CN110279610A - 一种透明质酸皮肤保护组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种透明质酸皮肤保护组合物，含有：1)透明质酸巯基化衍生物；和2)至少一种分子量的透明质酸或其盐。本发明组合物用于皮肤保护时具有独特的优势，不仅具有透明质酸本身的多重皮肤保护效果，同时还具有强抗氧化能力，可有效清除活性氧自由基。

Description

一种透明质酸皮肤保护组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种透明质酸皮肤保护组合物，还涉及所述透明质酸皮肤保护组合物的制备方法及应用。

背景技术

人体正常新陈代谢过程中，氧化过程和还原过程存在着动态平衡。但在多种内源性(如慢性或急性感染等)及外源性因素(如环境污染、紫外辐射等)的作用下，氧化反应可能占据优势，出现氧化应激，从而产生多种有害的活性氧自由基；活性氧自由基具有强氧化性，会进攻脂质、蛋白质及DNA等，可损害机体的组织和细胞，进而引发各种慢性疾病及衰老效应(Gutteridge等，British Medical Bulletin 1999,55:49-57)。

皮肤是人体面积最大的器官，有研究表明高达80％的皮肤老化现象与活性氧自由基有关。由于活性氧自由基的破坏作用，使维持皮肤平衡的细胞及细胞外基质被破坏和减少，免疫修复能力迅速下降，最后导致各种皮肤衰老及病变症状，如干燥、粗糙、暗沉、松弛、皱纹等等。

保湿是皮肤护理的重要环节，可有效改善皮肤衰老的部分症状，如无光泽、细纹、粗糙、脱屑及瘙痒等。皮肤的湿润水平与透明质酸含量密切相关，随着年龄的增长以及活性氧自由基的破环作用，皮肤中透明质酸含量下降流失，使皮肤保水功能减弱，产生老化(Agren等，Free Radical Biol.Med.1997,23:996-1001；Stern等，Clinics inDermatology 2008,26:106-122)。透明质酸又名玻尿酸，是一种人体内固有的酸性黏多糖，被普遍应用于各种护肤品，是人体肌肤中天然存在的超强保湿剂，可维持自身重量1000倍的水份。保湿作用是透明质酸在护肤品中最重要的作用，局部使用透明质酸进行补水保湿是延缓皮肤老化症状及部分恢复年轻态的重要措施。透明质酸水溶液具有较强的黏弹性和润滑性，涂于皮肤表面，可形成一层保湿透气膜，保持皮肤滋润亮泽。透明质酸的保湿性能独特，周围环境的相对湿度对其保湿性能的影响较小，即使在相对湿度很低的极端情况下，仍能从空气中捕捉水份供给皮肤；与此相反，在极端干燥条件下，传统保湿剂(如山梨醇、聚乙二醇等)则会从皮肤吸水，可能加重皮肤缺水症状(Smejkalova等，Harry’sCosmeticology 9th Edition Vol.2.Part 4.1.3,pp.605-622；Publisher:ChemicalPublishing Company,2015)。

透明质酸的保湿效果与分子量呈正相关性，高分子量透明质酸具有更好的保湿、成膜及润滑性能。当前护肤品中添加的高分子量透明质酸通常大于800kDa(80万道尔顿)，涂于皮肤表面不仅具有良好的保湿效果，同时还可起到提拉紧致的作用，可有效改善皮肤粗糙度，使肌肤更为细腻平滑(Biomatrix Inc.Hyaluronan Vol.2:Biomedical,Medicaland Clinical Aspects,pp.285-288；Publisher:Woodhead Publishing Limited,2002)。

透明质酸的分子量分布很广泛，不同分子量具有不同的理化和生物性能。有研究表明分子量小于500KDa的中低分子量透明质酸可少量透过皮肤表皮浅表角质层，水合软化角质层，与表皮深层的内源性透明质酸之间建立桥梁通道，有利于营养物质的吸收和代谢废物的排出。透明质酸的透皮吸收性能与分子量呈负相关性，分子量的降低有助于透皮吸收。研究还表明小分子透明质酸(6～20个二糖重复单元的寡糖，亦即分子量为2.4KDa～8KDa)还可轻微改善血运(促进微小血管生成)、促进成纤细胞生长及内源性大分子透明质酸的分泌合成。因此，含有低分子量透明质酸的护肤品可在一定程度上起到修复滋养皮肤基底的效果(Farwick等，SOFW-Journal 2008,134:1-6；Smejkalova等，Harry’sCosmeticology 9th Edition Vol.2.Part 4.1.3,pp.605-622；Publisher:ChemicalPublishing Company,2015)。

