CN111904894B - 超高分子量γ-PGA或其盐在化妆品中的应用及化妆品组合物 - Google Patents

超高分子量γ-PGA或其盐在化妆品中的应用及化妆品组合物 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种超高分子量的γ‑聚谷氨酸或其盐在化妆品中的应用。所述超高分子量的γ‑聚谷氨酸具有大于3000kDa的超高分子量，其具有超强的保湿能力、活性好、稳定性好、易于操作，可显著提高皮肤天然保湿因子PCA、UCA的表达量，以及提高皮肤屏障相关蛋白LOR、FLG、TGM1及IVL的含量。

Description

超高分子量γ-PGA或其盐在化妆品中的应用及化妆品组合物
技术领域
本申请涉及化妆品应用领域，具体涉及一种超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐在化妆品中的应用，及含有超高分子量γ-聚谷氨酸或其盐的化妆品组合物。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA)是由L-谷氨酸(L-Glutamicacid)、D-谷氨酸(D-Glutamicacid)通过谷氨酸单体α-氨基和γ-羧基交联结合形成的聚氨基酸化合物。它是一种无毒、对环境和人类无害的氨基酸聚合物，γ-PGA主链上含有大量游离羧基，可发生交联、螯合、衍生化等多种反应，又具有强水溶性、生物相容性、生物降解性，及可食用、无免疫原性、安全无毒、易成膜等特性，因此作为一种新型绿色环保的生物材料，γ-PGA在医药、食品、化妆品、环保、农业等领域均有广泛的应用前景。
目前市售的γ-聚谷氨酸分子量通常在100kDa～1000kDa，相当于500～5000个左右的谷氨酸单体。少数γ-聚谷氨酸分子量可达1000kDa～3000kDa，分子量大于3000kDa的γ-聚谷氨酸的研究报道更是罕见，并且，尚无关于大于3000kDa的γ-聚谷氨酸的应用研究，由于γ-聚谷氨酸是由谷氨酸缩合而成，分子量越大其结构中所含有的羧基越多，其保湿锁水能力越强，所以分子量在3000kDa以上的γ-聚谷氨酸有着超强保湿能力，而这种作用正迎合了化妆品中的功效，特别是对于肌肤保持水分作用尤为重要。
皮肤是人体最大的器官，皮肤物理屏障在皮肤抵御外环境，维持内环境稳态，防止皮肤水分散失等功能方面发挥主要作用。皮肤物理屏障的结构基础是角质层的“砖-灰”结构。“砖”结构主要由角质层细胞及CE(Cornified envelope，胞内蛋白膜套)构成，“灰”结构主要由脂质胞封构成，“砖-灰”结构的本质是角质层蛋白膜套与脂质膜套的交联，它是角质层发挥物理屏障作用的基础。皮肤物理屏障主要由三部分组成：(1)角质细胞的跨膜蛋白及膜内蛋白(例如，LOR(Loricrin，兜甲蛋白),FLG(Filaggrin，丝聚蛋白)等)在转谷氨酰胺酶作用下互相交联形成蛋白膜套。(2)细胞外三大脂质(神经酰胺，胆固醇，脂肪酸)相互之间通过酯化反应交联形成脂质胞封。(3)蛋白膜套与胞外脂质胞封通过酯化反应进一步交联，形成高度密封的砖墙结构，共同抵御外环境，发挥物理屏障作用。
CE组装过程是一个精准有序的过程，主要是由细胞内不断增加的钙离子浓度与复层化的鳞状上皮细胞末端分化的一致性来激活这个过程。表皮的分化开始于角质形成细胞从基底层的迁移，结束于角质层的形成，细胞的增殖、分化、死亡的发生是有序的，每一个过程都有特异性表达的蛋白。CE的组装过程包括三个阶段：
第一个阶段：角质细胞的末端分化开始，第一个主要的变化是Envoplakin(外被斑蛋白)和Periplakin(斑周蛋白)的表达，其余角蛋白中间丝与桥粒连接。随着Ca2+离子浓度的增加，Envoplakin和Periplakin以Ca2+离子依赖性的行为形成异源性四聚体位于阴离子等离子体膜处。膜上存在的Annexins和其他Ca2+结合蛋白促进这种自我组装过程，TGM1(Transglutaminase 1，转谷氨酰胺酶1)和IVL(Involurin，内披蛋白)开始合成，然后在Ca2+和脂肪酸添加下自发性地结合到膜上，IVL形成链间连接，Envoplakin和IVL链内交联，最终，IVL、Envoplakin、Periplakin以及其他蛋白在TGM1的作用下沿着细胞膜相互连接形成单细胞层的骨架。
第二个阶段：在角质细胞分化过程中，伴随着一系列角化特异性脂质的合成。这些脂质是在反式高尔基体中以板层小体(Lamellar bodies，LB)的形式合成和积累，其中板层小体LB主要是由脂肪酸、胆固醇以及葡萄神经酰胺构成。第二阶段的板层小体LB外排过程与第一个阶段的单细胞骨架形成过程基本是同步进行的。板层小体LB中的脂质与质膜融合，其中神经酰胺在TGM1的作用下与角蛋白骨架连接。
第三个阶段：加固阶段，80％的LOR和SPRRs(富脯氨酸小蛋白，Small proline-rich protein)与少量的一些其他蛋白构成CE。LOR在生理水是难溶性的，它主要聚集于颗粒层的颗粒细胞的细胞质上。相反，SPRRs是可溶性的。然而这两个蛋白是细胞质中转化酶3的首选基质。TGase3(转化酶3)单独交链LOR和SPRRs，使其形成小的可溶性聚合体，这个复合体很容易被转移到细胞外周围。然后TGase1将LOR-SPRRs复合体交链到细胞外周围的CE骨架上。另外研究发现在机体的不同位点处的表皮中SPRRs的含量是不同的。SPRRs含量的增加与组织已知的机械需求是相符合的。所以SPRRs变成可变的交链蛋白，可以调节CE的生物化学特性。
