附图说明
图1为对照组1的3D重组皮肤模型切片的兜甲蛋白免疫组化检测结果;
图2为实施例1组合物的3D重组皮肤模型切片的兜甲蛋白免疫组化检测结果;
图3为实施例3组合物的3D重组皮肤模型切片的兜甲蛋白免疫组化检测结果;
图4为对比例1组合物的3D重组皮肤模型切片的兜甲蛋白免疫组化检测结果;
图5为对比例3组合物的3D重组皮肤模型切片的兜甲蛋白免疫组化检测结果;
图6为对比例4组合物的3D重组皮肤模型切片的兜甲蛋白免疫组化检测结果;
图7为对照组1的3D重组皮肤模型切片的丝聚蛋白免疫组化检测结果;
图8为实施例1组合物的3D重组皮肤模型切片的丝聚蛋白免疫组化检测结果;
图9为实施例3组合物的3D重组皮肤模型切片的丝聚蛋白免疫组化检测结果;
图10为对比例1组合物的3D重组皮肤模型切片的丝聚蛋白免疫组化检测结果;
图11为对比例3组合物的3D重组皮肤模型切片的丝聚蛋白免疫组化检测结果;
图12为对比例4组合物的3D重组皮肤模型切片的丝聚蛋白免疫组化检测结果;
图13为对照组1的3D重组皮肤模型切片的内披蛋白免疫组化检测结果;
图14为实施例1组合物的3D重组皮肤模型切片的内披蛋白免疫组化检测结果;
图15为实施例3组合物的3D重组皮肤模型切片的内披蛋白免疫组化检测结果;
图16为对比例1组合物的3D重组皮肤模型切片的内披蛋白免疫组化检测结果;
图17为对比例3组合物的3D重组皮肤模型切片的内披蛋白免疫组化检测结果;
图18为对比例4组合物的3D重组皮肤模型切片的内披蛋白免疫组化检测结果;
图19为对照组1的3D重组皮肤模型切片的转谷氨酰胺酶1免疫组化检测结果;
图20为实施例1组合物的3D重组皮肤模型切片的转谷氨酰胺酶1免疫组化检测结果;
图21为实施例3组合物的3D重组皮肤模型切片的转谷氨酰胺酶1免疫组化检测结果;
图22为对比例1组合物的3D重组皮肤模型切片的转谷氨酰胺酶1免疫组化检测结果;
图23为对比例3组合物的3D重组皮肤模型切片的转谷氨酰胺酶1免疫组化检测结果;
图24为对比例4组合物的3D重组皮肤模型切片的转谷氨酰胺酶1免疫组化检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本申请,并非用于限制本申请。
除非另外定义,本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料,本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下,以本说明书包括其中定义为准,另外,材料、方法和例子仅供说明,而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明,但不用来限制本申请的范围。
作为生物高分子,聚谷氨酸根据分子量的不同可分为低分子量聚谷氨酸(分子量<500kDa)、高分子量聚谷氨酸(分子量500kDa-1490kDa)及超高分子量聚谷氨酸(分子量1500kDa-4000kDa)。
本申请提供一种护肤组合物,所述护肤组合物包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐以及超高分子量聚谷氨酸或其盐中的两种或三种,例如可以包括低分子量聚谷氨酸或其盐和高分子量聚谷氨酸或其盐,或低分子量聚谷氨酸或其盐和超高分子量聚谷氨酸或其盐,或高分子量聚谷氨酸或其盐和超高分子量聚谷氨酸或其盐,或低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐以及超高分子量聚谷氨酸或其盐。优选包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐以及超高分子量聚谷氨酸或其盐。其中,聚谷氨酸盐可以选自聚谷氨酸的钠盐、钾盐、锌盐中的一种或两种以上,优选为聚谷氨酸的钠盐。
不同分子量的聚谷氨酸具有不同的功能,其中低分子量聚谷氨酸具有较好的溶解性和透皮吸收性。
在一个具体的实施方式中,所述低分子量聚谷氨酸或其盐的分子量小于500kDa,优选为10kDa-100kDa,例如可以为1kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、450kDa。
高分子量聚谷氨酸可成膜、锁水、保湿、提高皮肤屏障功能。
在一个具体的实施方式中,所述高分子量聚谷氨酸或其盐的分子量为500kDa-1490kDa,优选为700kDa-1200kDa,例如可以为500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa、800kDa、850kDa、900kDa、950kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1490kDa。