因此，现有的透明质酸护肤品通常含有多种不同分子量的透明质酸，以起到综合的皮肤保护效果。CN 106109265B公开了一种透明质酸保湿组合物，分子量为1,100kDa的透明质酸或其盐的重量百分数为60-62％，分子量为400kDa的透明质酸或其盐的重量百分数为18-20％，分子量为6kDa的水解透明质酸或其盐的重量百分数为18-20％。CN 106137786B公开了一种透明质酸抗衰组合物，分子量为7KDa的水解透明质酸或其盐的重量百分含量为60％～62％，分子量为320KDa透明质酸或其盐的重量百分含量为18％～20％，分子量为1,100KDa的透明质酸或其盐的重量百分含量为18％～20％。CN 101450028A公开了一种高效保湿的透明质酸原液，由平均分子量大于2,600KDa的高分子量透明质酸钠和分子量小于10KDa以下的低分子量透明质酸钠配比组成。CN 101500535A公开了用于化妆品和医学用途的具有几种透明质酸级分的组合物，包含至少两种透明质酸级分或其盐，其中一种级分具有8KDa～100KDa的平均分子量，另一种级分具有100KDa～500KDa的平均分子量。

此外，透明质酸还可淬灭活性氧自由基，自身同时被破坏分解，具有弱的抗炎作用；然而，该等淬灭活性氧自由基的能力很弱，不足以有效清除活性氧自由基(Yamazaki等，Pathophysiology 2003,9:215-220.；Stern等，Biotechnology Advances 2007,25:537-557；Serban等，Biomaterials 2008,29:1388-1399；CN 106137786B)。

因此，当前的透明质酸护肤品虽然在一定程度上改善了皮肤老化的部分症状，但并不能有效清除活性氧自由基，未能有效消除导致皮肤老化的根源性因素。

发明内容

为了解决现有技术中透明质酸用于皮肤保护时不能有效清除活性氧自由基的问题，本申请提供了一种新型透明质酸皮肤保护组合物，不仅具有透明质酸保湿等护肤功能，同时还具有增强的抗氧化能力，可有效清除活性氧自由基，因而可更加有效地改善皮肤老化症状和更好解决皮肤老化问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种透明质酸皮肤保护组合物，含有：

1)透明质酸巯基化衍生物；和

2)至少一种分子量的透明质酸或其盐。

本发明所述的透明质酸或其盐包括钠盐、钾盐、锌盐、钙盐等，优选钠和钾盐，特别优选钠盐。

在本发明中，所采用的透明质酸巯基化衍生物含有巯基，可有效抑制由活性氧自由基直接引起的氧化应激，可防止脂质、蛋白质及DNA的损伤；此外，还可以通过与二价铁离子络合而间接抑制羟基自由基等的形成。

本发明所述的透明质酸巯基化衍生物是指含有巯基的透明质酸衍生物，可通过透明质酸或其盐的巯基化改性制备，也包括各种透明质酸衍生物进一步通过巯基化改性所制备的巯基化衍生物。透明质酸或其盐或其衍生物的侧链羧基、侧链羟基、以及还原性端基等通常是可进行巯基化改性的活性官能团，WO 2009/006780A1公开了多种透明质酸巯基化衍生物制备方法。

透明质酸侧链羧基的巯基化改性可采用氨基(酰肼基团)/碳化二亚胺偶合化学方法，碳化二亚胺包括1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐等。其通常的方式是侧链羧基在碳化二亚胺的活化下形成中间产物，含有二硫键的二氨或二酰肼亲核取代生成中间产物，最后二硫键还原为巯基即可得到透明质酸巯基化衍生物(Shu等，Biomacromolecules2002,3:1304-1311；Aeschlimann等，US 7,196,180B1)；亦可采用含有巯基(或巯基保护)的伯胺代替含有二硫键的二氨或二酰肼，即可得到(或将所得到的中间产物脱除巯基保护基团)透明质酸巯基化衍生物(Gianolio等，Biocongjugate Chemistry 2005,16:1512-1518；Kafedjiiski等，International Journal of Pharmaceutics 2007,343:48-58)。侧链羧基的巯基化改性的另一种方法是直接与含有二硫键的碳二亚胺(如2,2’-二硫代双(N-乙基(N’-乙基碳二亚胺)))反应制备(Bulpitt等，US 6,884,788)。