FLG是角质细胞末端分化形成的蛋白，其前体丝聚蛋白原(Profilaggrin)存在于颗粒层，细胞从颗粒层到达角质层的过程中，Profilaggrin被Caspase-14(CASP14，半胱氨酸天冬氨酸酶-14)迅速去磷酸化成为FLG，进而水解成天然保湿因子NMF(PCA(Pyrrolidonecarboxylic acid，吡咯烷酮羧酸)/UCA(Urocanic acid，尿刊酸))，主要在屏障功能和保湿功能方面发挥重要的作用。
天然保湿因子PCA/UCA是FLG在Caspase-14水解作用下形成的，能够有效吸附并锁住水分，强化保湿屏障。皮肤屏障功能减弱后，首先会破坏天然保湿因子、水合相关蛋白的功能，造成肌肤水分流失加剧，引发粗糙、暗黄和皮肤敏感问题。
LOR是角质细胞末端分化的产物，表达在角质层和颗粒层，通常富含Gly、Ser、Cys等氨基酸残基，LOR是表皮角质化胞封的主要组件，占角质层总蛋白的70～85％，在TGM酶的作用下，LOR与自身交联，或与SPRRs交联，是皮肤屏障组成的关键加固蛋白。LOR含量的降低会导致皮肤屏障功能减弱。
TGM1表达于角质形成细胞的胞浆和胞膜，一种Ca2+依赖性的酶，催化蛋白质之间的Nε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸键形成，参与皮肤中CE的形成。这种交叉连接十分稳定，可以抵抗蛋白酶的水解作用，是角质形成细胞终末分化组成角质包膜的关键步骤，是皮肤屏障功能的物质基础。
IVL是CE的主要组成成份，人类的IVL蛋白富含Gly和Asp残基，和其他的CE结构蛋白一样，IVL是由反复重复的多肽构成，含有大量的α螺旋。IVL是CE组装过程中最早的组件，为后续其他蛋白的交联提供骨架。在CE结构中，IVL连接到细胞膜上，当细胞膜随后被替代后，IVL是后续脂质特别是神经酰胺共价连接形成CE外表面的基质。
发明内容
为了进一步加强皮肤物理屏障功能，增强皮肤保湿锁水的能力，维持皮肤内环境稳态，防止皮肤水分散失，本申请提供了超高分子量的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)或其盐在化妆品中的应用，以及含有超高分子量的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)或其盐的化妆品组合物，并且在皮肤的超强保湿、锁水、滋润等方面取得了开创性的、预料不到的技术效果。本申请的技术方案如下：
1、一种超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐在化妆品中的应用。
2、根据项1所述的应用，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT-11CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得所述超高分子量的γ-聚谷氨酸。
3、根据项1或2所述的应用，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸的分子量在3000kDa以上。
4、根据项1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸的分子量在3300kDa以上。
5、根据项1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤天然保湿因子PCA的表达量；
优选地，采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子PCA的表达量提高40％以上，更优选为提高80％以上。
6、根据项1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤天然保湿因子UCA的表达量；
优选地，采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子UCA的表达量提高30％以上，更优选为提高60％以上。
7、根据项1-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白LOR的含量。
8、根据项1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白FLG的含量。
9、根据项1-8中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白TGM1的含量。
10、根据项1-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白IVL的含量。
11.一种化妆品组合物，其包括超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐的质量百分含量为0.1％-0.8％，优选为0.4％-0.6％。
12、根据项11所述的化妆品组合物，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得所述超高分子量的γ-聚谷氨酸。
13、根据项11或12所述的化妆品组合物，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸的分子量在3000kDa以上。
