CN108113977B - 一种红细胞膜包封的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法及其应用 - Google Patents

一种红细胞膜包封的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种红细胞膜包裹明胶载盐酸小檗碱纳米粒及其制备方法与应用。本发明制备得到的RBCM‑BH‑GNPs的粒度分布均匀，稳定性良好，RBCM‑BH‑GNPs呈现明显的壳‑核结构，单层红细胞膜包裹球形的BH‑GNPs。RBCM‑BH‑GNPs在体外不会引起红细胞溶血或凝集，可用于静脉注射。并且，本发明制备得到的RBCM‑BH‑GNPs在体外对BH具有明显体外缓释作用并且缓释作用优于BH‑GNPs，解决了BH普通注射缺乏缓释导致血药峰浓度过高引起的血管扩张、血压下降、心脏抑制等副反应等问题，为拓宽BH的临床应用，开发BH的中药新剂型提供了思路。

Description

一种红细胞膜包封的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法及 其应用
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种红细胞膜包裹明胶载盐酸小檗碱纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术
盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride,BH)作为一种止泻类非处方药品，临床使用不良反应较少，是治疗胃肠炎、细菌性痢疾等疾病的首选药物。作为一种中药有效成分，BH的用药安全性得到长久以来的保证。现代药理学研究发现，BH还有抗疟、抗高血压、抗高血脂、抗高血糖、抗心律不齐、抗肿瘤和抗炎等作用。虽然BH在临床上研究中具有较好的疗效，但水溶性差、半衰期短，普通注射后迅速进入器官与组织，且易引起血管扩张、血压下降、心脏抑制等副反应等问题，限制了对BH的进一步开发。
基于超分子材料的纳米载体作为药物输送载体具有良好的应用前景，可以改善药物的理化性质，实现其在体内的长效缓释。已报道的BH的纳米剂型包括纳米粒、固体脂质体、金纳米粒、微囊剂、微球、固体分散体、纳米悬浮剂、自纳米乳化给药系统、自微乳化给药系统等。如Zhiping Wang,Yan Li等人将小檗碱(Berberine,Ber)包裹在通过高压均化法制备的聚氧乙烯蓖麻油和甘油二十二烷酸酯固体脂质体内，得到的纳米剂型相比于游离药物，不仅解决了口服生物利用度低的用药问题，而且在更低的剂量下对链脲霉素诱导的高血糖C57BL/6小鼠有更好治疗作用；Ye Zhang和Hongming Liu通过乳化法制备的具有生物粘附性壳聚糖包裹藻朊酸盐/明胶载BH微球，药代动力学研究发现其相比于传统片剂的口服生物利用度提高了1.5倍；Shuang Guo和Guanhua Wang采用溶剂蒸发法制备了甲基丙烯酸酯共聚物和BH固体分散体，二者形成的无定型态的复合体利用其自身的pH敏感的溶解特性延长了药物的释放，相比于游离BH，降低了对结肠癌细胞的半抑制浓度，提高了药物的治疗作用。这些BH的纳米剂型在一定程度上改善了BH的用药问题，但它们始终不能解决BH普通注射缺乏缓释导致血药峰浓度过高的问题，因此难以克服其引起的血管扩张、血压下降、心脏抑制等副反应。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种红细胞膜包裹明胶载盐酸小檗碱纳米粒及其制备方法与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒，所述纳米粒的结构中包括红细胞膜、明胶纳米粒和盐酸小檗碱，所述盐酸小檗碱包封于所述纳米粒内部，所述红细胞膜包裹于所述明胶纳米粒外部。