透明质酸侧链羟基的巯基化改性可采用碱性条件下羟基与环硫乙烷的亲核开环反应制备(Serban等，Biomaterials 2008,29:1388-1399)。透明质酸侧链羟基的巯基化改性亦可采用间接的方式进行，如羟基首先在碱性条件进行羧甲基化，然后再进行羧基的巯基化改性(Prestwich等，WO 2005/056608A1)。

透明质酸的还原性端基也是可进行巯基化改性的活性基团，可通过化学方式引入末端巯基(Inoue等，Carbohydrate Research 1985,141:99-110)。此外，透明质酸衍生物，如CN 109206537A所公开的乙酰化透明质酸钠等，亦可采用上述巯基化改性方法得到本发明所述的透明质酸巯基化衍生物。

在本发明中，所采用的透明质酸巯基化衍生物中的巯基含量可通过Ellman’s试剂法或¹H NMR吸收谱图等方法测定(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，表示为每克透明质酸巯基化衍生物中含有的巯基的微摩尔数(μmol/g)。透明质酸巯基化衍生物的巯基化接枝度通常定义为每100个透明质酸二糖重复链段中所引入巯基数量的百分比。因为透明质酸巯基化衍生物二糖重复链段的分子量近似等于400Da，因此可通过巯基含量与巯基化接枝度可相互换算。例如当巯基含量为125μmol/g时，每100个二糖链段中引入的巯基数量为5个，亦即巯基化接枝度为5％。

在本发明中，各种巯基化接枝度的透明质酸巯基化衍生物均可用于制备本发明所述的透明质酸皮肤保护组合物，如Shu等报道的巯基化接枝度(巯基含量)为26.8％～66.8％(670μmol/g～1670μmol/g)的透明质酸巯基化衍生物(Shu等，Biomacromolecules2002,3:1304-1311)，Serban等报道的巯基化接枝度(巯基含量)为4％～14％(100μmol/g～350μmol/g)的巯基化衍生物(Serban等，Biomaterials 2008,29:1388-1399)，Shu等所报道巯基化接枝度(巯基含量)≤4.5％(≤112.5μmol/g)的透明质酸巯基化衍生物(US 2013/0338099A1)，以及CN101622017B中所公开的多种不同巯基含量的透明质酸巯基化衍生物。

在本发明中，巯基含量是透明质酸巯基化衍生物抗氧化能力的决定性因素。与未改性透明质酸比较，本发明所采用透明质酸巯基化衍生物的抗氧化能力显著增强，其清除自由基的能力可增强至10～40倍，甚至更高。一方面，巯基含量的提高有助于增强活性氧自由基的清除能力；但在另一方面，当巯基含量较少时，有助于更好保持透明质酸的原始结构及透明质酸本身所具有的护肤功能。因此，本发明所采用的透明质酸巯基化衍生物综合了上述两方面因素，巯基含量通常小于500μmol/g，优选小于100μmol/g，特别优选在20μmol/g～50μmol/g之间。

在本发明中，巯基含量在很大程度上决定了透明质酸巯基化衍生物的抗氧化能力，分子量对其抗氧化能力的影响很小。在本发明中，所采用的透明质酸巯基化衍生物的分子量通常在1KDa～10,000KDa之间，优选在1.6KDa～3,000KDa之间，特别优选在2.4KDa～1,500KDa之间。

在本发明中所述的分子量是指平均分子量。

在本发明所述的透明质酸皮肤保护组合物中，所含的透明质酸巯基化衍生物的浓度通常小于5mg/ml，优选小于2mg/ml，特别优选小于1mg/ml。

在本发明所述的透明质酸皮肤保护组合物中，也可以含有两种或两种以上透明质酸巯基化衍生物，这些巯基化衍生物可以具有不同的分子量和/或巯基含量。

在本发明所述的透明质酸皮肤保护组合物中，还同时含有至少一种分子量的透明质酸或其盐，其分子量通常在1KDa～10,000KDa之间，优选在1.6KDa～3,000KDa之间，特别优选在2.4KDa～2,800Kda之间。