14、根据项11-13中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸的分子量在3300kDa以上。
15、根据项11-13中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，其还可以包括选自：甘油、透明质酸、海藻糖、依克多因、苯氧乙醇、三乙醇胺、泛醇、海藻糖、尿囊素中的一种或两种以上。
申请的效果
本申请将超高分子量γ-聚谷氨酸作为原料应用于化妆品中，所述γ-聚谷氨酸具有大于3000kDa的超高分子量，其具有超强的保湿能力、活性好、稳定性好、易于操作，相对于分子量为100kDa～1000kDa的γ-聚谷氨酸以及分子量小于100kDa的γ-聚谷氨酸，本申请的超高分子量γ-聚谷氨酸应用于化妆品中，可显著提高皮肤天然保湿因子PCA、UCA的表达量，具体的，可使皮肤天然保湿因子PCA的表达量提高40％以上，使皮肤天然保湿因子UCA的表达量提高30％以上，此外，还可提升皮肤屏障相关蛋白LOR、FLG、TGM1及IVL的含量。本申请的化妆品组合物，包括质量百分含量为0.1-0.8％，优选为0.4％-0.6％的超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐，可显著提高皮肤角质层水分含量，提高皮肤保湿锁水能力。
附图说明
图1A为不加入γ-PGA的3D皮肤模型切片的LOR免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为LOR蛋白)。
图1B为加入低分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的LOR免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为LOR蛋白)。
图1C为加入高分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的LOR免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为LOR蛋白)。
图1D为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3397kDa)的3D皮肤模型切片的LOR免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为LOR蛋白)。
图1E为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3544kDa)的3D皮肤模型切片的LOR免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为LOR蛋白)。
图2A为不加入γ-PGA的3D皮肤模型切片的FLG免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为FLG蛋白)。
图2B为加入低分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的FLG免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为FLG蛋白)。
图2C为加入高分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的FLG免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为FLG蛋白)。
图2D为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3397kDa)的3D皮肤模型切片的FLG免疫组化检测结果(箭头所指部位为FLG蛋白)。
图2E为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3544kDa)的3D皮肤模型切片的FLG免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为FLG蛋白)。
图3A为不加入γ-PGA的3D皮肤模型切片的TGM1免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为TGM1蛋白)。
图3B为加入低分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的的TGM1免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为TGM1蛋白)。
图3C为加入高分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的的TGM1免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为TGM1蛋白)。
图3D为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3397kDa)的3D皮肤模型切片的的TGM1免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为TGM1蛋白)。
