至稀释酸化后的发酵液中, 800目滤布,板框过滤除去菌体和色素,压力为0.2MPa;
(3)循环超滤
采用截留分子量为5×105的超滤膜对上述处理的清液进行超滤,操作温度35℃、操作压力0.1MPa;当超滤浓缩至原始体积的1/2时,补充蒸馏水至原始体积,重复上述步骤9次,最后一次浓缩至原始体积的1/4;
(4)低温干燥
将上述超滤浓缩液真空低温干燥,得到精制白色无定型状聚γ-谷氨酸(PGA);经测定,其分子量3.9×106、纯度达到96.2%、总回收率达到65%。
实施例3
一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,包括如下步骤:
(1)发酵液稀释酸化
采用黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量>2×106的聚γ-谷氨酸的高黏发酵液,在发酵罐中用蒸馏水将发酵液稀释至原体积的2.5倍,随后用3 M的HCl调节pH至4,在42℃、200r/min条件下酸化60min;
(2)板框过滤
将市售蛭石粉助滤剂以质量百分比含量为2%的比例加入至稀释酸化后的发酵液中,600目滤布,板框过滤除去菌体和色素,压力为0.2MPa;
(3)循环超滤
采用截留分子量为4×105的超滤膜对上述处理的清液进行超滤,操作温度30℃、操作压力0.1MPa;当超滤浓缩至原始体积的1/3时,补充蒸馏水至原始体积,重复上述步骤7次,最后一次浓缩至原始体积的1/5;
(4)低温干燥
将上述超滤浓缩液真空冷冻干燥,得到精制白色无定型状聚γ-谷氨酸(PGA);经测定,其分子量3.3×106、纯度达到95.5%、总回收率达到59%。其中,PGA分子量测定方法为:将分离纯化的PGA溶解于蒸馏水中至浓度为1mg/mL,利用凝胶渗透色谱测定PGA分子量,色谱柱为TSK-GEL G6000PWXL(7.8mm×300mm, 5μm),色谱条件:流动相为水,流速1mL/min,进样量20μL,检测温度30℃,示差检测器;采用不同分子量的聚环氧乙烷作为标准对照品。
Claims (3)
1.一种从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)发酵液稀释酸化
采用黏度>3000mpa·s、发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量>2×106的聚γ-谷氨酸的高黏发酵液,在发酵罐中用蒸馏水将发酵液稀释至原体积的2~5倍,随后用3 M的HCl调节pH至3~5,在37~45℃、150~250r/min条件下酸化30~90min;
(2)板框过滤
将市售蛭石粉助滤剂以质量百分比含量为1~3%的比例加入至稀释酸化后的发酵液中,400~800目滤布,板框过滤除去菌体和色素,压力为0.2MPa;
(3)循环超滤
采用截留分子量为3×105~5×105的超滤膜对上述处理的清液进行超滤,操作温度25~35℃、操作压力0.1MPa;当超滤浓缩至原始体积的1/3~1/2时,补充蒸馏水至原始体积,重复上述步骤6~9次,最后一次浓缩至原始体积的1/5~1/4;
(4)低温干燥
将上述超滤浓缩液真空低温干燥,得到精制白色无定型状聚γ-谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,其特征在于,分离纯化得到的聚γ-谷氨酸的分子量大于3×106。
3.根据权利要求1所述的从高黏发酵液中分离纯化超高分子量聚γ-谷氨酸的方法,其特征在于,进一步的,所述步骤(1)中所用的发酵液为:以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28为生产菌株,通过发酵罐液体发酵获得的含有超高分子量聚γ-谷氨酸的发酵液,该发酵液的粘度大于3000mpa·s,发酵液中所含聚γ-谷氨酸的分子量大于3×106。
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