在本发明所述的透明质酸皮肤保护组合物中，当含有两种或两种以上分子量的透明质酸或其盐时，优选其中至少一种透明质酸或其盐的分子量在1.6KDa～500KDa之间且其中至少一种透明质酸或其盐的分子量在800KDa～3,000KDa之间，特别优选其中至少一种透明质酸或其盐的分子量在2.4～8KDa之间且其中至少一种透明质酸或其盐的分子量在1,000KDa～2,800KDa之间。

在本发明所述的透明质酸皮肤保护组合物中，所含的透明质酸或其盐的浓度通常小于10mg/ml，优选小于8mg/ml，特别优选小于4mg/ml。

在本发明中，所述的透明质酸皮肤保护组合物中还可以添加维生素、氨基酸以及传统保湿剂(如山梨醇、聚乙二醇等)和抗氧化剂等物质。

本发明的透明质酸皮肤保护组合物通常可采用本领域技术人员所熟知的方式进行终端灭菌(如湿热灭菌)，可不添加防腐剂，可有效杜绝防腐剂所带来的危害。另一方面，如果需要，在本发明的透明质酸皮肤保护组合物中亦可适当加入本领域技术人员所熟知的防腐剂/抑菌剂。

与CN106137786B所公开的透明质酸抗衰组合物相比较，本发明组合物的自由基清除能力更为显著，自由基清除率可提高100％～1000％以上，因而本发明组合物用于皮肤保护时更具有独特的抗衰优势。

本发明的另一个目的是提供所述的透明质酸皮肤保护组合物的制备方法。所述的透明质酸皮肤保护组合物的制备方法，其特征在于各组分按照设定比例混合均匀即得。为了更好保持在本发明组合物中所含透明质酸巯基化衍生物的抗氧化能力，各组分混合均匀后亦可在惰性气氛保护下灌装于密封容器。

本发明的再一个目的是提供所述的透明质酸皮肤保护组合物的应用。所述的透明质酸皮肤保护组合物的应用是指皮肤清洁、护理、化妆品中的应用，具有保湿和抗氧化的功效。

所述的透明质酸皮肤保护组合物不仅具有透明质酸本身的保湿等护肤功效，同时还具有强抗氧化功效，可有效清除活性氧自由基，因而可有效改善皮肤老化症状和较好解决皮肤老化问题；可用于所有形式的化妆品和清洁产品中，包括柔肤水、精华液、啫喱、乳液、膏霜、面膜、彩妆、香皂、洗面奶和沐浴露。

本发明的有益效果是：

本发明的组合物含有透明质酸巯基化衍生物，可有效淬灭活性氧自由基等活性氧自由基，抑制其直接引起的氧化应激，防止脂质、蛋白质及DNA的损伤，同时还可以间接抑制羟基自由基等活性盐自由基的形成。此外，本发明的组合物还含一种分子量或多种不同分子量的透明质酸或其盐，可形成不同分子量的组合，充分发挥不同分子量透明质酸的保湿、软化角质层及修复滋养皮肤基底等多重皮肤保护效果。

本发明组合物用于皮肤保护时具有独特的优势，不仅具有透明质酸本身的多重皮肤保护效果，同时还具有强抗氧化能力，可有效清除活性氧自由基，因而可在有效改善皮肤老化症状，如增加皮肤弹性及减轻皱纹等，具有良好的皮肤保护效果。

附图说明

图1.不同浓度及巯基含量的透明质酸巯基化巯基化衍生物对DPPH自由基的清除率。

图2.不同分子量透明质酸巯基化巯基化衍生物对DPPH自由基的清除率。

图3.透明质酸皮肤保护组合物(含有一种分子量的透明质酸钠)对DPPH自由基的清除率。

图4.透明质酸皮肤保护组合物(含有两种分子量的透明质酸钠)对DPPH自由基的清除率。

图5.透明质酸皮肤保护组合物的保湿性能。

图6.透明质酸皮肤保护组合物对皮肤弹性的影响。

图7.透明质酸皮肤保护组合物对皮肤皱纹深度的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：不同巯基含量透明质酸巯基化衍生物清除自由基的抗氧化作用

以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)测试法评价本发明所采用的透明质酸巯基化衍生物的自由基清除性能。DPPH被广泛用于生物化学物质抗氧化能力的定量测定；此法是根据DPPH自由基有单电子，在波长为517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性；当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析(Sharma等，Food Chemistry2009,113:1202-1205)。