图3E为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3544kDa)的3D皮肤模型切片的TGM1免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为TGM1蛋白)。
图4A为不加入γ-PGA的3D皮肤模型切片的IVL免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为IVL蛋白)。
图4B为加入低分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的IVL免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为IVL蛋白)。
图4C为加入高分子量的γ-PGA的3D皮肤模型切片的IVL免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为IVL蛋白)。
图4D为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3397kDa)的3D皮肤模型切片的IVL免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为IVL蛋白)。
图4E为本申请一个具体实施方式的加入超高分子量的γ-PGA(分子量为3544kDa)的3D皮肤模型切片的IVL免疫组化检测结果显微图(箭头所指部位为IVL蛋白)。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。此外，下面所描述的本申请各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本文中的术语的含义如下：
“3D皮肤模型”为模拟人天然皮肤结构，由体外分离出的正常人角质形成细胞在特定的培养环境下生成的活性组织。它与正常人表皮高度类似，具有典型的基底层、棘层、颗粒层及角质层的表皮复层化结构。其还具有人体皮肤类似的代谢功能。
“RIPA”主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。“RIPA裂解液”(RIPALysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。
“EP管”为是一种小型的离心管，可以与微型离心机配套使用，用于微量试剂的分离。
“ABC复合液”为亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。
“DAB染色液”为辣根过氧化氢酶DAB显色试剂盒(DAB即二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine)。本申请的DAB染色液为商购获得。
本申请提供一种超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐在化妆品中的应用。
γ-聚谷氨酸是由谷氨酸缩合而成，分子量越大其结构中所含有的羧基越多，其保湿锁水能力越强，相对于高分子量和低分子量的γ-聚谷氨酸，本申请的超高分子量的γ-聚谷氨酸结构中含有更多的羧基，从而具有超强保湿能力，可广泛应用于化妆品中。
在一个具体实施方式中，所述化妆品可为凝胶剂、乳剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、精华液或面膜等。
在一个具体实施方式中，所述γ-聚谷氨酸盐可选自但不限于：γ-聚谷氨酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等，优选为γ-聚谷氨酸钠。
在一个具体实施方式中，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得所述超高分子量的γ-聚谷氨酸。
在一个具体实施方式中，根据中国专利申请CN110904012A，以枯草芽孢杆菌NT-11(Bacillus subtilis)CCTCC NO:M 2019383为发酵菌株，以谷氨酰胺为前体，同时控制发酵过程中pH、搅拌转速、罐压、通风量等参数，发酵液再经醇沉、复溶、离心、过滤、再醇沉、干燥等提取工艺制得所述超高分子量的γ-聚谷氨酸。
本申请γ-聚谷氨酸的分子量是指重均分子量。在一个具体实施方式中，所述γ-聚谷氨酸的分子量在3000kDa以上，优选为3300kDa以上，例如可为：3000kDa、3050kDa、3100kDa、3150kDa、3200kDa、3250kDa、3300kDa、3350kDa、3400kDa、3450kDa、3500kDa、3550kDa、3600kDa、3650kDa、3700kDa等。
在一个具体实施方式中，所述应用包括采用所述γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子PCA的表达量提高40％以上，优选为提高70％以上，例如可为：40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％等。
在一个具体实施方式中，所述应用包括采用所述γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子UCA的表达量提高30％以上，优选为提高60％以上，例如可为：30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％等。
