CN110904012A - 一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ‑聚谷氨酸中的应用，以枯草芽孢杆菌NT‑11（Bacillus subtilis）CCTCC NO:M 2019383为发酵菌株，以谷氨酰胺为前体，同时通过发酵中期对pH、搅拌转速、罐压、通风量的调控，为发酵过程提供更加有益的条件，促进菌体生长并合成超高分子量γ‑聚谷氨酸。发酵液经醇沉、复溶、离心、过滤、再醇沉、干燥等提取工艺获得超高分子量γ‑聚谷氨酸产品，经检测其分子量在3000kDa~6000kDa。本发明工艺简单、易于操作、成本低、产率高，制得的聚谷氨酸纯度较高、分子量明确、超高且相对稳定可控，可实现工业化大规模生产。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用
技术领域
本发明涉及一种用于生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），还涉及一种γ-聚谷氨酸的发酵生产方法，特别涉及一种超高分子量的γ-聚谷氨酸的发酵生产方法，属于γ-聚谷氨酸制备技术领域。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA)是由L-谷氨酸(L-Glutamicacid)、D-谷氨酸(D-Glutamicacid)通过谷氨酸单体α-氨基和γ-羧基交联结合形成的聚氨基酸化合物。它是一种无毒、对环境和人类无害的氨基酸聚合物，其分子量一般在100kDa～1000kDa之间，相当于500~5000个左右的谷氨酸单体。γ-PGA主链上含有大量游离羧基，可发生交联、螯合、衍生化等多种反应，又具有强水溶性、生物相容性、生物降解性，及可食用、无免疫原性、安全无毒、易成膜等特性，因此作为一种新型绿色环保的生物材料，γ-PGA在医药、食品、化妆品、环保、农业等领域均有广泛的应用前景。
γ-PGA的生产方法目前主要有化学合成法、提取法、微生物发酵法等。化学合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，或者先将谷氨酸单体凝聚成谷氨酸二聚体后，再继续由二聚体凝聚成高分子PGA。化学合成法是肽类合成的重要方法，但合成路线长、副产物多、收率低，尤其是含20个氨基酸以上的纯多肽合成，因此对于γ-PGA的生产，此方法没有太大的工业应用价值。提取法是从纳豆等含有γ-PGA的产品中用乙醇将其分离提取出来。由于这些产品中所含的γ-PGA量较少，且提取工艺复杂、成本高，故不宜大规模生产。微生物发酵法是在微生物的生长代谢过程中，γ-PGA作为一种代谢产物在细胞外积累的。与合成法、提取法相比，微生物发酵法具有简单、易于操作、微生物生产快、发酵过程可调控、成本低等优势，是目前研究的热点。
γ-PGA分子量越高，其粘性、吸水与保水性越强，应用市场越广，开发潜力越大。一般γ-PGA的分子量大多为100kDa～1000kDa，少数可达1000kDa~3000kDa。由于分子量越高，发酵液粘度越大，其流变性越难控制，发酵过程中溶解氧供给不足，加上发酵液中γ-PGA分解酶的作用，使γ-PGA的分子量不稳定，多分散性，这给生产3000kDa以上超高分子量γ-PGA产品带来难度。
针对高分子量γ-PGA的发酵生产，目前仅有少数报导。中国专利CN103667412A公开了一种发酵生产高分子量γ-聚谷氨酸的方法，采用天津短杆菌和地衣芽孢杆菌混合发酵，由天津短杆菌发酵合成的谷氨酸可作为地衣芽孢杆菌合成γ-PGA的前体，可以在培养基中不添加谷氨酸，缩短发酵时间，提高γ-PGA生产强度，降低生产成本。其缺点在于产品的分子量仅750kDa~1500kDa，且多菌种混合发酵工艺复杂，两菌种协调生长时发酵条件不易控制，优势菌种在发酵过程中调控困难，产率不稳定，若在工业中放大生产，还需进一步研究。
中国专利CN103710404B公开了一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，以地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3336为出发菌株，通过对发酵过程中通风、转速、温度的调控，特别是发酵后期依靠流加葡萄糖、氯化钙、硫酸锰、硫酸镁等料液，控制发酵pH并增加培养基离子强度，从而得到分子量1000kDa~4000kDa的γ-PGA，但是此方法所得产品的分子量范围仍分散且偏小，在一定程度上无法满足γ-PGA在高分子材料技术领域的应用。
中国专利CN101597627B公开了一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于利用纳豆菌通过营养枯竭和外界环境胁迫的方法提高γ-PGA的产率至31.8g/L，其分子量可达3000kDa以上，提取工艺复杂，无法实现大规模生产。
中国专利CN1324143C公开了一种具有超高分子量的γ-聚谷氨酸及其使用方法，从韩国发酵纳豆食品中分离了一株枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT 0697BP)，其在含L-谷氨酸的培养基中，可发酵得到分子量大于5000KDa的PGA。该专利中的PGA含量较低，还需要透析步骤，工艺复杂，不利于大规模生产。且该专利分子量检测使用的是GPC法，该方法分子量的检测范围较小，准确性和稳定性不如多角度激光光散射法，且与多角度激光光散射法相比，测得的分子量偏高。
