CN111632026A - 一种自组装短肽水凝胶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自组装短肽水凝胶及其用途,属于医用材料技术领域,其至少包括:Ac‑FFGK‑NH2短肽和壳聚糖咖啡酸衍生物。本发明自组装短肽水凝胶含有大量褶皱,这些褶皱大大提高了材料的表面积,为其在药物包裹等方面的应用提供了广阔的接触空间,可以容纳更多的药物分子,同时还利于药物的持久释放,使得自组装短肽水凝胶可应用于药物递送中。同时,本发明自组装短肽水凝胶能够上调STAT3和VEGF的表达,且细胞相容性良好,有利于细胞的增殖,促进了创伤处的血管生成和肉芽组织再生,因此,本发明自组装短肽水凝胶可应用于制备伤口愈合和/或损伤修复材料。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域,具体涉及一种自组装短肽水凝胶及其用途。
背景技术
动物来源的生物材料,如胶原蛋白,层粘连蛋白和Matrigel,已成为3D细胞培养和组织工程支架的主要成分。然而,随着研究的深入,发现这些材料不适合医疗应用。首先,它们从活的动物组织分离,具有传播疾病的潜在风险,且Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤。其次,动物来源材料的质量通常因批次而异,并且可能由于材料中存在的未知细胞信号因子而产生不良影响。研究证实自组装短肽水凝胶作为一种新型的生物材料,具有可编程、成本低、黏弹性好、生物相容性高、免疫原性低等优点,在医学领域被广泛应用于组织工程、药物释放、止血和抗菌剂等方面。在生理条件下,自组装短肽能够通过非共价键作用自发且有规律地形成稳定的二级结构,再进一步堆叠为宽约10nm的纳米纤维体,自组装形成为孔径约5-200nm及含水量超过99%的水凝胶支架结构,在纳米纤维体之间有足够大的空间使细胞生长和分化,可模拟天然细胞外基质环境,促进干细胞的粘附、增殖和分化。在自组装短肽纳米纤维支架三维细胞培养系统中,自组装短肽纳米纤维支架可以提供足够的机械强度将细胞封装在一个合适的位置,提供细胞生长所需的基础营养、生长因子和氧释放,同时,由于该纳米纤维水凝胶良好的可注射性,它也可以作为干细胞输送载体用于细胞疗法中的原位注射。因此,自组装短肽水凝胶可用于细胞培养、组织工程、组织再生、伤口愈合和生物活性部分的释放,以及用于提供损伤或缺失组织的机械支持。
发明内容
本发明的目的在于一种可以容纳更多的药物分子,利于药物的持久释放,同时能够上调STAT3和VEGF的表达量且细胞相容性良好,快速地促进伤口愈合和损伤修复的改性壳聚糖。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为:一种自组装短肽水凝胶,其至少包括:Ac-FFGK-NH2短肽和壳聚糖咖啡酸衍生物。
Ac-FFGK-NH2短肽保护基团没有疏水单元,并且苯丙氨酸侧链苯环的疏水性要弱很多,所以只能在很高的浓度下才能发生聚集。而壳聚糖咖啡酸衍生物含有大量羟基和羧基,Ac-FFGK-NH2短肽分子中的氨基能够与其结合,不仅能形成较为稳定的网络结构,而且诱导Ac-FFGK-NH2短肽在较低浓度下自组装成含有大量褶皱的水凝胶,这些褶皱大大提高了材料的表面积,为其在药物包裹等方面的应用提供了广阔的接触空间,可以容纳更多的药物分子,同时还利于药物的持久释放,能够对药物进行递送。同时,本发明自组装短肽水凝胶能够上调达于创面组织上的相关蛋白(转导子和转录激活子(STAT3)及血管内皮生长因子(VEGF))的表达量,且细胞相容性良好,有利于细胞的增殖,促进了创伤处的血管生成和肉芽组织再生,因此,本发明自组装短肽水凝胶利于皮肤的再生,快速地促进伤口愈合和损伤修复。