超高分子量聚谷氨酸具有优异的成膜性,可防止外界污染物和紫外线、蓝光对肌肤的损伤。
在一个具体的实施方式中,所述超高分子量聚谷氨酸或其盐的分子量为1500kDa-4000kDa,优选为1800kDa-2300kDa,例如可以为1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa、2500kDa、2600kDa、2700kDa、2800kDa、2900kDa、3000kDa、3100kDa、3200kDa、3300kDa、3400kDa、3500kDa、3600kDa、3700kDa、3800kDa、3900kDa、4000kDa。
在本申请的护肤组合物中,上述低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐以及超高分子量聚谷氨酸或其盐可以以任何的质量比进行存在。
在一个具体的实施方式中,所述低分子量聚谷氨酸或其盐、所述高分子量聚谷氨酸或其盐以及所述超高分子量聚谷氨酸或其盐的质量比为1:(0.5-1.2):(0.4-1.0)。
进一步地,本申请的护肤组合物还可以包括透明质酸或其盐。透明质酸(HYALURONIC ACID,HA),是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的双糖重复单元构成的粘多糖类物质,商品化透明质酸通常是其钠盐形式,称之为透明质酸钠。透明质酸由于其特殊的分子组成结构和理化性质,对人体发挥着多重生理功能作用。透明质酸具有特殊的保水作用,高分子量的透明质酸在皮肤表面迅速形成一层透气的水化薄膜,水合软化皮肤角质层。低分子量的透明质酸则能直接渗入到真皮层,有效的改善皮肤的生理特性,为真皮胶原蛋白和弹性纤维的合成提供了良好的外部环境,利于营养物质的有效供给,产生营养皮肤功能。
其中的透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、锌盐、钙盐、镁盐中的一种或两种以上,优选为透明质酸钠盐。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸或其盐的分子量为0.8kDa-3000kDa。例如可以为0.8kDa、5kDa、10kDa、50kDa、100kDa、200kDa、500kDa、1000kDa、1500kDa、2000kDa、2500kDa、3000kDa。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸或其盐与所述低分子量聚谷氨酸的质量比为1:(0.2-5),优选为1:(0.5-1)。
所述护肤组合物还可以包括透明质酸衍生物,其中所述透明质酸衍生物的分子量为1kDa-5000kDa,例如可以为1kDa、5kDa、10kDa、50kDa、100kDa、200kDa、500kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa。
所述透明质酸衍生物选自透明质酸钠交联聚合物、乙酰化透明质酸、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸、二甲基硅烷醇透明质酸酯钠、二甲基硅烷醇透明质酸酯、维生素C丙二醇透明质酸酯中的一种或两种以上,优选为乙酰化透明质酸钠。其中,所述乙酰化透明质酸钠的分子量为3kDa-100kDa。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸衍生物与所述低分子量聚谷氨酸的质量比为1:(0.1-5),优选为1:(0.3-1)。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、以及透明质酸或其盐。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、以及透明质酸衍生物。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、透明质酸或其盐、以及透明质酸衍生物。