目前，国内外对低分子量γ-PGA（1000kDa以下）的发酵生产工艺及产率进行了广泛的研究，但由于γ-PGA发酵液高粘性、分子量分散性、产量不稳定性、转化率低等缺点，导致对高分子量γ-PGA，尤其是超高分子量（3000kDa~6000kDa）γ-PGA的研究较少，严重阻碍了γ-PGA在高分子材料技术领域的发展和应用。
发明内容
针对现有技术中对于高分子量尤其是超高分子量γ-PGA研究报道较少的不足，本发明提供了一株性能更佳的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株，该枯草芽孢杆菌能够生产分子量更高的γ-PGA。
本发明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11菌株已于2019年5月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏单位地址为：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2019383。经试验验证，本发明菌株发酵得到的γ-聚谷氨酸的分子量更高，通过与发酵方法的配合，可以得到3000kDa~6000kDa超高分子量的γ-聚谷氨酸。
本发明枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO：M 2019383是从富含有机物的果园土壤中筛选得到的，经过16srRNA鉴定，其为枯草芽孢杆菌，16srRNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO：M 2019383在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
本发明还提供了一种γ-聚谷氨酸的发酵生产方法，该方法以上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得γ-聚谷氨酸。
γ-PGA的合成在微生物的生长代谢过程中是一个极为复杂的过程，研究发现，枯草芽孢杆菌在合成γ-PGA时，若谷氨酸盐缺乏，则TCA循环中的α-酮戊二酸和NH4 +经谷氨酸脱氢酶催化先合成L-谷氨酸，再由L-谷氨酸经L-谷氨酰胺合成酶的催化下生成L-谷氨酰胺，随后L-谷氨酰胺在L-谷丙转氨酶、消旋酶、D-谷丙转氨酶的催化下生成D-谷氨酸，最后D-谷氨酸和L-谷氨酸交联合成γ-PGA。因此推断，谷氨酰胺可作为γ-PGA合成过程中的高效营养物质，促进枯草芽孢杆菌合成高分子γ-PGA。经验证，谷氨酰胺确实能够促进枯草芽孢杆菌合成高分子γ-PGA。在此基础上，本发明进一步对发酵所用的培养基和发酵培养的步骤和条件进行了优选，得到了一种优化的γ-聚谷氨酸发酵生产方法。
进一步的，γ-聚谷氨酸发酵生产包括菌种活化、种子培养和发酵培养的步骤，其中发酵培养时，优选采用以下方式：将种子液接种于发酵培养基中，通气搅拌进行发酵培养，当发酵液pH下降至5.5~6.0时，控制pH一直维持在5.5~6.0，同时向发酵培养基中开始补加氯化钠和谷氨酰胺，使氯化钠在发酵培养基中的终浓度保持在1~3g/L、谷氨酰胺在发酵培养基中的终浓度保持在3~5g/L，直至发酵结束。通过在发酵过程中流加谷氨酰胺，可以提高合成γ-PGA酶促反应效率，使得胞内积累更多的谷氨酸，这样更有利于超高分子量γ-PGA的形成。
进一步的，上述发酵培养方法中，当发酵液pH下降至5.5~6.0时，向发酵体系中加入碱，使后续发酵pH一直保持在5.5~6.0的范围内。所述碱优选为氢氧化钠，优选以水溶液的形式加入。
进一步的，上述发酵培养方法中，随着时间的进行，体系的pH在逐渐下降。在发酵培养的初期，在300~600r/min的搅拌转速、0.01~0.03Mpa的罐压、0.5~1.0vvm的通气量、35~38℃的温度下进行发酵，当pH下降至5.5~6.0时，控制pH一直维持在5.5~6.0，同时调高搅拌转速、罐压和通气量，使搅拌转速为600~1000r/min、罐压为0.03~0.05Mpa、通气量为1.0~1.5vvm，直至发酵结束。所述发酵结束即为培养基中无残糖。通过控制pH、增大搅拌转速、提高罐压、加大通气量等方式，来维持菌体生长和合成γ-PGA的适宜pH值、增大发酵液中的溶解氧浓度，这样更有利于超高分子量γ-PGA的形成。
进一步的，上述发酵培养方法中，种子液的接种量为5~15wt%。
此外，目前发酵所用的培养基大多以谷氨酸钠为底物，这导致培养基中钠离子浓度较高，渗透压较高，高的渗透压不利于菌种的生长。本发明发酵培养基优选由以下成分组成：葡萄糖80~120g/L、谷氨酰胺30~80g/L、蛋白胨5~25g/L、硫酸镁0.1~1g/L、磷酸氢二钾0.5~2g/L、pH6.5~8.0，水余量。该发酵培养基中以谷氨酰胺作为底物，不含钠离子，更利于发酵初期菌种的生长。
进一步的，上述发酵生产方法中，所述菌种活化采用下述方式进行：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌菌株划线接种于平板培养基上，35~38℃活化培养20~48h，待长出单菌落后，挑取单菌落接种于试管斜面培养基上，35~38℃活化培养20~48h，得到活化完全的试管斜面种子。其中，平板培养基及试管斜面培养基的组成均为：葡萄糖5~20g/L、谷氨酸钠5~20g/L、蛋白胨5~20g/L、硫酸镁0.1~1g/L、磷酸氢二钾0.1~1g/L、琼脂18~22g/L、pH6.0~8.0、水余量。