根据本发明一实施方式,壳聚糖咖啡酸衍生物的制备方法为:在咖啡酸-甲醇溶液中加入磷酸盐缓冲液、漆酶和壳聚糖,在室温下搅拌反应3-6h,反应后依次用大量的磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮对产物进行漂洗,干燥,即得壳聚糖咖啡酸衍生物。
根据本发明一实施方式,自组装短肽水凝胶含有褶皱。
根据本发明一实施方式,自组装短肽水凝胶上调STAT3和VEGF的表达量。
本发明的又一目的,在于提供一种自组装短肽水凝胶的制备方法,将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液混合,使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
根据本发明一实施方式,Ac-FFGK-NH2短肽溶液的浓度为3-6mg/mL;所述壳聚糖咖啡酸衍生物的浓度为1-3mg/mL。
根据本发明一实施方式,Ac-FFGK-NH2短肽自组装pH值为5.0-7.5,温度为15-35℃,时间为2-7d。
本发明的又一目的,在于提供一种自组装短肽水凝胶在药物递送中的用途。
本发明的又一目的,在于提供一种自组装短肽水凝胶在制备伤口愈合和/或损伤修复材料中的用途。
根据本发明一实施方式,伤口为烫伤。
本发明的有益效果为:本发明自组装短肽水凝胶含有大量褶皱,这些褶皱大大提高了材料的表面积,为其在药物包裹等方面的应用提供了广阔的接触空间,可以容纳更多的药物分子,同时还利于药物的持久释放,能够对药物进行递送。同时,本发明自组装短肽水凝胶能够上调STAT3和VEGF的表达量,且细胞相容性良好,有利于细胞的增殖,促进了创伤处的血管生成和肉芽组织再生,因此,本发明自组装短肽水凝胶利于皮肤的再生,快速地促进伤口愈合和损伤修复。
附图说明
图1为本发明实施例1中壳聚糖和壳聚糖咖啡酸衍生物的红外吸收光谱;
图2为本发明实施例2中自组装短肽水凝胶的扫描电子显微镜图;
图3为本发明试验例1中自组装短肽水凝胶的流变性能测试曲线;
图4为本发明试验例1中自组装短肽水凝胶的蛋白酶降解试验结果;
图5为本发明试验例1中L929细胞的相对增殖率的计算结果;
图6为本发明试验例1中自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的截留率;
图7为本发明试验例1中自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的累积释放量;
图8为本发明试验例1中自组装短肽水凝胶处理烫伤创面中STAT3和VEGF表达的平均光密度。
具体实施方式
本发明允许各种修改及变形,其特定实施例进行了举例,下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意,相反,本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。
这些实施例只用于更具体地说明本发明,根据本发明的要旨,本发明的范围并非限定于这些实施例,这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。
本发明一实施方式提供了一种自组装短肽水凝胶,其至少包括:Ac-FFGK-NH2短肽和壳聚糖咖啡酸衍生物。
Ac-FFGK-NH2短肽保护基团没有疏水单元,并且苯丙氨酸侧链苯环的疏水性要弱很多,所以只能在很高的浓度下才能发生聚集。而壳聚糖咖啡酸衍生物含有大量羟基和羧基,Ac-FFGK-NH2短肽分子中的氨基能够与其结合,不仅能形成较为稳定的网络结构,而且诱导Ac-FFGK-NH2短肽在较低浓度下自组装成含有大量褶皱的水凝胶,这些褶皱大大提高了材料的表面积,为其在药物包裹等方面的应用提供了广阔的接触空间,可以容纳更多的药物分子,同时还利于药物的持久释放,能够对药物进行递送。同时,本发明自组装短肽水凝胶能够上调STAT3和VEGF的表达量,且细胞相容性良好,有利于细胞的增殖,促进了创伤处的血管生成和肉芽组织再生,因此,本发明自组装短肽水凝胶利于皮肤的再生,快速地促进伤口愈合和损伤修复。