进一步地，所述明胶的胶强度为100～260g Bloom。例如，所述明胶的胶强度可以是100Bloom、250g Bloom或260g Bloom。
进一步地，所述红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的粒径为90～306nm。所述红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的粒径也可以是250～306nm。所述红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的粒径还可以是90～260nm。
在本发明中，可用RBCM-BH-GNPs来指代红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒。
本发明的第二方面，提供前述红细胞膜包裹明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备明胶水溶液；
(2)将盐酸小檗碱溶解于步骤(1)中所得明胶水溶液中，获得溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液中；
(3)在步骤(2)中获得的溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液中，加入脱水剂，进行脱水；
(4)脱水后，加入交联剂，进行交联反应；
(5)交联反应完毕后，加入终止剂中止交联；
(6)透析除去游离的盐酸小檗碱，获得明胶载盐酸小檗碱纳米粒水溶液；
(7)将红细胞膜与步骤(6)获得的明胶载盐酸小檗碱纳米粒水溶液混合均匀，获得红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒。
进一步地，步骤(1)中，所述明胶的胶强度为100～260g Bloom。例如，所述明胶的胶强度可以是100Bloom、250g Bloom或260g Bloom。
进一步地，步骤(1)中，所述明胶水溶液的质量分数为0.1％～5％。
所述明胶水溶液的质量分数还可以为0.1％～1％。所述明胶水溶液的质量分数还可以为1％～5％。所述明胶水溶液的质量分数还可以为0.1％、1％或5％。
进一步地，步骤(2)中，明胶与盐酸小檗碱的质量比例为1:5～1:20。
明胶与盐酸小檗碱的质量比例还可以为1:5～1:10。明胶与盐酸小檗碱的质量比例还可以为1:10～1:20。明胶与盐酸小檗碱的质量比例还可以为1:5、1:10或1:20。
进一步地，步骤(3)中，溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液与脱水剂的体积比例为(0.8～1.0)：(1.0～1.2)。
步骤(3)中，溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液与脱水剂的体积比例可以为(0.8～0.9)：(1.1～1.2)。
步骤(3)中，溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液与脱水剂的体积比例可以为(0.9～1.0)：(1.0～1.1)。
步骤(3)中，溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液与脱水剂的体积比例还可以为0.8:1.2、0.9:1.1或1.0：1.0。
进一步地，步骤(3)中，所述脱水剂选自丙酮、乙醇、硫酸钠或异丙醇。
进一步地，步骤(4)中，在加热搅拌条件下，加入交联剂。
进一步地，所述加热的温度为45～55℃。所述加热的温度还可以为45～50℃。所述加热的温度还可以为50～55℃。
进一步地，所述搅拌速度为100～500rpm。
进一步地，步骤(4)中，交联反应的时间为1～2h。