透明质酸巯基采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，其巯基含量分别为18μmol/g、38μmol/g、57μmol/g、108μmol/g、266μmol/g、416μmol/g和530μmol/g。

透明质酸钠原料及上述透明质酸钠巯基化衍生物分别溶于磷酸盐缓冲溶剂(pH7.4)，得到最终浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL或1mg/mL的测试样品。

用无水乙醇配置0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存。

将2mL测试样品溶液及2mL DPPH溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其在517nm处的吸光度(A1)；同时测定2mL DPPH溶液与2mL磷酸盐缓冲溶剂混合后在517nm处的吸光度(A0)以及2mL测试样品溶液与2mL无水乙醇混合后其在517nm处的吸光度(A2)。

自由基清除能力按如下公式计算：

本实施例的结果参见图1。测试结果表明DPPH自由基的清除率与测试样品中的巯基数量呈正相关性，巯基化透明质酸钠衍生物的清除率比透明质酸钠原料提高了约10～40倍。

实施例2：不同分子量透明质酸巯基化衍生物清除自由基的抗氧化作用

透明质酸巯基化衍生物分别以180KDa、300KDa和1,500KDa的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，其巯基含量分别为38μmol/g、33μmol/g和40μmol/g。

透明质酸钠原料及上述透明质酸钠巯基化衍生物分别溶于磷酸盐缓冲溶剂(pH7.4)，得到下表所述测试样品溶液。

按照实施例1所述的DPPH法测定上述样品溶液清除自由基的抗氧化作用。

本实施例的结果参见图2。测试样品1、3和5为不同分子量的透明质酸钠对照溶液，DPPH自由基清除率低；测试样品2、4和6为不同分子量的透明质酸巯基化衍生物的测试样品溶液，具有相同的巯基含量(38×10^-3μmol/mL)，DPPH自由基清除率相近，均比对照溶液增强约15倍。

实施例3：透明质酸皮肤保护组合物的制备(含有一种分子量的透明质酸钠)

所使用的透明质酸巯基化衍生物以180KDa的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，其巯基含量分别为18μmol/g、38μmol/g、57μmol/g、108μmol/g、266μmol/g、416μmol/g和530μmol/g。

所使用的透明质酸钠的分子量为1.6KDa、3KDa、8KDa、50KDa、180KDa、500KDa、800KDa、1,500KDa、2,700KDa。

上述任意一种巯基含量的透明质酸巯基化衍生物溶于蒸馏水，得到6mg/mL的溶液；上述任意一种分子量的透明质酸钠溶于蒸馏水，得到12mg/mL的溶液；然后按照0.9:0.1～0.1:0.9的体积比混合均匀，即得到不同配比的透明质酸皮肤保护组合物。在该等组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.4mg/mL～0.6mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的含量为1.2mg/mL～10.8mg/mL之间的任一浓度。

在所得到的组合物中，按照1:0.08～0.08:1的体积比加入蒸馏水，混合均匀即可得到稀释后的组合物。在该稀释组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.0mg/mL～0.04mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的含量为0.09mg/mL～10.0mg/mL之间的任一浓度。

上述组合物在惰性气氛(氮气)保护下灌入玻璃安瓶，封口待用。

实施例4：透明质酸皮肤保护组合物(含有一种分子量的透明质酸钠)清除自由基的抗氧化作用

选取10种实施例3所制备的透明质酸保护组合物(其组成如下表所示)，根据实施例1所描述的方法测定其清除自由基的抗氧化作用。

以相同分子量的透明质酸钠原料替代各组合物中的透明质酸巯基化衍生物作为对照。

本实施例的结果参见图3。各配比组合物均具有显著的清除自由基抗氧化能力，比对照增强了3.4～26倍。

实施例5：透明质酸皮肤保护组合物的制备(含有两种分子量的透明质酸钠)

所使用的透明质酸巯基化衍生物以180KDa的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，其巯基含量分别为18μmol/g、38μmol/g、57μmol/g、108μmol/g、266μmol/g、416μmol/g和530μmol/g。

所使用的透明质酸钠的分子量为1.6KDa、3KDa、8KDa、50KDa、180KDa、500KDa、800KDa、1,500KDa、2,700KDa。

上述任意一种巯基含量的透明质酸巯基化衍生物溶于蒸馏水，得到6mg/mL的溶液；上述任意两种分子量的透明质酸钠(任意重量比)溶于蒸馏水，得到总浓度为12mg/mL的溶液；然后按照0.9:0.1～0.1:0.9的体积比混合均匀，即得到不同配比的透明质酸皮肤保护组合物。在该等组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.4mg/mL～0.6mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的总浓度为1.2mg/mL～10.8mg/mL之间的任一浓度。