于本发明一实施方式中,壳聚糖咖啡酸衍生物的制备方法为:在咖啡酸-甲醇溶液中加入磷酸盐缓冲液、漆酶和壳聚糖,在室温下搅拌反应3-6h,反应后依次用大量的磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮对产物进行漂洗,干燥,即得壳聚糖咖啡酸衍生物。
于本发明一实施方式中,自组装短肽水凝胶含有褶皱。
于本发明一实施方式中,自组装短肽水凝胶上调STAT3和VEGF的表达。
本发明一实施方式还提供了一种自组装短肽水凝胶的制备方法,将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液混合,使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
于本发明一实施方式中,Ac-FFGK-NH2短肽溶液的浓度为3-6mg/mL;所述壳聚糖咖啡酸衍生物的浓度为1-3mg/mL。
于本发明一实施方式中,Ac-FFGK-NH2短肽自组装pH值为5.0-7.5,温度为15-35℃,时间为2-7d。
于本发明一实施方式中,一种自组装短肽水凝胶的制备方法,包括:
1)将Ac-FFGK-NH2短肽溶于去离子水中,配置成浓度为3-6mg/mL的Ac-FFGK-NH2短肽溶液;
2)将壳聚糖咖啡酸衍生物溶于去离子水中,配置成浓度为1-3mg/mL的壳聚糖咖啡酸衍生物溶液;
3)将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液按照体积比为1:0.15-0.34混合,调节pH值为5.0-7.5,利用微型振荡器震荡20-50s,然后在15-35℃下放置2-7d使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
优选的,一种自组装短肽水凝胶的制备方法,包括在短肽自组装之前或期间添加被自组装短肽水凝胶包封的其它化合物,该化合物可选自生物活性分子或部分,例如生长因子、细胞因子、脂质、细胞受体配体、激素、前药、药物、维生素、抗原、抗体、抗体片段、寡核苷酸(包括但不限于DNA、信使RNA、短发夹RNA、小干扰RNA、微小RNA、肽核酸、适体)、糖;标签、染料,例如成像造影剂;病原体,例如病毒、细菌和寄生虫;量子点、纳米粒子和微粒,或其组合。
为了进一步提高自组装短肽水凝胶的机械强度和粘弹性,在自组装短肽水凝胶的制备过程中,Ac-FFGK-NH2短肽溶液中含有对氨基水杨酸,对氨基水杨酸中含有羟基、羧基和氨基官能团,能够通过共价接枝、氢键作用与Ac-FFGK-NH2短肽进行结合,提高Ac-FFGK-NH2短肽的自组装能力,进而提高自组装短肽水凝胶的机械强度和粘弹性,同时能够进一步提高自组装短肽水凝胶的载药能力,此外,Ac-FFGK-NH2短肽溶液中含有对氨基水杨酸的加入还能够进一步改善药物的持久释放。
于本发明一实施方式中,自组装短肽水凝胶的制备方法,包括:
1)将Ac-FFGK-NH2短肽和对氨基水杨酸溶于去离子水中,配置成浓度为3-6mg/mL的Ac-FFGK-NH2短肽溶液,其中含有22-50μg/mL的对氨基水杨酸;
2)将壳聚糖咖啡酸衍生物溶于去离子水中,配置成浓度为1-3mg/mL的壳聚糖咖啡酸衍生物溶液;
3)将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液按照体积比为1:0.15-0.34混合,调节pH值为5.0-7.5,利用微型振荡器震荡20-50s,然后在15-35℃下放置2-7d使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