交联反应的时间还可以是1～1.5h。交联反应的时间还可以是1.5～2h。交联反应的时间还可以是1h、1.5h或2h。
进一步地，步骤(4)中，交联剂选自戊二醛、D,L-甘油醛、乙二醛、京尼平、碳化二亚胺/N-羟基、离子交联剂如氯化钙。
进一步地，步骤(4)中，所述交联剂与明胶之间的质量比例为1:20～1:2。所述交联剂与明胶之间的质量比例为1:20或1:2。
进一步地，步骤(5)中，所述终止剂选自焦亚硫酸钠。
进一步地，步骤(5)中，所述终止剂可以是焦亚硫酸钠水溶液。所述焦亚硫酸钠水溶液的质量分数为0.4％～1.6％。
进一步地，步骤(7)中，红细胞膜为天然红细胞膜。进一步地，所述红细胞膜为来自大鼠、小鼠、豚鼠、羊或人的自体天然红细胞膜。
进一步地，所述红细胞膜的制备方法包括如下步骤：取血，分离血清和白细胞，破壁，离心，清洗后得到所述红细胞膜。
进一步地，步骤(7)中，每0.5mL全血对应获得的红细胞膜与0.6～1.2mL的明胶载盐酸小檗碱纳米粒水溶液混合。
进一步地，步骤(7)中，混合均匀后，进行超声。
进一步地，所述的超声条件为功率80-100w，超声时间为2-5min。
本发明的第三方面，提供一种由第二方面的制备方法获得的红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒。
本发明制备得到的红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒有如下特点：
红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的粒径粒度分布均匀，稳定性良好，平均包封率高，平均载药量高。
红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒呈现明显的壳-核结构，单层红细胞膜包裹球形的明胶纳米粒。
红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒保留了红细胞膜表面蛋白，可以被HEK293T细胞摄取并且在细胞内保持基本结构，在体外可以逃离RAW 264.7免疫细胞的摄取从而实现免疫逃离，并对人胚肾293T细胞和人肝LO2细胞没有明显毒性。红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒在体外对盐酸小檗碱具有明显体外缓释作用并且缓释作用优于没有红细胞包裹的明胶纳米粒，在体外不会引起红细胞溶血或凝集，可用于静脉注射。
本发明的第四方面，提供前述第一方面和第三方面提供的红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒在制备细菌(真菌)感染治疗药物、高血糖治疗药物、高血压治疗药物、高血脂治疗药物、心律失常治疗药物、或肿瘤治疗药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用单凝聚法合并加热法与传统单凝聚法可以提高盐酸小檗碱的包封率与载药量，得到的BH-GNPs粒径在243.6±3.7nm范围内，粒度分布均匀，大部分呈现球形结构，稳定性良好，BH的平均包封率高达65.78％，平均载药量高达6.36％。
(2)本发明制备得到的RBCM-BH-GNPs的粒径在260.3±4.1nm范围内，粒度分布均匀，稳定性良好，RBCM-BH-GNPs呈现明显的壳-核结构，单层红细胞膜包裹球形的BH-GNPs。RBCM-BH-GNPs在体外不会引起红细胞溶血或凝集，可用于静脉注射。
(3)本发明制备得到的RBCM-BH-GNPs在体外对BH具有明显体外缓释作用并且缓释作用优于BH-GNPs，解决了BH普通注射缺乏缓释导致血药峰浓度过高引起的血管扩张、血压下降、心脏抑制等副反应等问题，为拓宽BH的临床应用，开发BH的中药新剂型提供了思路。
附图说明
图1为连续三次制样RBCM-BH-GNPs与BH-GNPs的粒径对比图；