进一步的，上述发酵生产方法中，所述种子培养采用下述方式进行：在无菌条件下，挑取活化完全的试管斜面种子，接种于种子培养基中，在150~200r/min的转速、35~38℃的温度下震荡培养20~40h，得种子液。其中，种子培养基的组成为：葡萄糖5~20g/L、谷氨酸钠5~20g/L、蛋白胨5~20g/L、硫酸镁0.1~0.5g/L、磷酸氢二钾0.1~0.5g/L、pH6.0~8.0、水余量。
进一步的，上述发酵生产方法中，还可以包括对发酵液进行处理得到γ-聚谷氨酸产品的步骤，发酵培养所得的发酵液可以通过以下方法得到γ-聚谷氨酸产品：将发酵液醇沉，所得沉淀用水溶解，离心取上清液，调整上清液pH为4~5，在50~80℃加热吸附1~2h，然后过滤除杂，所得滤液醇沉、干燥，得γ-聚谷氨酸粉末。
更优选的，本发明还提供了一种具体的超高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，包括以下步骤：
1）菌种活化：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，将菌种进行活化，得活化菌种；
2）种子液制备：将活化的菌种加入种子培养基中进行培养，得种子液。
3）发酵培养：将种子液接种于发酵培养基中，在300~600r/min的搅拌转速、0.01~0.03Mpa的罐压、0.5~1.0vvm的通气量、35~38℃的温度下进行发酵，随着发酵的进行，pH逐渐降低，当pH下降至5.5~6.0时，加碱保持体系的pH一直为5.5~6.0，调节搅拌转速为600~1000r/min、罐压为0.03~0.05Mpa、通气量为1.0~1.5vvm，并且从pH下降至5.5~6.0开始补加氯化钠和谷氨酰胺，使氯化钠在发酵培养基中的终浓度保持在1~3g/L、谷氨酰胺在发酵培养基中的终浓度保持在3~5g/L，直至发酵结束。
4）发酵结束后，对发酵液进行处理，得到超高分子量γ-PGA。
上述超高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法中，菌种活化的条件、活化所用的培养基、种子培养的步骤、种子培养基、发酵培养基、发酵液的处理方式均如前面所述。
进一步的，本发明所述的超高分子量，指的是γ-PGA的分子量大于等于3000kDa。采用本发明方法得到的γ-PGA纯度高，在90%以上，经多角度激光光散射法检测，分子量可达3000kDa~6000kDa。
本发明采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO: M 2019383为发酵菌株，可以得到高分子量γ-PGA。进一步的结合发酵培养基、发酵条件、补加方式的改进可以得到超高分子量（3000kDa~6000kDa）的γ-PGA。该工艺操作简便、流程短、生产成本低、生产效率高，所得γ-PGA产品分子量高、分子量范围明确、稳定可控、纯度大于90%，可实现工业化大规模生产。与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO: M 2019383为发酵菌株，该菌株更有利于产生高分子量的γ-PGA。
2.在发酵中期pH下降至5.5~6.0时，发酵液粘度明显不断增大，此时通过控制pH维持在5.5~6.0、增大搅拌转速、提高罐压、加大通气量等方式来维持菌体生长和合成γ-PGA的适宜pH值，增大了发酵液中的溶解氧浓度，促进了超高分子量γ-PGA的形成。
3.发酵初期以谷氨酰胺为底物，发酵中后期补加谷氨酰胺，以谷氨酰胺作为合成γ-PGA的前体，谷氨酰胺有利于超高分子量γ-PGA的形成。与以谷氨酸钠为前体相比，本发明发酵培养基中不含钠离子，有利于菌种的生长，谷氨酰胺可以直接转化为γ-PGA，省掉了谷氨酸转化为谷氨酰胺的过程，提高了合成γ-PGA酶促反应效率，提高了谷氨酸在菌体细胞内的积累，更利于制备超高分子量γ-PGA。
微生物保藏信息
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11，已于2019年5月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏单位地址为：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019383。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下述实施例中，如无特别说明，所述浓度均为质量百分浓度。
下述实施例中，采用多角度激光光散射法测γ-PGA分子量，方法如下：
1.仪器试剂：
高效液相色谱仪 Agilent-1100
多角度激光光散射仪 DAWN EOS
示差检测器 Optilab Rex
电子天平 PL602S、AL104
氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
叠氮钠（分析纯） 天津百世化工有限公司
2.色谱条件：
色 谱 柱：TSKgel GMPWXL
流 动 相：0.2mol/L氯化钠溶液
流 速：0.6mL/min
进 样 量：500µL
检测波长：658nm
柱 温：35℃
3.检测方法：
（1）试剂配制
流动相：精密称取氯化钠11.7g，叠氮钠0.2g，加纯化水使其溶解并定容至1000mL，0.22µm滤膜过滤，即为0.2mol/L氯化钠溶液。