在一个具体实施方式中，所述应用包括采用所述γ-聚谷氨酸或其盐同时提高皮肤天然保湿因子PCA和UCA的表达量。
在一个具体实施方式中，所述应用包括采用所述γ-聚谷氨酸或其盐提高选自：LOR、FLG、TGM1及IVL中任意一种或两种或三种或四种皮肤屏障相关蛋白的含量。
在一个具体实施方式中，所述应用包括采用所述γ-聚谷氨酸或其盐同时提高皮肤天然保湿因子PCA和UCA的表达量、以及皮肤屏障相关蛋白LOR、FLG、TGM1及IVL的含量。
本申请还提供一种化妆品组合物，其包括超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐的质量百分含量为0.1％-0.8％，优选为0.4％-0.6％，例如可为0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％等。
在一个具体实施方式中，所述化妆品组合物，根据不同应用需求，其还可以包括抗氧化剂、防腐剂、表面活性剂、保湿剂、皮肤渗透剂中的任意一种或两种以上。本申请的化妆品组合物对抗氧化剂、防腐剂、表面活性剂、保湿剂、皮肤渗透剂没有特别限制。
在一个具体实施方式中，所述化妆品组合物，其还可以包括选自：甘油、透明质酸、海藻糖、依克多因、苯氧乙醇、三乙醇胺、泛醇、海藻糖、尿囊素中的一种或两种以上。
本申请的分子量大于3000kDa的超高分子量γ-聚谷氨酸具有超强的保湿能力，可将皮肤天然保湿因子PCA含量提高80％以上，将天然保湿因子UCA含量提高60％以上，将皮肤屏障相关蛋白LOR提高25％以上，将FLG提高30％以上，将TGM1提高14％以上，将IVL提高55％以上。本申请的超高分子量γ-聚谷氨酸作为原料应用于化妆品中，可将皮肤角质层水份含量增加45％以上，对皮肤有显著的保湿锁水功效。
实施例
实施例1
实施例1的超高分子量γ-PGA样品SHM1通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT-11菌株发酵液经纯化制得，制备过程根据中国专利申请CN110904012A《一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用》进行，具体为：以枯草芽孢杆菌NT-11(Bacillussubtilis)CCTCC NO:M 2019383为发酵菌株，以谷氨酰胺为前体，同时控制发酵过程中pH、搅拌转速、罐压、通风量等参数，发酵液再经醇沉、复溶、离心、过滤、再醇沉、干燥等提取工艺获得超高分子量γ-PGA样品SHM1。
实施例2
实施例2的超高分子量γ-PGA样品SHM2通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT-11菌株发酵液经纯化制得，制备过程根据中国专利申请CN110904012A《一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用》进行，具体为：以枯草芽孢杆菌NT-11(Bacillussubtilis)CCTCC NO:M 2019383为发酵菌株，以谷氨酰胺为前体，同时控制发酵过程中pH、搅拌转速、罐压、通风量、罐压等参数，发酵液再经醇沉、复溶、离心、过滤、再醇沉、干燥等提取工艺获得超高分子量γ-PGA样品SHM2。
对比例1
对比例1为市售普通高分子量γ-PGA样品HM(采购于山东福瑞达生物科技有限公司高分子聚谷氨酸，分子量标识80～150万)。
对比例2
对比例2为市售普通低分子量γ-PGA样品LM。(采购于山东福瑞达生物科技有限公司低分子聚谷氨酸，分子量标识5～10万)
采用多角度激光光散射法测γ-PGA样品SHM1、SHM2、HM、LM的分子量，实验仪器、条件及方法如下：
1.仪器试剂
2.色谱条件
色谱柱：TSKgel GMPWXL
流动相：0.2mol/L氯化钠溶液
流速：0.6mL/min
进样量：500μL
检测波长：658nm
柱温：35℃
3.检测方法
(1)试剂配制
流动相：精密称取氯化钠11.7g，叠氮钠0.2g，加纯化水使其溶解并定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤，即为0.2mol/L氯化钠溶液。
供试液：精密称取待测样品SHM1、SHM2、HM、LM各0.05g，加流动相溶解并稀释至10mL，摇匀，室温放置，作为待测样品溶液。
(2)样品测定
取待测样品溶液500μL，注入液相色谱仪，平行进样2次，分别记录色谱图。ASTRA软件计算待测样品的分子量。
4.检测结果
γ-PGA样品SHM1、SHM2、HM、LM的分子量检测结果如下表1所示。
表1
编号 实施例1 实施例2 对比例1 对比例2
样品名称 SHM1 SHM2 HM LM
分子量Mw 3397kDa 3544kDa 952kDa 89kDa
试验例1
保湿功效检测
一、3D皮肤模型建立
1.样品及检测浓度
样品及检测浓度如表2所示。样品分别为实施例1、实施例2、对比例1-2的样品。
表2
样品名称 SHM1 SHM2 HM LM
检测浓度 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
2.样品工作液配制
采用实施例1、实施例2、对比例1、对比例2的样品配制样品工作液S1、S2、C1、C2，并配制作为空白对照的样品工作液B，具体操作如下：
S1：称取0.0081g SHM1粉末，加入1.62mL的PBS缓冲液充分混匀后，得到实施例1的样品工作液S1，备用；