图2为RBCM-BH-GNPs和BH-GNPs的稳定性实验图；其中图2A为30天内BH-GNPs的粒径变化，图2B为30天内BH-GNPs的PDI变化，图2C为7天内RBCM-BH-GNPs的粒径变化，图D为7天内RBCN-BH-GNPs的PDI变化；
图3为RBCM-BH-GNPs和BH-GNPs的TEM图片，其中图3A为BH-GNPs，图3B为RBCM-BH-GNPs；
图4为SDS-PAGE凝胶电泳图谱；
图5为HEK 293T细胞摄取RBCM-BH-GNPs的激光共聚焦图；
图6为RAW 264.7巨噬细胞分别摄取BH-GNPs和RBCM-BH-GNPs的激光共聚焦图；
图7为不同浓度的RBCM-BH-GNPs对HEK 293T细胞和人肝LO2细胞的细胞毒性图；
图8为RBCM-BH-GNPs和BH-GNPs的体外释放曲线；
图9为RBCM-BH-GNPs的体外溶血实验图，其中图9A为37℃孵育3h后，图9B为静置24h后。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1 红细胞膜RBCM的制备
(1)取SD大鼠，称量其体重并记录；
(2)大鼠腹腔注射7％的水合氯醛溶液，以0.7mL/100g的量对大鼠进行麻醉，直至翻身反射消失；
(3)待大鼠完全麻醉后，解剖大鼠进行心脏穿刺取血，取出的血于冰盒内保存；
(4)取0.5mL EP管，向其中加入10μL 5mg/mL的肝素钠溶液，避光，向每个管中加入250μL血液，摇晃使其与肝素钠充分混合。3800rpm、4℃条件下，离心10min；
(5)去掉(4)中上清及白细胞层，加入1mL 1×PBS,充分混匀，3800rpm、4℃条件下，离心10min；
(6)重复(5)步骤1～2次；
(7)去掉(6)中上清的白细胞层，加入900μL 2mmol/L的EDTA溶液，混匀，再加入100μL 10×PBS，混匀，13200rpm、4℃条件下，离心10min；
(8)重复(7)步骤3遍以上，直至上清接近无色；
(9)吸弃上清，加入1000μL 2mmol/L的EDTA溶液，混匀，13200rpm、4℃条件下，离心10min；
(10)吸弃上清，将粉色/无色红细胞膜以每管0.5mL红细胞膜(对应0.5mL全血)收集至EP管中，-80℃保存。
实施例2 RBCM-BH-GNPs的制备
一、第一组制剂的制备：
(1)称取明胶固体颗粒(所述明胶的胶强度为250g Bloom)，加入超纯水，常温条件下搅拌30min溶胀后，于50℃水浴条件下加热溶解；将得到的溶液过滤并加入0.2M的NaOH溶液调节pH＝6.0，最后得到质量分数为0.5％的澄清明胶水溶液；
(2)于-20℃储存条件下取出质量分数为50％的戊二醛溶液，常温下溶解；向上述溶液中加入4倍体积的超纯水，稀释五倍，得到质量分数10％的戊二醛溶液；
(3)称取焦亚硫酸钠固体颗粒，加超纯水溶解，得到质量分数为1.6％的焦亚硫酸钠溶液，常温保存备用；
(4)称取10mg BH(盐酸小檗碱)，加入到20mL质量分数为0.5％的明胶溶液中，超声使其溶解；
(5)搅拌条件下向溶解有BH(盐酸小檗碱)的明胶溶液中加入等量丙酮，继续搅拌并加入500μL质量分数为10％的戊二醛溶液，于55℃条件下交联反应2h；
(6)向上述反应体系中加入8mL质量分数为1.6％的焦亚硫酸钠溶液中止交联，得到的BH-GNPs溶液(记为1-1号制剂)；
(7)以1×PBS为介质，以截留分子量为3500的透析袋将得到BH-GNPs纳米乳常温透析4h，除去游离的盐酸小檗碱；
(8)取已除去BH的BH-GNPs溶液1mL，用注射器液下加入到0.5mL红细胞膜(对应0.5mL全血)并充分混匀(红细胞膜与明胶的比例为1mL红细胞膜:5-8mg明胶)，100w强度超声2min，得到RBCM-BH-GNPs(记为1-2号制剂)。