在所得到的组合物中，按照1:0.08～0.08:1的体积比加入蒸馏水，混合均匀即可得到稀释后的组合物。在该稀释组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.0mg/mL～0.04mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的总含量为0.09mg/mL～10.0mg/mL之间的任一浓度。

上述组合物在惰性气氛(氦气)保护下灌入玻璃安瓶，封口待用。

实施例6：透明质酸皮肤保护组合物(含有两种分子量的透明质酸钠)清除自由基的抗氧化作用

选取10种实施例5所制备的透明质酸保护组合物(其组成如下表所示)，根据实施例1所描述的方法测定其清除自由基的抗氧化作用。

以相同分子量的透明质酸钠原料替代各组合物中的透明质酸巯基化衍生物作为对照。

试验结果参见图4。各配比组合物均具有显著清除自由基的抗氧化能力，比对照增强了3.5～12倍。

实施例7：透明质酸皮肤保护组合物的制备(含有三种及以上分子量的透明质酸钠)

所使用的透明质酸巯基化衍生物以180KDa的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，其巯基含量分别为18μmol/g、38μmol/g、57μmol/g、108μmol/g、266μmol/g、416μmol/g和530μmol/g。

所使用的透明质酸钠的分子量为1.6KDa、3KDa、8KDa、50KDa、180KDa、500KDa、800KDa、1,500KDa、2,700KDa。

上述任意一种巯基含量的透明质酸巯基化衍生物溶于蒸馏水，得到6mg/mL的溶液；上述任意三种及以上分子量的透明质酸钠(任意重量比)溶于蒸馏水，得到总浓度为12mg/mL溶液；然后按照0.9:0.1～0.1:0.9的体积比混合均匀，即得到不同配比的透明质酸皮肤保护组合物。在该等组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.4mg/mL～0.6mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的总含量为1.2mg/mL～10.8mg/mL之间的任一浓度。

在所得到的组合物中，按照1:0.08～0.08:1的体积比加入蒸馏水，混合均匀即可得到稀释后的组合物。在该稀释组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.0mg/mL～0.04mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的总含量为0.09mg/mL～10.0mg/mL之间的任一浓度。

上述组合物在惰性气氛(氮气)保护下灌入玻璃安瓶，封口待用。

实施例8：透明质酸皮肤保护组合物的制备(含有两种及以上透明质酸巯基化衍生物和三种及以上分子量的透明质酸钠)

透明质酸巯基化衍生物分别以180KDa、300KDa和1,500KDa的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)，其巯基含量分别为38μmol/g、33μmol/g和40μmol/g。

所使用的透明质酸钠的分子量为1.6KDa、3KDa、8KDa、50KDa、180KDa、500KDa、800KDa、1,500KDa、2,700KDa。

上述任意两种及以上透明质酸巯基化衍生物(任意重量比)溶于蒸馏水，得到6mg/mL的溶液；上述任意三种及以上分子量的透明质酸钠(任意重量比)溶于蒸馏水，得到总浓度为12mg/mL溶液；然后按照0.9:0.1～0.1:0.9的体积比混合均匀，即得到不同配比的透明质酸皮肤保护组合物。在该等组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.4mg/mL～0.6mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的总含量为1.2mg/mL～10.8mg/mL之间的任一浓度。

在所得到的组合物中，按照1:0.08～0.08:1的体积比加入蒸馏水，混合均匀即可得到稀释后的组合物。在该稀释组合物中，透明质酸巯基化衍生物的含量为5.0mg/mL～0.04mg/mL之间的任一浓度，透明质酸钠的总含量为0.09mg/mL～10.0mg/mL之间的任一浓度。

上述组合物在惰性气氛(氮气)保护下灌入玻璃安瓶，封口待用。

实施例9：透明质酸皮肤保护组合物的保湿性能

选取实施例6中的透明质酸皮肤保护组合物(组合物编号5和6及其各自对照品)，将组合物0.5mL均匀涂布于在健康志愿者左右手臂内侧3×3cm²的试验区域。在涂抹前及涂抹后1、2和4小时时测定受试区域皮肤的含水量(Cornrometer CM825)。