供试液：精密称取待测样品（γ-PGA）0.05g，加流动相溶解并稀释至10mL，摇匀，室温放置，作为供试品溶液。
（2）样品测定
取供试样品溶液500µL，注入液相色谱仪，平行进样2次，分别记录色谱图。ASTRA软件计算供试样品的分子量及分子量分布。
实施例1菌种的筛选、分离纯化及鉴定
本发明枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO：M 2019383是从富含有机物的果园土壤中筛选得到的，其具体获取过程如下：
（1）供筛样品的采集：从树林、农田、果园、菜园等富含有机质土壤的地点用无菌铲刮取适量土样，置于无菌玻璃瓶中；从市售纳豆、豆瓣酱、豆豉、酱油等产品中用无菌药匙或滴管采集适量样品，置于无菌玻璃瓶中。
（2）菌种初筛及分离纯化：
将采集的样品用无菌水适当溶解或稀释，无菌滤纸过滤，去除大颗粒杂质后，吸取1~2mL滤液，涂布于完全培养基平板中，培养一段时间，长出微生物菌落。
观察平板中菌落的形态，挑选表面湿润、粘稠、拉丝的菌落，进行平板划线分离纯化，获得待验菌种单菌落。对待验菌种进行液体培养，检测其代谢产物中是否含有γ-聚谷氨酸，选择可产生γ-聚谷氨酸的菌种，进行复筛。
（3）菌种复筛：为初筛所得菌种提供适宜的培养条件，进行摇瓶发酵培养，筛选产生γ-聚谷氨酸分子量最高的菌种，即为目标菌种。
（4）菌种鉴定：所得目标菌种经第三方检测机构（生工生物工程（上海）股份有限公司）16srRNA鉴定，其为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11。
实施例2
（1）菌种活化：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO：M 2019383划线接种于平板培养基上，35℃活化培养48h，挑取单菌落接种于试管斜面培养基上，35℃继续活化培养48h，得到活化完全的试管斜面种子。
平板培养基及试管斜面培养基的组成为：葡萄糖5g/L、谷氨酸钠5/L、蛋白胨20g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾1g/L、琼脂18g/L、pH6.0，水余量。
（2）种子液制备：在无菌条件下，挑取活化完全的试管斜面种子接种于装有150mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，150r/min、35℃震荡培养40h，得种子液。
液体种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、谷氨酸钠5g/L、蛋白胨20g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、pH6.0、水余量。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以10wt%的接种量接种于装有3.8L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速400r/min，罐压0.01MPa，通气量0.5vvm，温度35℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至5.5时，调节搅拌转速至600r/min，罐压至0.03MPa，通气量至1.0vvm，同时从pH降至5.5时开始按最终浓度分别为1g/L、3g/L向培养基中补加氯化钠、谷氨酰胺，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在5.5，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L、谷氨酰胺30g/L、蛋白胨25g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾2g/L、初始pH6.5，水余量。
（4）发酵液的提取：所得发酵液在搅拌状态下缓慢流加乙醇，至乙醇流加量为发酵液体积的3倍，析出粗品γ-PGA后，8000r/min离心，取沉淀用3倍发酵液体积的蒸馏水再溶解，8000r/min离心，取上清液，调节pH 5.0后，70℃加热吸附1h，然后逐级过滤，得澄清透明的超高分子量γ-PGA水溶液，γ-PGA产量为33.6g/L，该水溶液再经醇沉、干燥后，得超高分子量γ-PGA粉末产品。经多角度激光光散射法检测，其分子量为3102kDa。
实施例3
（1）菌种活化：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO: M 2019383划线接种于特定平板培养基上，36℃活化培养20h，挑取单菌落接种于特定试管斜面培养基上，36℃继续活化培养20h，得到活化完全的试管斜面种子。
平板培养基及试管斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L、谷氨酸钠10g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、琼脂20g/L、pH6.5，水余量。
（2）种子液制备：在无菌条件下，挑取活化完全的试管斜面种子接种于装有180mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，200r/min、36℃震荡培养20h，得种子液。