连续三次在相同条件下制备两种纳米粒，如图1所示，得到的BH-GNPs(记为1-1号制剂)粒径在243.6±3.7nm范围内，RBCM-BH-GNPs(记为1-2号制剂)的粒径在260.3±4.1nm范围内，粒度分布均匀。
二、第二组制剂的制备：
(1)称取明胶固体颗粒(所述明胶的胶强度为260g Bloom)，加入超纯水，常温条件下搅拌30min溶胀后，于50℃水浴条件下加热溶解；将得到的溶液过滤并加入0.2M的NaOH溶液调节pH＝6.0，最后得到质量分数为0.1％的澄清明胶水溶液；
(2)于-20℃储存条件下取出质量分数为50％的戊二醛溶液，常温下溶解；向上述溶液中加入4倍体积的超纯水，稀释五倍，得到质量分数10％的戊二醛溶液；
(3)称取焦亚硫酸钠固体颗粒，加超纯水溶解，得到质量分数为0.4％的焦亚硫酸钠溶液，常温保存备用；
(4)称取1mg BH(盐酸小檗碱)，加入到20mL质量分数为0.1％的明胶溶液中，超声使其溶解；
(5)搅拌条件下向溶解有BH(盐酸小檗碱)的明胶溶液中加入22mL丙酮，继续搅拌并加入100μL质量分数为10％的戊二醛溶液，于45℃条件下交联反应1.5h；
(6)向上述反应体系中加入6.4mL质量分数为0.4％的焦亚硫酸钠溶液中止交联，得到的BH-GNPs溶液(记为2-1号制剂)；
(7)以1×PBS为介质，以截留分子量为3500的透析袋将得到BH-GNPs纳米乳常温透析4h，除去游离的盐酸小檗碱；
(8)取已除去BH的BH-GNPs溶液1.2mL，用注射器液下加入到0.5mL红细胞膜(对应0.5mL全血)并充分混匀(红细胞膜与明胶的比例为1mL红细胞膜:5-8mg明胶)，90w强度超声4min，得到RBCM-BH-GNPs(记为2-2号制剂)。
连续三次在相同条件下制备两种纳米粒，得到的BH-GNPs(记为2-1号制剂)粒径在203.7±4.5nm范围内，RBCM-BH-GNPs(记为2-2号制剂)的粒径在220.5±3.6nm范围内，粒度分布均匀。
三、第三组制剂的制备：
(1)称取明胶固体颗粒(所述明胶的胶强度为100g Bloom)，加入超纯水，常温条件下搅拌30min溶胀后，于50℃水浴条件下加热溶解；将得到的溶液过滤并加入0.2M的NaOH溶液调节pH＝6.0，最后得到质量分数为1％的澄清明胶水溶液；
(2)于-20℃储存条件下取出质量分数为50％的戊二醛溶液，常温下溶解；向上述溶液中加入4倍体积的超纯水，稀释五倍，得到质量分数10％的戊二醛溶液；
(3)称取焦亚硫酸钠固体颗粒，加超纯水溶解，得到质量分数为1.2％的焦亚硫酸钠溶液，常温保存备用；
(4)称取40mg BH(盐酸小檗碱)，加入到20mL质量分数为1％的明胶溶液中，超声使其溶解；
(5)搅拌条件下向溶解有BH(盐酸小檗碱)的明胶溶液中加入24mL丙酮，继续搅拌并加入1mL质量分数为10％的戊二醛溶液，于50℃条件下交联反应1.0h；
(6)向上述反应体系中加入21mL质量分数为1.2％的焦亚硫酸钠溶液中止交联，得到的BH-GNPs溶液(记为3-1号制剂)；
(7)以1×PBS为介质，以截留分子量为3500的透析袋将得到BH-GNPs纳米乳常温透析4h，除去游离的盐酸小檗碱；
(8)取已除去BH的BH-GNPs溶液0.7mL，用注射器液下加入到0.5mL红细胞膜(对应0.5mL全血)并充分混匀(红细胞膜与明胶的比例为1mL红细胞膜:5-8mg明胶)，85w强度超声3min，得到RBCM-BH-GNPs(记为3-2号制剂)。
连续三次在相同条件下制备两种纳米粒，得到的BH-GNPs(记为3-1号制剂)粒径在287.4±5.9nm范围内，RBCM-BH-GNPs(记为3-2号制剂)的粒径在302.9±2.6nm范围内，粒度分布均匀。
四、对比例
对比例一
(1)当明胶水溶液的质量分数大于5％时，溶液在常温下静置片刻即形成凝胶，无法进行后续实验。
对比例二
(1)称取明胶固体颗粒，加入超纯水，常温条件下搅拌30min溶胀后，于50℃水浴条件下加热溶解；将得到的溶液过滤并加入0.2M的NaOH溶液调节pH＝6.0，最后得到质量分数为0.5％的澄清明胶水溶液；