所述护肤组合物还可以根据需要进一步包括依克多因、麦角硫因、波色因、乙酰壳糖胺、神经酰胺、N-乙酰神经氨酸、胶原、多肽中的一种或两种以上。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物由低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、以及透明质酸或其盐组成。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、以及透明质酸衍生物组成。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物包括低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、透明质酸或其盐、以及透明质酸衍生物组成。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物由低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、透明质酸或其盐、以及依克多因组成。
在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物由低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、透明质酸或其盐、依克多因、以及麦角硫因组成。
本在一个具体的实施方式中,所述护肤组合物由低分子量聚谷氨酸或其盐、高分子量聚谷氨酸或其盐、超高分子量聚谷氨酸或其盐、透明质酸或其盐、透明质酸衍生物、依克多因、以及麦角硫因组成。
发明还提供上述护肤组合物在制备具有保湿和提高皮肤屏障作用的产品中的用途。
本申请还提供包括上述护肤品组合物的护肤品。进一步地,所述护肤组合物在所述护肤品中的质量含量为0.05%-50%,例如可以为0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%,优选为0.1%-10%。
本申请的护肤组合物将不同分子量的三种聚谷氨酸组合,对天然保湿因子的合成具有内在的协同功效;尤其是当不同分子量聚谷氨酸钠进一步与透明质酸钠复配时,对天然保湿因子合成的效果更为突出。同时不同分子量聚谷氨酸钠、透明质酸钠与依克多因、麦角硫因在促进天然保湿因子合成方面也具有协同功效。另外,本申请的护肤组合物能够有效促进皮肤屏障标志蛋白的表达,从而促进皮肤屏障角化包膜的成熟,从而提高皮肤的屏障功能。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,所使用的透明质酸钠、乙酰化透明质酸钠均购自华熙生物科技股份有限公司。其中,以下实施例和对比例中使用的低分子量谷氨酸钠的分子量为68kDa,高分子量聚谷氨酸钠的分子量为1016kDa,超高分子量聚谷氨酸钠的分子量为2197kDa(各种分子量的聚谷氨酸钠均采购自华熙生物科技股份有限公司)。
实施例1
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例2
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.05g高分子量聚谷氨酸钠、0.1g超高分子量聚谷氨酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例3
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠、0.05g分子量为25.6kDa的乙酰化透明质酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例4
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠、0.05g分子量为3kDa的透明质酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例5
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠、0.05g分子量为3kDa的透明质酸钠和0.05g分子量为25.6kDa的乙酰化透明质酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例6
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠、0.05g分子量为3kDa的透明质酸钠、0.05g分子量为1300kDa的透明质酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例7