液体种子培养基组成为：葡萄糖15g/L、谷氨酸钠10g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、pH6.5、水余量。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以5wt%的接种量接种于装有3.2L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速500r/min，罐压0.01MPa，通气量0.8vvm，温度36℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至5.7时，调节搅拌转速至800r/min，罐压至0.04MPa，通气量至1.4vvm，同时从pH降至5.7时开始按最终浓度分别为2.5g/L、3g/L向培养基中补加氯化钠、谷氨酰胺，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在5.7，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成为：葡萄糖110g/L、谷氨酰胺50g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸氢二钾1.8g/L、初始pH 7.5，水余量。
（4）发酵液的提取工艺为：发酵液在搅拌状态下缓慢流加乙醇，至乙醇流加量为发酵液体积的4倍，析出粗品γ-PGA后，10000r/min离心，取沉淀用4倍发酵液体积的蒸馏水再溶解，10000r/min离心，取上清液，调节pH4.7后，60℃加热吸附2h，然后逐级过滤，得澄清透明的超高分子量γ-PGA水溶液，γ-PGA产量为35g/L，该水溶液再经醇沉、干燥后，得超高分子量γ-PGA粉末产品。经多角度激光光散射法检测，其分子量为3679kDa。
实施例4
（1）菌种活化：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO: M 2019383划线接种于特定平板培养基上，37℃活化培养30h，挑取单菌落接种于特定试管斜面培养基上，37℃继续活化培养30h，得到活化完全的试管斜面种子。
平板培养基及试管斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L、谷氨酸钠10g/L、蛋白胨7.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、琼脂19g/L、pH7.1，水余量。
（2）种子液制备：在无菌条件下，挑取活化完全的试管斜面种子接种于装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，200r/min、37℃震荡培养24h，得种子液。
液体种子培养基组成为：葡萄糖10g/L、谷氨酸钠10g/L、蛋白胨7.5g/L、硫酸镁0.4g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、pH7.0、水余量。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以15wt%的接种量接种于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速600r/min，罐压0.03MPa，通气量0.6vvm，温度37℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至6.0时，调节搅拌转速至800r/min，罐压至0.05MPa，通气量至1.5vvm，同时从pH降至5.5时开始按最终浓度分别为2g/L、5g/L向培养基中补加氯化钠、谷氨酰胺，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在6.0，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成为：葡萄糖90g/L、谷氨酰胺45g/L、蛋白胨22.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、初始pH 7.0，水余量。
（4）发酵液的提取工艺为：发酵液在搅拌状态下缓慢流加乙醇，至乙醇流加量为发酵液体积的4倍，析出粗品γ-PGA后，10000r/min离心，取沉淀用4倍发酵液体积的蒸馏水再溶解，10000r/min离心，取上清液，调节pH4.5后，80℃加热吸附2h，然后逐级过滤，得澄清透明的超高分子量γ-PGA水溶液，γ-PGA产量为39.4g/L，该水溶液再经醇沉、干燥后，得超高分子量γ-PGA粉末产品。经多角度激光光散射法检测，其分子量为5969kDa。
实施例5
（1）菌种活化：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO: M 2019383划线接种于特定平板培养基上，38℃活化培养36h，挑取单菌落接种于特定试管斜面培养基上，38℃继续活化培养36h，得到活化完全的试管斜面种子。
平板培养基及试管斜面培养基组成为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠20/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、琼脂22g/L、pH8.0、水余量。