S2：称取0.0081g SHM2粉末，加入PBS缓冲液充分混匀后，得到实施例2的1.62mL的样品工作液S2，备用；
C1：称取0.0081g HM粉末，加入1.62mL的PBS缓冲液充分混匀后，得到对比例1的样品工作液C1，备用；
C2：称取0.0081g LM粉末，加入1.62mL的PBS缓冲液充分混匀后，得到对比例2的样品工作液C2，备用；
B：不加入γ-PGA，仅加入1.62mL的PBS缓冲液，作为空白对照，得到的样品工作液B，备用。
3.3D皮肤模型培养及给药
(1)首先，向6孔培养板中每孔添加0.9mL模型培养液，模型培养液为EpiGrowth(由广东博溪生物科技股份有限公司提供)，随后将3D皮肤模型(简称“模型”)转移到6孔培养板中，在6孔培养板上标注测试组编号。
(2)取配置好的五种样品工作液各25μL(模型给药量为39μL/cm2)加于模型表面，轻轻抖动模型，使样品均匀分布于模型表面，随后将模型置于CO2培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育24h。
(3)孵育结束后，用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的样品工作液，用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。
二、PCA、UCA含量检测
(1)PCA/UCA检测前处理：将模型环切至1.5mL的EP管中，每管加入500μL的浓度为0.2mg/mL蛋白激酶K，置于50℃水浴1h。待角质层脱落后，吹打均匀，将溶液平均分至2个EP管中。
(2)PCA/UCA提取：取步骤(1)中一个EP管，加入250μL的甲醇，超声30min；然后14000rpm，离心10min。60℃水浴蒸干甲醇后，得到提取物PCA/UCA，保存于4℃备用。
(3)上机准备：采用超纯水对提取物进行复溶，取388μL复溶后的液体转移到干净的进样瓶中，每瓶依次加入10mL的1mol甲酸铵母液和5μL乙腈后震荡混匀。
(4)HPLC仪器检测参数设置：仪器型号为安捷伦1260；色谱柱型号InertSustainTM，C18柱5μm，4.6*250mm；检测器类型为VWD(单波长紫外检测器)；检测器型号为G1314F。
(5)蛋白含量检测：取步骤(1)中另一个EP管，加入250μL的RIPA裂解液，冰浴20min。然后12000rpm，离心20min，收集上清液。采用BCA蛋白试剂盒(碧云天蛋白试剂盒，商业化产品)进行总蛋白含量测定。
(6)HPLC检测实施例1、实施例2、对比例1-2、空白对照组的PCA、UCA含量，PCA含量结果如下表3所示，UCA含量结果如下表4所示。
表3
PCA/Protein(ng/μg) PCA表达量提高百分比
空白对照 0.478 --
实施例1 0.881 84.3％
实施例2 0.892 86.6％
对比例1 0.558 16.7％
对比例2 0.516 7.9％
从上表3可以看出，相对于空白对照模型，添加γ-PGA的实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的模型中天然保湿因子PCA含量均有所提高，其中，加入超高分子量γ-PGA(分子量为3397kDa)的实施例1和加入超高分子量γ-PGA(分子量为3544kDa)的实施例2的模型中PCA含量显著提升，效果明显优于加入普通高分子量γ-PGA的对比例1和加入普通低分子量γ-PGA的对比例2。并且，实施例2效果优于实施例1。
表4
UCA/Protein(ng/μg) UCA表达量提高百分比
空白对照 1.453 --
实施例1 2.394 64.7％
实施例2 2.448 68.5％
对比例1 1.558 7.2％
对比例2 1.328 -8.6％
从上表4可以看出，相对于空白对照模型，只有添加γ-PGA的实施例1的模型中天然保湿因子UCA含量具有显著提高，添加普通高分子量γ-PGA的对比例1的模型中天然保湿因子UCA含量仅提高7.2％，添加普通低分子量γ-PGA的对比例2的模型中天然保湿因子UCA含量有所降低。由此可见，本申请的超高分子量γ-PGA的保湿效果明显优于普通高分子量γ-PGA和普通低分子量γ-PGA。并且，实施例2效果优于实施例1。
试验例2
1、LOR蛋白免疫组化检测
3D皮肤模型的免疫组化操作包括如下步骤：
组织包封：取上述实施例1给药结束后的模型，用手术刀片沿模型边缘进行环切后，放入装有4％多聚甲醛溶液的1.5mL离心管中，固定2h。采用乙醇脱水、二甲苯透明后，进行石蜡包埋，切片(厚度5～8μm)。
烤片脱蜡：石蜡切片置于70℃烤片机中，烤片4小时。
脱蜡水化：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min。PBS缓冲液清洗3次，每次5min。
抗原修复：将石蜡切片放入0.01M柠檬酸钠抗原修复溶液，采用高压修复，冷却后取出切片。PBS缓冲溶液清洗3次，5min/次。
阻断过氧化物酶：每张切片加1滴3％H2O2，室温下孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS缓冲溶液清洗3次，5min/次。
血清封闭：滴加与二抗同源的血清37℃封闭60min，无需冲洗。