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠、0.05g分子量为3kDa的透明质酸钠、0.05g分子量为1300kDa的透明质酸钠、0.05g依克多因。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
实施例8
称取0.1g低分子量聚谷氨酸钠、0.1g高分子量聚谷氨酸钠、0.05g超高分子量聚谷氨酸钠、0.05g分子量为3kDa的透明质酸钠、0.05g分子量为1300kDa的透明质酸钠、0.05g依克多因、0.001g麦角硫因。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
对比例1
称取0.25g超高分子量聚谷氨酸钠,补水至100g,得到组合物。
对比例2
称取0.25g低分子量聚谷氨酸钠,补水至100g,得到组合物。
对比例3
称取0.25g高分子量聚谷氨酸钠,补水至100g,得到组合物。
对比例4
称取0.05g分子量为25.6kDa的乙酰化透明质酸钠,补水至100g,得到组合物。
对比例5
称取0.05g分子量为3kDa的透明质酸钠,补水至100g,得到组合物。
对比例6
称取0.2g低分子量聚谷氨酸钠、0.02g高分子量聚谷氨酸钠、0.03g超高分子量聚谷氨酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
对比例7
称取0.05g低分子量聚谷氨酸钠、0.125g高分子量聚谷氨酸钠、0.075g超高分子量聚谷氨酸钠。将上述称取的组分补水至100g,搅拌均匀,得到组合物。
上述各实施例和对比例的条件如表1所示。
表1不同实施例和对比例的组成及含量(g)
试验例
本申请通过人体皮肤屏障损伤模型验证了聚谷氨酸及其盐/组合物对天然保湿因子蓄积和增强皮肤屏障的功效。
试验例1
1、建立人体皮肤屏障损伤模型
人体皮肤屏障损伤模型是通过物理损伤建立受损皮肤屏障的人体测试模型,皮肤屏障的损伤程度接近于有皮肤问题早产儿的皮肤状态,通过此模型可评估受损皮肤屏障恢复的情况,研究特定原料对皮肤屏障恢复过程中天然保湿因子、屏障蛋白表达的影响。
30名健康志愿者(20岁-35岁)的前臂清洗后于恒温恒湿室中休息30min,每名志愿者分别在前臂内侧用记号笔标记处16块1.5cm x 1.5cm大小的方形区域,用Vapometer检测每块区域皮肤的经表皮失水率(Transdermal Water Loss,TEWL)。采用胶带在皮肤上连续剥离角质层,于选定区域连续粘贴至TEWL值为40-50g/cm2/h之间(经Vapometer检测)视为皮肤屏障损伤模型建立完成。
2、施用、采集方式
组别设置:实验组为施用上述实施例1~8、对比例1~7制备的组合物,对照组为生理盐水;
数据采集:损伤模型建立前基线(Baseline)、模型建立后涂抹产品7天(7d);
样品使用:每天均匀涂抹2次,每次15μl,连续涂抹7d;
统计学处理:对使用同一实施例组合物的数据采集结果,分别取Baseline数据的算数平均数与7d数据的算数平均数,并由下式得到该实施例的改变值:
改变值%=(7d-Baseline)/Baseline。
3、实验验证:
3.1天然保湿因子检测方法:
通过角质层采样测试检测皮肤角质层中天然保护因子的含量。
使用压力棒(D500)每片D-Squame透明胶带以相同的压力(225g/cm2),在志愿者同一部位持续按压10秒钟,粘取样本,重复取样5次。舍弃第1片可能粘有化妆品残留物的D-Squame胶带,提取第3、4片透明胶带进行天然保湿因子(natural moisturizing factor,NMF)组分的测定。
(1)天然保湿因子(natural moisturizing factor,NMF)组分的定量测试用高效液相色谱法,具体测试方法参照非专利文献1:(崔俭杰,黄晨,吴越,通过测定角质层中NMF研究化妆品改善皮肤屏障的功能,2017,8(4):25-27.)
天然保湿因子含量越高,皮肤锁水保湿能力越强。
使用高效液相色谱法测定吡咯酮-5-羧酸(PCA)和尿刊酸(UCA),所测数值用总蛋白含量进行均一化,改变值%越大,天然保湿因子含量丢失越少。
其中,通过BAC蛋白含量测定法检测胶带样本上的总蛋白含量。
结果如表2所示。
表2天然保湿因子相对含量及其改变值
其中,“*”表示p<0.05,具有显著性,“**”表示p<0.01,具有极显著性,“***”表示p<0.001,具有极显著性。