（2）种子液制备：在无菌条件下，挑取活化完全的试管斜面种子接种于装有180mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，180r/min、38℃震荡培养36h，得种子液。
液体种子培养基组成为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠20g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、pH8.0、水余量。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以12wt%的接种量接种于装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速500r/min，罐压0.02MPa，通气量0.6vvm，温度38℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至5.8时，调节搅拌转速至800r/min，罐压至0.04MPa，通气量至1.2vvm，同时从pH降至5.8时开始按最终浓度均为3g/L向培养基中补加氯化钠和谷氨酰胺，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在5.8，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L、谷氨酰胺80g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、初始pH8.0、水余量。
（4）发酵液的提取工艺为：发酵液在搅拌状态下缓慢流加乙醇，至乙醇流加量为发酵液体积的4倍，析出粗品γ-PGA后，10000r/min离心，取沉淀用3倍发酵液体积的蒸馏水再溶解， 8000r/min离心，取上清液，调节pH4.8后，80℃加热吸附2h，然后逐级过滤，得澄清透明的超高分子量γ-PGA水溶液，γ-PGA产量为35.2g/L，该水溶液再经醇沉、干燥后，得超高分子量γ-PGA粉末产品。经多角度激光光散射法检测，其分子量为4188kDa。
对比例1
1、在市售的多种γ-PGA固体粉末产品中，任意选择2种，标记为样品a、b。
2、分别采用多角度激光光散射法和GPC法测γ-PGA的分子量，其中多角度激光光散射法同上，GPC法方法如下：
1.仪器试剂：
高效液相色谱仪 Agilent-1260
电子天平 PL602S、AL104
硫酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
乙酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
葡聚糖对照品 Sigma
2.色谱条件：
凝 胶 柱：SB-806 HQ（8.0 mm × 300 mm）
检 测 器：紫外检测器
流 动 相：0.2mol/L硫酸钠溶液
流 速：1.0mL/min
进 样 量：20µL
检测波长：210nm
温 度：35℃
3.检测方法：
（1）试剂配制
硫酸钠溶液（0.2mol/L）：精密称取28.412g硫酸钠溶解并定容至1L，用乙酸调节pH至4.0，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，超声波脱气15min。
葡聚糖对照品溶液：以葡聚糖为分子量对照品，分别精密称取4种不同分子量葡聚糖对照品（150kDa、270kDa、410kDa、670kDa）各0.05g，溶解转移至50mL容量瓶中定容。
（2）标准曲线的绘制
将4个不同分子量的葡聚糖对照品溶液分别经0.22µm微孔滤膜过滤。依次将上述样品注入凝胶柱中，进样量为20µL，测定出峰时间，以葡聚糖对照品出峰时间为为横坐标，其分子量为纵坐标绘制分子量标准曲线。
（3）试样测定
精密称取0.1gγ-PGA试样，溶解并定容至100mL容量瓶中。配好的试样溶液经0.22µm微孔滤膜过滤，进样量为20µL，进行GPC检测，记录出峰时间，并根据分子量标准曲线查得试样中PGA的分子量。
（4）允许差
平行测定结果允许相对偏差不得大于2.0%，取平行测定结果的算术平均值作为测定结果。
3、结果显示，采用多角度激光光散射法检测，所得样品a、b的分子量分别为：a）309.9kDa、b）193.5kDa，而采用GPC法检测，所得样品a、b的分子量分别为：a）860kDa、b）583kDa。
由以上检测结果可以看出，采用GPC法所得的分子量明显高于多角度激光光散射法所得的分子量。
对比例2
（1）菌种活化：同实施例2。
平板培养基及试管斜面培养基组成为：同实施例2。
（2）种子液制备：同实施例2。
液体种子培养基组成为：同实施例2。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以10wt%的接种量接种于装有3.8L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速400r/min，罐压0.01MPa，通气量0.5vvm，温度35℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至5.5时，调节搅拌转速至600r/min，罐压至0.03MPa，通气量至1.0vvm，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在5.5，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L、谷氨酸钠30g/L、蛋白胨25g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾2g/L、初始pH6.5，水余量。