一抗孵育：滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。其中，采用鼠源重组Anti-Loricrin为一抗抗体，用含有3％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液进行稀释，稀释浓度为1:100～1:500，制备得到二抗工作液。
二抗孵育：滴加二抗工作液，室温孵育1h。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。其中，选用羊抗鼠抗体为二抗抗体，使用PBS缓冲液以1:20～1:50进行稀释，制备得到二抗工作液。
ABC复合物孵育：滴加ABC复合物，室温孵育30min。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。
DAB染色：每张切片加1滴新鲜配置的DAB染色液(特异性部位会染成棕色)，显微镜观察5～30s。
复染：苏木素复染30s。
脱水：切片经梯度酒精脱水(75％，95％，100％，100％)各5min，再将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，干燥，中性树脂封固，晒干，观察。
拍照：采用显微镜(型号：Olympus，DP26)进行图片采集，图片放大倍数为400倍(目镜10×，物镜40×)。
检测结果显微图如图1A-1E所示，箭头所指区域的棕色部位越深，LOR蛋白含量越高，由图1A-1E可以看出，加入γ-PGA的模型与空白对照模型相比，LOR蛋白含量均有所提高，其中加入实施例1和2的模型LOR蛋白含量提高效果最为显著，说明超高分子量γ-PGA可以极显著提升LOR蛋白含量，效果优于普通高分子量γ-PGA以及低分子量γ-PGA。
2、LOR蛋白免疫组化定量分析
使用Image J通过灰度比较法，对图1A-1E进行相对定量分析，分析结果如下表5，进一步说明超高分子量γ-PGA可以极显著提升LOR蛋白含量，效果优于普通高分子量γ-PGA以及低分子量γ-PGA。
表5 LOR蛋白积分光密度(IOD)值
空白对照 对比例2 对比例1 实施例1 实施例2
相对IOD值 1.00 1.09 1.13 1.28 1.30
提高百分比 -- 0.09％ 13％ 28％ 30％
试验例3
1、FLG蛋白免疫组化检测
3D皮肤模型的免疫组化操作参照试验例2，与试验例2的区别在于，采用Anti-Filaggrin为一抗抗体；LOR免疫组化检测结果显微图如图2A-2E所示，箭头所指区域的棕色部位越深，FLG蛋白含量越高，由图2A-2E可以看出，只有加入超高分子量γ-PGA模型的FLG蛋白含量有显著提高，加入普通高分子量γ-PGA的模型以及加入普通低分子量γ-PGA的模型没有明显效果。
2、FLG蛋白免疫组化定量分析
使用Image J通过灰度比较法，对图2A-2E进行相对定量分析，分析结果如下表6，进一步说明超高分子量γ-PGA可以极显著提升FLG蛋白含量，效果优于普通高分子量γ-PGA以及低分子量γ-PGA。
表6 FLG蛋白积分光密度(IOD)值
空白对照 对比例2 对比例1 实施例1 实施例2
相对IOD值 1.00 1.01 1.03 1.30 1.32
提高百分比 -- 1％ 3％ 30％ 32％
试验例4
1、TGM1蛋白免疫组化检测
3D皮肤模型的免疫组化操作参照试验例2，与试验例2的区别在于，采用重组TGM1antibody为一抗抗体，培养结束后模型进行TGM1免疫组化检测，检测结果显微图如图3A-3E所示，箭头所指区域的棕色部位越深，TGM1蛋白含量越高，由图3A-3E可以看出，与空白对照模型相比，加入超高分子量γ-PGA的模型以及普通高分子量γ-PGA的模型的TGM1蛋白含量均有所提高，而加入普通低分子量γ-PGA的模型没有明显效果，其中加入超高分子量γ-PGA的模型的TGM1蛋白含量提高最为显著。
2、TGM1蛋白免疫组化定量分析
使用Image J通过灰度比较法，对图3A-3E进行相对定量分析，分析结果如下表7，进一步说明超高分子量γ-PGA可以极显著提升TGM1蛋白含量，效果优于普通高分子量γ-PGA以及低分子量γ-PGA。
表7 TGM1蛋白光密度(IOD)值
试验例5
1、IVL蛋白免疫组化检测
3D皮肤模型的免疫组化操作参照试验例2，与试验例2的区别在于，采用重组Anti-Involucrin为一抗抗体，培养结束后模型进行IVL免疫组化检测，检测结果显微图如图4A-4E所示，箭头所指区域的棕色部位越深，TGM1蛋白含量越高，由图4A-4E可以看出，与空白对照模型相比，加入超高分子量γ-PGA的模型以及普通高分子量γ-PGA的模型的IVL蛋白含量均有所提高，而加入普通低分子量γ-PGA的模型没有明显效果，其中加入超高分子量γ-PGA的模型的IVL蛋白含量提高最为显著。
2、IVL蛋白免疫组化定量分析
使用Image J通过灰度比较法，对图4A-4E进行相对定量分析，分析结果如下表8，进一步说明超高分子量γ-PGA可以极显著提升IVL蛋白含量，效果优于普通高分子量γ-PGA以及低分子量γ-PGA。
表8 IVL积分光密度(IOD)值
空白对照 对比例2 对比例1 实施例1 实施例2
相对IOD值 1.00 1.01 1.13 1.56 1.63
提高百分比 -- 1％ 13％ 56％ 63％
实施例3
面膜液
(1)按照以下原料比例制备面膜液：
(2)按照以下方法制备面膜液：
将水、甘油、海藻糖、泛醇、三乙醇胺、尿囊素按照上述比例置于搅拌罐中常温搅拌均匀，再加入SHM1常温混匀充分搅拌溶解得面膜液。
实施例4
精华液
(1)按照以下原料比例制备精华液：