受访者在胶带粘取角质-建立皮肤屏障损伤受损模型,皮肤损伤后皮肤内天然保湿因子(PGA\UCA)会流失,如第七天时天然保湿因子含量减低10%,证明模型成立。而使用了实施例1-8的溶液后,天然保湿因子的改变值都是正向的,且具有显著性。如实施例1、实施例2分别改变45.3%和43.23%,说明不同分子量的聚谷氨酸钠复配后能够显著促进机体内天然保湿因子的合成与蓄积。当不同比例分子量的聚谷氨酸钠复配时,如实施例1,实施例2,对比例6和对比例7,其数据对比可知实施例1中低分子聚谷氨酸钠:高分子聚谷氨酸钠:超高分子聚谷氨酸钠比例为2:2:1时效果较好。可能的机理:低分子聚谷氨酸钠促进了天然保湿因子的转化、合成和蓄积,高分子就谷氨酸钠和超高分子就谷氨酸钠成膜,防止天然保湿因子的流失,从而低、高、超高分子表现出协同增效的作用。
当不同分子量聚谷氨酸钠与透明质酸衍生物复配使用时,如与乙酰化透明质酸钠(实施例3)复配使用,能显著促进天然保湿因子的蓄积,且效果最为显著。说明聚谷氨酸钠与乙酰化透明质酸钠具有显著的协同功效。
当不同分子量聚谷氨酸钠与超低分子透明质酸钠复配使用(如实施例4)时,仍有显著促进天然保湿因子合成和蓄积的效果,可能是低分子透明质酸钠促进了天然保湿因子的合成,并且自身也可以作为保湿因子补充肌肤天然保湿因子的含量。不同分子量聚谷氨酸钠、超低分子透明质酸钠和乙酰化透明质酸钠复配使用时(实施例5),其提升天然保湿因子的能力优于实施例3和实施例4,说明不同分子量聚谷氨酸钠与透明质酸钠、透明质酸钠衍生物对天然保湿的提升均具有协同功效;不同分子量聚谷氨酸钠、超低分子透明质酸钠和高分子透明质酸钠复配时,仍能显著提高天然保湿因子含量,可能是高分子透明质酸钠的成膜作用,降低了天然保湿因子的流失。而且当复配其他护肤品原料,如依克多因、麦角硫因均能显著提高皮肤内天然保湿因子水平(实施例7、实施例8),说明与聚谷氨酸钠、透明质酸钠与依克多因和麦角硫因复配具有一定的协同作用。
上述实验证明,不同分子量聚谷氨酸钠对天然保湿因子的合成具有内在的协同功效(实施例1、实施例2);且当不同分子量聚谷氨酸钠与透明质酸钠(实施例4和实施例6)或透明质酸钠衍生物-乙酰化透明质酸钠(实施例3)复配时,二者均能提高天然保湿因子含量,但不同分子量聚谷氨酸钠与乙酰化透明质酸钠的协同效果更突出。同时不同分子量聚谷氨酸钠、透明质酸钠与依克多因、麦角硫因在促进天然保湿因子合成方面也具有协同功效。
试验例2
1、3D重组皮肤模型构建
(1)首先,向6孔培养板中每孔添加0.9mL模型培养液,模型培养液为EpiGrowth(由广东博溪生物科技股份有限公司提供),随后将3D皮肤模型(以下简称“模型”)转移到6孔培养板中,在6孔培养板上标注测试组编号。
(2)取配置好的五种样品工作液各25μL(模型给药量为39μL/cm2)加于模型表面,轻轻抖动模型,使样品均匀分布于模型表面,随后将模型置于CO2培养箱(37℃、5%CO2、湿度95%)中孵育24h。
(3)孵育结束后,用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的样品工作液,用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。
2.标志性蛋白免疫组化检测,3D重组皮肤模型的免疫组化操作包括如下步骤:
组织包封:取上述实施例1给药结束后的模型,用手术刀片沿模型边缘进行环切后,放入装有4%多聚甲醛溶液的1.5mL离心管中,固定2h。采用乙醇脱水、二甲苯透明后,进行石蜡包埋,切片(厚度5~8μm)。
烤片脱蜡:石蜡切片置于70℃烤片机中,烤片4小时。
脱蜡水化:将切片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯后再浸泡10min,无水乙醇中浸泡5min,95%乙醇中浸泡5min,75%乙醇中浸泡5min。PBS缓冲液清洗3次,每次约5min。
抗原修复:将石蜡切片放入0.01mol/L柠檬酸钠抗原修复溶液,采用高压修复,冷却后取出切片。PBS缓冲溶液清洗3次,5min/次。
阻断过氧化物酶:每张切片加1滴3%H2O2,室温下孵育30min,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS缓冲溶液清洗3次,5min/次。
血清封闭:滴加与二抗同源的血清37℃封闭60min。
一抗孵育:滴加一抗工作液,4℃孵育,震荡过夜。PBS缓冲液清洗3次,5min/次。其中,采用鼠源重组标记物为一抗抗体,用含有3%BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液进行稀释,稀释浓度为1:100~1:500,制备得到二抗工作液。