本发明一实施方式还提供了一种自组装短肽水凝胶在药物递送中的用途。
本发明一实施方式还提供了一种自组装短肽水凝胶在制备伤口愈合和/或损伤修复材料中的用途。
于本发明一实施方式中,伤口为烫伤。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述:
实施例1:
壳聚糖咖啡酸衍生物的制备方法,具体为:将0.42g咖啡酸溶于20mL甲醇中得咖啡酸-甲醇溶液,加入150mL 60mM、pH 7.5的磷酸盐缓冲液、2mg漆酶和4g壳聚糖,在室温下搅拌反应3-6h,反应后依次用磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮对产物进行漂洗,干燥,即得壳聚糖咖啡酸衍生物。
将壳聚糖和壳聚糖咖啡酸衍生物和溴化钾混合后压片得样片,然后使用红外光谱仪对样片进行结构分析,扫描功率为50kHz,扫描范围为4000-500cm-1,扫描16次,分辨率为4.0cm-1,以空气作为采样背景。壳聚糖和壳聚糖咖啡酸衍生物的红外吸收光谱如图1所示,可以看出,图中a为壳聚糖的红外吸收光谱,图中b为壳聚糖咖啡酸衍生物的红外吸收光谱,可以看出,在壳聚糖咖啡酸衍生物的红外谱图中,在1710cm-1和1672cm-1处出现均新的吸收峰,其中,1710cm-1处的吸收峰属于酯键,1672cm-1处的吸收峰属于酰胺键,以上结果说明成功获得壳聚糖咖啡酸衍生物。
实施例2:
一种自组装短肽水凝胶的制备方法,包括:
1)将Ac-FFGK-NH2短肽(委托上海波泰生物科技有限公司采用固相合成法进行合成,纯度为94.07%)溶于去离子水中,配置成浓度为5mg/mL的Ac-FFGK-NH2短肽溶液;
2)将实施例1得壳聚糖咖啡酸衍生物溶于去离子水中,配置成浓度为2.8mg/mL的壳聚糖咖啡酸衍生物溶液;
3)将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液按照体积比为1:0.22混合,调节pH值为6.0,利用微型振荡器震荡40s,然后在25℃下放置3d使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
将自组装短肽水凝胶冷冻干燥机干燥,在其表面喷上20nm厚的金层,扫描电子显微镜下观察自组装短肽水凝胶的形貌,扫描电子显微镜以10kv的SE1电子模式进行图像扫描,如图2。从图2中可以看出,本实施例获得的自组装短肽水凝胶中含有大量褶皱,这可能是因为Ac-FFGK-NH2短肽不仅能够通过分子间氢键或者苯环的π-π堆积以及疏水作用等进行自组装,而且能够与壳聚糖咖啡酸衍生物进行充分的接触,形成较为稳定的氢键网络,从而获得自组成膜的自组装短肽水凝胶,而这些褶皱大大提高了自组装短肽水凝胶的表面积。
实施例3:
一种自组装短肽水凝胶的制备方法,包括:
1)将Ac-FFGK-NH2短肽和对氨基水杨酸溶于去离子水中,配置成浓度为5mg/mL的Ac-FFGK-NH2短肽溶液,其中含有36μg/mL的对氨基水杨酸;
2)将实施例1得壳聚糖咖啡酸衍生物溶于去离子水中,配置成浓度为2.8mg/mL的壳聚糖咖啡酸衍生物溶液;
3)将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液按照体积比为1:0.22混合,调节pH值为6.0,利用微型振荡器震荡20-50s,然后在25℃下放置3d使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
实施例4:
一种自组装短肽水凝胶的制备方法,包括:
1)将Ac-FFGK-NH2短肽溶于去离子水中,配置成浓度为5mg/mL的Ac-FFGK-NH2短肽溶液;
2)将壳聚糖溶于去离子水中,配置成浓度为2.8mg/mL的壳聚糖溶液;