(2)按照以下方法制备精华液：
(i)将甘油、苯氧乙醇、水进行混合，常温下搅拌均匀；
(ii)将步骤(i)的得到的溶液中升温至40℃，加入透明质酸、海藻糖、依克多因搅拌均匀，充分溶解；
(iii)向步骤(ii)得到的溶液降温至常温，加入SHM1，充分搅拌，使其溶解均匀，灌装即得所述精华液。
实施例5
本实施例的精华液与实施例4的区别在于，所述超高分子量γ-PGA SHM1的质量百分含量为0.1％。
实施例6
本实施例的精华液与实施例4的区别在于，所述超高分子量γ-PGA SHM1的质量百分含量为0.8％。
对比例3
本对比例的精华液与实施例4的区别在于，所述超高分子量γ-PGA SHM1的质量百分含量为0.05％。
试验例6
皮肤角质层水份含量
招募20名志愿者，分为4组，分别为1-4组，每组5人，1-4组志愿者分别每天涂抹实施例4、实施例5、实施例6、对比例3的精华液0.3～0.4g，涂抹前、涂抹后7天、涂抹后14天、涂抹后21天和涂抹后28天时，采用皮肤水分测试仪(型号CM825)，对每组志愿者的脸部皮肤进行测试，得出每组、每位志愿者的角质层含水量，以此考察产品对皮肤的保湿补水效果，各组数据分别取平均值后按照如下公式得到含水量增加率。检测结果见表9。(注：数值越大说明角质层含水量相对增长越多。)
涂抹N天后皮肤角质层水份含量增加率(％)＝(涂抹N天后皮肤角质层水份含量测定值-涂抹前皮肤角质层水份含量测定值)/涂抹前皮肤角质层水份含量测定值×100％
表9志愿者皮肤角质层水分含量检测结果
由上表9数据可知，涂抹实施例4～6后，志愿者面部角质层水含量增加明显。涂抹对比例3后，皮肤角质层水分含量有所增加，但效果劣于实施例4～6。涂抹实施例4的志愿者面部角质层水含量增加最为明显。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐在制备加强皮肤物理屏障功能或增强皮肤保湿锁水的能力的化妆品中的应用，其中，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐采用多角度激光光散射法测得的分子量在3000kDa以上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得所述超高分子量的γ-聚谷氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸的分子量在3300kDa以上。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤天然保湿因子PCA的表达量。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子PCA的表达量提高40%以上。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子PCA的表达量提高80%以上。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤天然保湿因子UCA的表达量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子UCA的表达量提高30%以上。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐将皮肤天然保湿因子UCA的表达量提高60%以上。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白LOR的含量。
11.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白FLG的含量。
12.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白TGM1的含量。
13.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐提高皮肤屏障相关蛋白IVL的含量。
14.一种加强皮肤物理屏障功能或增强皮肤保湿锁水的能力的化妆品组合物，其包括超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐的质量百分含量为0.1%-0.8%，其中，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐采用多角度激光光散射法测得的分子量在3000kDa以上。
15.根据权利要求14所述的化妆品组合物，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸或其盐的质量百分含量为0.4%-0.6%。
16.根据权利要求14所述的化妆品组合物，其特征在于，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NT-11 CCTCC NO：M 2019383为菌种，通过发酵法制得所述超高分子量的γ-聚谷氨酸。
17.根据权利要求14所述的化妆品组合物，其特征在于，所述超高分子量的γ-聚谷氨酸的分子量在3300kDa以上。
18.根据权利要求14所述的化妆品组合物，其特征在于，其还可以包括选自：甘油、透明质酸、海藻糖、依克多因、苯氧乙醇、三乙醇胺、泛醇、海藻糖、尿囊素中的一种或两种以上。
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