二抗孵育:滴加二抗工作液,室温孵育1h。PBS缓冲液清洗3次。其中,选择合适抗体为二抗抗体,使用PBS缓冲液以1:20~1:50进行稀释,制备得到二抗工作液。
ABC复合物孵育:滴加ABC复合物,室温孵育30min。PBS缓冲液清洗3次,5min/次。
DAB染色:每张切片加1滴新鲜配置的DAB染色液(特异性部位会染成棕色),显微镜观察5~30s。
复染:苏木素复染30s。
脱水:切片经梯度酒精脱水(75%,95%,100%,100%)各5min,再将切片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯后再浸泡10min,干燥,中性树脂封固,晒干,观察。
拍照:采用显微镜(型号:Olympus,DP26)进行图片采集,图片放大倍数为400倍(目镜10×,物镜40×)。
使用Image J通过灰度比较法,对图1-图24进行相对定量分析,灰度值越高代表标志性蛋白表达量越高,说明样品可以上调屏障相关蛋白的表达量,从而提高皮肤的屏障功能。
为研究不同标志蛋白对应的表达量,采用不同的一抗和二抗,如表3所示:
表3试验用抗体记录表
标志蛋白 |
兜甲蛋白 |
丝聚蛋白 |
转谷氨酰胺酶1 |
内披蛋白 |
一抗 |
抗-兜甲蛋白 |
抗-丝聚蛋白 |
TGM1抗体 |
抗-内披蛋白 |
二抗 |
羊抗鼠抗体 |
羊抗鼠抗体 |
羊抗鼠抗体 |
羊抗鼠抗体 |
利用3D重组皮肤模型,研究不同实施例和对比例的组合物对皮肤屏障相关标志蛋白的影响,其中兜甲蛋白、丝聚蛋白、内披蛋白及转谷氨酰胺酶1(TGM1)是构成皮肤屏障重要的标志性蛋白,这些蛋白表达量上调会促进皮肤蛋白膜套的成熟,从而增强皮肤的屏障功能。组合物对不同标志蛋白表达量的结果如表4所示。
表4屏障相关蛋白的表达量结果
|
对照组 |
实施例1 |
实施例3 |
对比例1 |
对比例3 |
对比例4 |
兜甲蛋白 |
1.00 |
1.22** |
1.38** |
1.13* |
1.01 |
1.03 |
丝聚蛋白 |
1.00 |
1.45** |
1.59*** |
1.41** |
1.14** |
1.20* |
内披蛋白 |
1.00 |
1.29** |
1.34** |
1.13* |
1.16* |
1.22* |
TGM1 |
1.00 |
1.13* |
1.29** |
1.07* |
1.01 |
1.19* |
其中,“*”表示p<0.05,具有显著性,“**”表示p<0.01,具有极显著性,“***”表示p<0.001,具有极显著性。
结果显示,超高分子聚谷氨酸钠(对比例1)给药处理后,兜甲蛋白、丝聚蛋白、内披蛋白及转谷氨酰胺酶1的合成量分别显著上调了13%、41%、13%和7%,高分子聚谷氨酸钠(对比例3)给药处理后,丝聚蛋白、内披蛋白的合成量分别显著提高了14%和16%,与对照组相比,用超高分子聚谷氨酸钠或高分子聚谷氨酸钠给药处理后,皮肤屏障相关标志性蛋白均得以提高;然而低分子聚谷氨酸钠(对比例2)对皮肤屏障蛋白的影响并不显著(结果未列出),证明高分子聚谷氨酸钠和超高分子聚谷氨酸钠能提高皮肤的屏障功能。
进一步的,将0.1%低分子聚谷氨酸钠、0.1%高分子聚谷氨酸钠与0.05%超高分子聚谷氨酸钠三者组合(即实施例1),总聚谷氨酸钠的含量为0.25%,同对比例1或对比例3中聚谷氨酸钠含量相当。组合后进一步研究组合物对标志蛋白合成的影响,结果显示兜甲蛋白、丝聚蛋白、内披蛋白及转谷氨酰胺酶1的合成量分别显著上调了22%、45%、29%和13%,其结果明显优于单独使用超高分子力聚谷氨酸钠(对比例1)或低分子聚谷氨酸钠(对比例2)或高分子聚谷氨酸钠(对比例3),体现了低分子聚谷氨酸钠、高分子聚谷氨酸钠和超高分子聚谷氨酸钠三者的协同作用。
进一步,在0.1%低分子聚谷氨酸钠、0.1%高分子聚谷氨酸钠与0.05%超高分子聚谷氨酸钠组合后,又加入了0.05%乙酰化透明质酸钠,即实施例3。兜甲蛋白、丝聚蛋白、内披蛋白及转谷氨酰胺酶1的合成量分别显著上调了38%、59%、34%和29%,该结果显著优于实施例1中低分子聚谷氨酸钠、高分子聚谷氨酸钠和超高分子聚谷氨酸钠组合,同样优于0.05%乙酰化透明质酸钠(对比例4)的效果,说明与实施例1或对比例4相比,乙酰化透明质酸钠与三种分子量聚谷氨酸钠组合具有显著的协同增效作用。低分子聚谷氨酸钠、高分子聚谷氨酸钠、超高分子聚谷氨酸钠与乙酰化透明质酸钠组合,能够有效促进皮肤屏障标志蛋白的表达,从而促进皮肤屏障角化包膜的成熟,从而提高皮肤的屏障功能。