3)将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖溶液按照体积比为1:0.22混合,调节pH值为6.0,利用微型振荡器震荡20-50s,然后在25℃下放置3d使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
实施例5:
一种自组装短肽水凝胶的制备方法,包括:
将Ac-FFGK-NH2短肽溶于去离子水中,配置成浓度为5mg/mL的Ac-FFGK-NH2短肽溶液,调节pH值为6.0,利用微型振荡器震荡20-50s,然后在25℃下放置3d使Ac-FFGK-NH2短肽自组装。
试验例1:
自组装短肽水凝胶的性能测试
1.自组装短肽水凝胶的流变性能测试
采用流变仪检测自组装短肽水凝胶的流变学性质,将实施例2、实施例3、实施例4水凝胶样品加入到可控平行托盘(平行托盘直径20mm,样品厚度1.0mm),上平板下移至平板间距为8mm,进行动态时间扫描,测量自组装短肽水凝胶的储能模量(G')和损耗模量(G”)。试验参数设定如下:在10μNm的振动转矩下,频率范围从0.1到100Hz。
图3为自组装短肽水凝胶的流变性能测试曲线,其中a为实施例2自组装短肽水凝胶的流变性能测试曲线,b为实施例3自组装短肽水凝胶的流变性能测试曲线。从图3-a中可以明显发现实施例2自组装短肽水凝胶的G″随着剪切频率的增加而下降,尤其是当剪切频率达到40Hz以后,尽管实施例2自组装短肽水凝胶的G′甚至有一定程度的增加;从图3-b中可以看出,在实施例3自组装短肽水凝胶在0.1-100Hz范围内,G′和G″均未受到明显影响,表现出更好的剪切频率稳定性,这说明和实施例2自组装短肽水凝胶相比,实施例3自组装短肽水凝胶具有更优的机械性能和粘弹性,亦即,在自组装短肽水凝胶的制备过程中,对氨基水杨酸的加入能够提高自组装短肽水凝胶的机械强度和粘弹性。
2.自组装短肽水凝胶的蛋白酶降解试验
将自组装短肽水凝胶浸没于模拟的胃液(0.5ml,10mMPBS-HCl,pH 2.0,20μg/mL胃蛋白酶)和肠液(10.0mM PBS,pH 7.4,20μg/mL胰蛋白酶)中,然后置于摇床中(150rpm,37℃)24h。随后在沸水中将样品煮沸致酶失活,用离心机在15000rpm下离心5min,最后收集上清液利用高效液相色谱和TC-C18柱子测量L-苯丙氨酸的含量。测量参数为波长210nm,流动相(水:乙腈=70:30,v/v),流动速率1.0mL/min,进样体积20μL。
图4为自组装短肽水凝胶的蛋白酶降解试验结果,从图4中可以看出,实施例2、实施例3均未检测到苯丙氨酸的存在,说明了实施例4和实施例5自组装短肽水凝胶对蛋白酶有较强的抵抗能力,并没有受到蛋白酶的分解作用。而实施例4和实施例5检测到苯丙氨酸的存在,说明了实施例4和实施例5自组装短肽水凝胶受到蛋白酶的分解作用。
3.自组装短肽水凝胶的细胞毒性
浸提液的制备:分别精密称定经钴60辐照25kGy灭菌的自组装短肽水凝胶0.5g到浸提瓶,根据医疗器械生物学评价标准(GB/T16886.12-2017)制备浸提液,即试验样品除材料的“吸收容量”外,以0.1g/mL比例进行浸提,将1640培养基放入37℃水浴预热30min,按除止血材料吸附容量,再以0.1g/mL比例加入培养基到上述含有止血粉浸提瓶中,37℃浸提72h。72h后取上层浸提液,10000rpm,离心10min。取上层浸提液,过膜(0.22μm)除菌,制备100%浸提液。
细胞培养:L929细胞在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的1640培养液中培养,培养箱条件设为37℃,5%CO2。当细胞处于对数生长期末汇合度约80%时,采用含1mM EDTA的0.25%胰酶溶液消化。将L929细胞接种于96孔板内,每孔3×103个,然后将96孔板放置于培养箱中孵育24h。取出96孔板,弃去旧液,分别加入收集的浸提液,每孔加150μL,继续放置培养箱中培养。48h后,取出,每孔加入CCK-8工作液(无血清1640:CCK-8=10:1)现配现用。放置培养箱中反应1-2h。放置酶标仪中读取OD值。测试波长450,每种样品设6个复孔,空白培养液为对照组。相对增殖率(%)通过如下公式计算:
相对增殖率=OD样品[OD450]/OD空白对照[OD450]×100%。
L929细胞的相对增殖率的计算结果如图5,从图中可以看出,实施例2自组装短肽水凝胶的相对增殖率高于实施例4和实施例5,这说明实施例2自组装短肽水凝胶的生物相容性良好,利于细胞的增殖和新生肉芽的生长,可快速愈合伤口;同时,实施例3自组装短肽水凝胶的相对增殖率稍高于实施例2,这说明实施例3自组装短肽水凝胶具有更佳的生物相容性,更有利于细胞的增殖和新生肉芽的生长;亦即,在自组装短肽水凝胶的制备过程中,对氨基水杨酸的加入能够提高自组装短肽水凝胶的生物相容性。
4.自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的吸附与释放
将自组装短肽水凝胶放入浓度为10mg/mL的牛血清内蛋白溶液中,在37℃水浴中放置24h,然后取出样品,在干燥器中室温下晾干。测定放入样品前后溶液的吸光度,计算样品对牛血清内蛋白的吸附量。将吸附牛血清内蛋白后的样品放入磷酸缓冲溶液中(pH=7.4),37℃下测定278nm处磷酸缓冲溶液的吸光度,根据牛血清内蛋白标准曲线计算样品吸附后在牛血清内蛋白溶液中的释放量。
牛血清内蛋白标准曲线的绘制:分别配制浓度为20、35、50、65、80、100mg/mL牛血清内蛋白溶液,先在冰箱中放置12h,然后在37℃条件下保温12h,然后用紫外分光光度计分别测定其在278nm处的吸光度,作牛血清内蛋白浓度与吸光度标准曲线,得到标准曲线方程为:y=0.0073x-0.0241,R2=0.9992。
牛血清内蛋白吸附量的测定:首先测定浓度为10mg/mL的牛血清内蛋白的吸光度,然后将样品放入该溶液中在37℃下吸附,取出样品,测定剩余牛血清内蛋白溶液的吸光度,根据标准曲线方程计算吸附前后牛血清内蛋白浓度变化,样品对牛血清内蛋白的截留率的计算如式如下:
截留率(%)=(m0-m1)/m1×100%;式中,
式中:m0为牛血清内蛋白初始含量,m1为样品吸附之后剩余牛血清内蛋白含量。
牛血清内蛋白释放量的测定:吸附牛血清内蛋白的样品经过干燥后放入37℃的缓冲溶液中,每隔一小时测定磷酸缓冲溶液的吸光度,根据牛血清内蛋白标准曲线计算磷酸缓冲溶液中牛血清内蛋白的含量,不同时间下的累积释放量,计算如式如下:
累积释放量(%)=(mt-m2)/mt×100%;式中,
mt为时间时牛血清内蛋白的含量,m2为复合材料吸附牛血清内蛋白的含量。
图6为自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的截留率,可以看出,实施例2自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的截留率高于实施例4和实施例5,这说明实施例2自组装短肽水凝胶可以吸附较多的药物分子;同时,实施例3自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的截留率高于实施例2,这说明实施例3自组装短肽水凝胶可以容纳更多的药物分子,亦即,在自组装短肽水凝胶的制备过程中,对氨基水杨酸的加入能够提高自组装短肽水凝胶对药物的吸附量。