皮肤水分相对增加量按如下公式计算：

试验结果参见图5。各配比组合物均具有良好的保湿能力，其保湿性能与对照相近，表明透明质酸巯基化衍生物不影响透明质酸的保湿性能。

实施例10：透明质酸皮肤保护组合物对皮肤弹性的影响

采用CN106137786B所公开的类似方法测定透明质酸组合物对皮肤弹性的影响。每组招募受试者6人，将透明质酸皮肤保护组合物(实施例6中组合物编号8和9及其各自对照品)涂抹在面颊部处，轻轻按摩至全部吸收。每天早晚净面后各一次，持续4周。分别于涂抹前及涂抹后4周用皮肤弹性测定仪MPA580(Courage+Khazaka公司，德国)测定面颊部位(苹果肌)的弹性变化状况。

本测试的弹性指数包括初弹性、净弹性和生物弹性，以该等三种弹性指数的平均值来表征皮肤弹性；皮肤弹性相对增加率(％)按如下公式计算：

试验结果参见图6。各配比组合物均明显增加了皮肤弹性，且比对照更为显著。

实施例11：透明质酸皮肤保护组合物对皮肤皱纹的影响

采用CN106137786B所公开的类似方法测定透明质酸组合物对皮肤皱纹的影响。每组招募受试者6人，将透明质酸皮肤保护组合物(实施例6中组合物编号8和9)涂抹在眼角处，轻轻按摩至全部吸收。每天早晚净面后各一次，持续4周。分别在使用前和使用后4周时用人体皮肤快速三维成像系统对受试者右眼皱纹深度进行评估。

皱纹平均深度相对减少值(％)按如下公式计算：

试验结果参见图7。各配比组合物均明显减少了皱纹深度，且比对照更为显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (25)

1.一种透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，该皮肤保护组合物含有：

1)透明质酸巯基化衍生物；和

2)至少一种分子量的透明质酸或其盐。

2.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的巯基含量小于500μmol/g。

3.根据权利要求2所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的巯基含量小于100μmol/g。

4.根据权利要求3所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的巯基含量在20μmol/g～50μmol/g之间。

5.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的分子量在1KDa～10,000KDa之间。

6.根据权利要求5所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的分子量在1.6KDa～3,000KDa之间。

7.根据权利要求6所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的分子量在2.4KDa～1,500Kda之间。

8.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的浓度小于5mg/ml。

9.根据权利要求8所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的浓度小于2mg/ml。

10.根据权利要求9所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸巯基化衍生物的浓度小于1mg/ml。

11.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐为钠盐。

12.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐的分子量在1KDa～10,000KDa之间。

13.根据权利要求13所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐分子量在1.6KDa～3,000KDa之间。

14.根据权利要求14所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐分子量在2.4KDa～2,800KDa之间。

15.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，该皮肤保护组合物同时含有两种或两种以上分子量的透明质酸或其盐。

16.根据权利要求15所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，至少一种所述的透明质酸或其盐的分子量在1.6KDa～500KDa之间且至少一种所述的透明质酸或其盐的分子量在800KDa～3,000KDa之间。

17.根据权利要求16所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，至少一种所述的透明质酸或其盐的分子量在2.4～8KDa之间且至少一种所述的透明质酸或其盐的分子量在1,000KDa～2,800KDa之间。

18.根据权利要求1所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐的浓度小于10mg/ml。

19.根据权利要求18所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐的浓度小于8mg/ml。

20.根据权利要求19所述的透明质酸皮肤保护组合物，其特征在于，所述的透明质酸或其盐的浓度小于4mg/ml。

21.一种如权利要求1-20中任一项所述的透明质酸皮肤保护组合物的制备方法，其特征在于，各组分混合均匀即得。

22.一种如权利要求21所述的透明质酸皮肤保护组合物的制备方法，其特征在于，各组分混合均匀后在惰性气氛保护下灌装于密封容器。

23.一种如权利要求1-20中任一项所述的透明质酸皮肤保护组合物在皮肤清洁、护理和化妆产品中的应用。

24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述的皮肤清洁、护理和化妆产品选自柔肤水、精华液、啫喱、乳液、膏霜、面膜、彩妆、香皂、洗面奶或沐浴露。

25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述的皮肤保护组合物在皮肤清洁、护理和化妆品中发挥保湿、清除自由基抗氧化、恢复皮肤弹性及减轻皮肤皱纹的功效。