（4）发酵液的提取工艺：同实施例2。γ-PGA产量为25.9g/L。经多角度激光光散射法检测，其分子量为2105kDa。
对比例3
（1）菌种活化：同实施例2。
平板培养基及试管斜面培养基组成为：同实施例2。
（2）种子液制备：同实施例2。
液体种子培养基组成为：同实施例2。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以10wt%的接种量接种于装有3.8L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速400r/min，罐压0.01MPa，通气量0.5vvm，温度35℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至5.5时，按最终浓度分别为1g/L、3g/L向培养基中补加氯化钠、谷氨酰胺，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在5.5，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成：同实施例2。
（4）发酵液的提取工艺：同实施例2。γ-PGA产量为27.2g/L。经多角度激光光散射法检测，其分子量为2243kDa。
对比例4
（1）菌种活化：同实施例2。
平板培养基及试管斜面培养基组成为：同实施例2。
（2）种子液制备：同实施例2。
液体种子培养基组成为：同实施例2。
（3）发酵培养：将培养好的种子液以10wt%的接种量接种于装有3.8L发酵培养基的5L发酵罐中，初始搅拌转速400r/min，罐压0.01MPa，通气量0.5vvm，温度35℃，进行发酵培养；随发酵时间的延长，pH不断下降，当pH降至5.5时，调节搅拌转速至600r/min，罐压至0.03MPa，通气量至1.0vvm，同时从pH降至5.5时开始按最终浓度分别为1g/L、3g/L向培养基中补加氯化钠、谷氨酸钠，此后用30%~40%的氢氧化钠溶液调控pH一直维持在5.5，继续发酵直至培养基中无残糖。
发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L、谷氨酸钠30g/L、蛋白胨25g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾2g/L、初始pH6.5，水余量。
（4）发酵液的提取工艺：同实施例2。γ-PGA产量为28g/L。经多角度激光光散射法检测，其分子量为2411kDa。
对比例5
任意选择2种市售可生产γ-PGA的菌株，具体如下：
菌种A：枯草芽孢杆菌，BNCC190341，北京北纳创联生物技术研究院。
菌种B：枯草芽孢杆菌，CICC20643，中国工业微生物菌种保藏管理中心。
分别以菌种A、B代替本发明枯草芽孢杆菌NT-11 CCTCC NO: M 2019383，采用实施例2所述的方法发酵生产γ-PGA。菌种A所得γ-PGA产量为26.2g/L，经多角度激光光散射法检测分子量为1765kDa，菌种B所得γ-PGA产量为23.4g/L，经多角度激光光散射法检测分子量为1864kDa。
序列表
<110> 华熙生物科技股份有限公司、山东华熙海御生物医药有限公司
<120> 一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1487
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisNT-11 CCTCC NO： M 2019383)
<400> 1
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag 60
cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga 120
ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca 180
aacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg 240
gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360
tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc 420
tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac 480
cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540
tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc 600
ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg 660
gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 720
actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta 840
gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 900
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960
gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg 1020
ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1140
gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt 1260
aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320
gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt 1440
aggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga agtcgta 1487

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11，其特征是：保藏号为CCTCC NO：M2019383。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO：M 2019383在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
3.一种γ-聚谷氨酸的发酵生产方法，其特征是：以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得γ-聚谷氨酸。
4.一种γ-聚谷氨酸的发酵生产方法，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11CCTCC NO：M 2019383为发酵菌种，包括菌种活化、种子培养和发酵培养的步骤，其特征是：发酵培养时，将种子液接种于发酵培养基中，通气搅拌进行发酵培养，当发酵液pH下降至5.5 ~6.0时，控制pH一直维持在5.5~6.0，同时向发酵培养基中开始补加氯化钠和谷氨酰胺，使氯化钠在发酵培养基中的终浓度保持在1~3g/L、谷氨酰胺在发酵培养基中的终浓度保持在3~5g/L，直至发酵结束。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述发酵培养基的组成为：葡萄糖80~120g/L、谷氨酰胺30~80g/L、蛋白胨5~25g/L、硫酸镁0.1~1g/L、磷酸氢二钾0.5~2g/L、pH6.5~8.0，水余量。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是：当发酵液pH下降至5.5~6.0时，向发酵体系中加入碱，使后续发酵pH一直保持在5.5~6.0的范围内。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是：发酵培养初期，在300~600r/min的搅拌转速、0.01~0.03Mpa的罐压、0.5~1.0vvm的通气量、35~38℃的温度下进行发酵，当pH下降至5.5~6.0时，控制pH一直维持在5.5~6.0，同时调高搅拌转速、罐压和通气量，使搅拌转速为600~1000r/min、罐压为0.03~0.05Mpa、通气量为1.0~1.5vvm，直至发酵结束。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征是：种子液的接种量为5~15wt%。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征是：菌种活化和种子培养包括以下步骤：
菌种活化：在无菌条件下，将枯草芽孢杆菌菌株划线接种于平板培养基上，35~38℃活化培养20~48h，待长出单菌落后，挑取单菌落接种于试管斜面培养基上，35~38℃活化培养20~48h，得到活化完全的试管斜面种子；
种子培养：在无菌条件下，挑取活化完全的试管斜面种子，接种于种子培养基中，在150~200r/min 的转速、35~38℃的温度下震荡培养20~40h，得种子液；
优选的，平板培养基及试管斜面培养基的组成均为：葡萄糖5~20g/L、谷氨酸钠5~20g/L、蛋白胨5~20g/L、硫酸镁0.1~1g/L、磷酸氢二钾0.1~1g/L、琼脂18~22g/L、pH6.0~8.0、水余量；
优选的，种子培养基的组成为：葡萄糖5~20g/L、谷氨酸钠5~20g/L、蛋白胨5~20g/L、硫酸镁0.1~0.5g/L、磷酸氢二钾0.1~0.5g/L、pH6.0~8.0、水余量。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征是：发酵培养所得的发酵液通过以下方法得到γ-聚谷氨酸产品：将发酵液醇沉，所得沉淀用水溶解，离心取上清液，调整上清液pH为4~5，在50~80℃加热吸附1~2h，然后过滤除杂，所得滤液醇沉、干燥，得γ-聚谷氨酸粉末。
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