图7为自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的累积释放量,可以看出,在相同时间下,实施例2自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的累积释放量低于实施例4和实施例5,这说明实施例2自组装短肽水凝胶利于药物的持久释放;同时,在相同时间下,实施例3自组装短肽水凝胶对牛血清内蛋白的截留率高于实施例2,这说明实施例3自组装短肽水凝胶更利于药物的持久释放,亦即,在自组装短肽水凝胶的制备过程中,对氨基水杨酸的加入能够进一步改善自组装短肽水凝胶对药物的持久释放性。
5.自组装短肽水凝胶对AG490损伤HUVEC细胞中STAT3和VEGF表达的影响
C57小鼠全皮层创伤模型制备:健康的C57小鼠,雌雄各半,6至8周龄,体重20-25g,SPF级,将C57小鼠麻醉,剃去背毛后75%酒精消毒,使用YLS-5Q台式超级控温烫伤仪在兔背部中线外侧2cm处对称制造6个烫伤创面,创面面积为2cm2,烫伤条件为:烫头温度100℃、作用压力1000g、烫头与皮肤接触时间为5s。实验期间每只C57小鼠单笼饲养,自由进水和饮食,伤口每日涂抹样品。所有的实验C57小鼠随机分组,雌雄各半,实验过程中造模48只C57小鼠。具体处理方法如下:对照组,采用无菌生理盐水润洗创面,每天1次。基质组、试验1组(实施例2自组装短肽水凝胶样品)、试验2组(实施例3自组装短肽水凝胶样品)、试验3组(实施例4自组装短肽水凝胶样品)、试验4组(实施例5自组装短肽水凝胶样品)首先用无菌生理盐水润洗创面后再涂抹样品,每天1次,整个实验过程为21天。取材部位为各组样品处理创面中心和边缘位置以及正常皮肤组织。每只动物采用自身对照法。
随机切取各组C57小鼠背部皮肤1.0cm×1.0cm创面(每次随机抽取6只),取样方法同4.2.7.1,将取下的皮肤组织块用常规福尔马林固定液固定48h以上。取出固定好的创伤组织,用流水漂洗过夜,24h后进行石蜡包埋,具体步骤如下:70%乙醇处理1h→80%乙醇处理1h→90%乙醇处理1h→95%乙醇(Ⅰ)处理1h→95%乙醇(Ⅱ)处理1h→100%乙醇(Ⅰ)处理1h→100%乙醇(Ⅱ)处理1h→正丁醇处理1h→二甲苯处理30min→溶蜡(Ⅰ)1.5h→溶蜡(Ⅱ)2h→包埋。
将制作好的石蜡切片按照以下步骤处理:1)首先用二甲苯Ⅰ处理10min,接着用二甲苯Ⅱ处理10min,无水乙醇处理5min,95%乙醇处理5min,75%乙醇处理5min,之后置于染缸内用流水冲洗;2)上述处理完的标本用3%过氧化氢避光处理8min,接着用纯水润洗漂洗3次,每次漂洗时间为5min;3)上述处理完的标本用浓度为0.01mmol/L的枸橼酸缓冲液进行微波抗原修复15min,然后放置于室温下,用纯水润洗漂洗3次,每次漂洗时间为5min;4)二抗封闭按照以下步骤进行,将切片置于湿盒内,用免疫组化笔标记后,用二抗血清在温度为37℃条件下封闭30min;5)一抗孵育,首先在标记中央加入稀释的一抗,约50μL/片,在4℃条件下孵育过夜后用纯水漂洗3次,每次漂洗5min;6)二抗孵育,首先在标记中央加入生物素标记的二抗,约50μL/片,接着在37℃条件下孵育30min,最后用纯水漂洗3次,每次漂洗5min;7)孵育SABC,在标记中央加入SABC试剂,约50μL/片,随后在37℃条件下孵育30min,最后用纯水漂洗3次,每次漂洗5min;8)DAB显色,在标记中央加入DAB显色液,约50μL/片,随后在37℃条件下显色,最后用纯水漂洗5min以终止显色;9)接着用苏木精淡染核5s,然后置于染缸内流水冲洗5min,用1%稀盐酸分化液浸润5s,最后置于染缸内流水冲洗5min;10)最后分别用80%乙醇处理30s,95%乙醇Ⅰ处理2min,95%乙醇Ⅱ处理2min,无水乙醇Ⅰ处理2min,无水乙醇Ⅱ处理2min,二甲苯处理3min,接着置于通风橱内,用中性树胶封片;11)置于光镜下观察胞浆或胞膜上出现的棕黄色或浅黄色颗粒即为阳性表达。采用Image-pro Plus图像分析软件,可随机选择3个视野,采用半定量的方法计算每个视野下的平均光密度值来估计STAT3和VEGF的表达情况。采用如下公式计算平均光密度值:
平均光密度值=积分光密度值/像素点的数量。
图8为自组装短肽水凝胶处理烫伤创面中STAT3和VEGF表达的平均光密度,可以看出,试验1组创面组织中STAT3和VEGF的表达水平高于对照组、试验3组和试验4组,而试验3组、试验4组、基质组与对照组创面组织中STAT3和VEGF的表达水平无明显差异,这说明实施例2自组装短肽水凝胶能够上调STAT3和VEGF的表达;同时,试验1组和试验2组创面组织中STAT3和VEGF的表达水平无明显差异,这说明实施例3制备方法不影响自组装短肽水凝胶上调STAT3和VEGF表达的效果。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明,而并非对本发明的限制,本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。因此,所有等同的技术方案也属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (10)
1.一种自组装短肽水凝胶,其至少包括:Ac-FFGK-NH2短肽和壳聚糖咖啡酸衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种自组装短肽水凝胶,其特征在于:所述壳聚糖咖啡酸衍生物的制备方法为:在咖啡酸-甲醇溶液中加入磷酸盐缓冲液、漆酶和壳聚糖,在室温下搅拌反应3-6h,反应后依次用大量的磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮对产物进行漂洗,干燥,即得壳聚糖咖啡酸衍生物。
3.根据权利要求1所述的一种自组装短肽水凝胶,其特征在于:所述自组装短肽水凝胶含有褶皱。
4.根据权利要求1所述的一种自组装短肽水凝胶,其特征在于:所述自组装短肽水凝胶上调STAT3和VEGF的表达量。
5.一种权利要求1-4任一项所述的自组装短肽水凝胶的制备方法,将Ac-FFGK-NH2短肽溶液和壳聚糖咖啡酸衍生物溶液混合,使Ac-FFGK-NH2短肽自组装,即得自组装短肽水凝胶。
6.根据权利要求5所述的一种自组装短肽水凝胶的制备方法,其特征在于:所述Ac-FFGK-NH2短肽溶液的浓度为3-6mg/mL;所述壳聚糖咖啡酸衍生物的浓度为1-3mg/mL。
7.根据权利要求5所述的一种自组装短肽水凝胶的制备方法,其特征在于:所述Ac-FFGK-NH2短肽自组装pH值为5.0-7.5,温度为15-35℃,时间为2-7d。
8.一种权利要求1-4任一项所述的自组装短肽水凝胶在药物递送中的用途。
9.一种权利要求1-4任一项所述的自组装短肽水凝胶在制备伤口愈合和/或损伤修复材料中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:所述伤口为烫伤。
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CN202010310522.7A CN111632026A (zh) | 2020-04-20 | 2020-04-20 | 一种自组装短肽水凝胶及其用途 |
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CN114634548A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-06-17 | 河南工业大学 | 一种混合水凝胶的制备方法及其在封装系统中的应用 |
CN114634548B (zh) * | 2021-10-08 | 2024-05-28 | 河南工业大学 | 一种混合水凝胶的制备方法及其在封装系统中的应用 |
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