(2)于-20℃储存条件下取出质量分数为50％的戊二醛溶液，常温下溶解；
(3)称取焦亚硫酸钠固体颗粒，加超纯水溶解，得到质量分数为1.6％的焦亚硫酸钠溶液，常温保存备用；
(4)称取10mg BH(盐酸小檗碱)，加入到20mL质量分数为0.5％的明胶溶液中，超声使其溶解；
(5)搅拌条件下向溶解有BH(盐酸小檗碱)的明胶溶液中加入等量丙酮，继续搅拌并加入500μL质量分数为50％的戊二醛溶液，于55℃条件下交联反应2h；
(6)向上述反应体系中加入8mL质量分数为1.6％的焦亚硫酸钠溶液中止交联，得到的BH-GNPs溶液
连续三次在相同条件下制备纳米粒，得到的BH-GNPs溶液有明显沉淀，纳米粒粒径在893.4±9.5nm范围内，无法继续后续实验。
对比例三
(1)称取明胶固体颗粒，加入超纯水，常温条件下搅拌30min溶胀后，于50℃水浴条件下加热溶解；将得到的溶液过滤并加入0.2M的NaOH溶液调节pH＝6.0，最后得到质量分数为0.1％的澄清明胶水溶液；
(2)于-20℃储存条件下取出质量分数为50％的戊二醛溶液，常温下溶解；向上述溶液中加入4倍体积的超纯水，稀释五倍，得到质量分数10％的戊二醛溶液；
(3)称取焦亚硫酸钠固体颗粒，加超纯水溶解，得到质量分数为0.4％的焦亚硫酸钠溶液，常温保存备用；
(4)称取1mg BH(盐酸小檗碱)，加入到20mL质量分数为0.1％的明胶溶液中，超声使其溶解；
(5)搅拌条件下向溶解有BH(盐酸小檗碱)的明胶溶液中加入等量丙酮，继续搅拌并加入500μL质量分数为10％的戊二醛溶液，于55℃条件下交联反应4h；
(6)向上述反应体系中加入6.4mL质量分数为0.4％的焦亚硫酸钠溶液中止交联，得到的BH-GNPs溶液
连续三次在相同条件下制备纳米粒，得到的BH-GNPs溶液有明显沉淀，纳米粒粒径在693.4±7.3nm范围内，无法继续后续实验。
实施例3 RBCM-BH-G NPs的稳定性考察
制备好的RBCM-BH-GNPs和BH-GNPs常温保存，连续用马尔文激光粒度仪记录粒径和多分散性指数，连续测量BH-GNPs 30天，测量RBCM-BH-GNPs 7天，考察纳米粒的稳定性。由图2可看出，第一组制剂，BH GNPs(记为1-1号制剂)在30天内均有良好的稳定性，RBCM-BH-GNPs(记为1-2号制剂)在7天内均有良好的稳定性，PDI保持在0.15以下。同样地，第二组制剂，BH GNPs(记为2-1号制剂)在30天内均有良好的稳定性，RBCM-BH-GNPs(记为2-2号制剂)在7天内均有良好的稳定性，PDI保持在0.15以下。第三组制剂，BH GNPs(记为3-1号制剂)在30天内均有良好的稳定性，RBCM-BH-GNPs(记为3-2号制剂)在7天内均有良好的稳定性，PDI保持在0.15以下。
实施例4 RBCM-BH-GNPs包封率、载药量测量
使用高效液相色谱测量透析液中BH的浓度，按照式子：包封率＝(投入BH量-透析液中BH量)/投入BH量x100％；载药量＝(投入BH量-透析液中BH量)/(投入BH量-透析液中BH量+明胶质量)计算包封率和载药量。高效液相色谱的检测方法为：
色谱柱：Agilent SB-C18(50mm×4.6mm,5μm)
检测器：Agilent Technologies紫外检测器
流动相：乙腈-0.05mol/LKH2PO4(50:50)(每100mL中加入SDS0.4g，再以H3PO4调节至pH＝4)
流速：1mL·min-1
检测波长：345nm
柱温：25℃
进样体积：20μL
连续十次制样，计算得到的RBCM-BH-GNPs(记为1-2号制剂)平均包封率为67.58％，载药量6.36％。计算得到的RBCM-BH-GNPs(记为2-2号制剂)平均包封率约为62.33％，载药量5.97％。计算得到的RBCM-BH-GNPs(记为3-2号制剂)平均包封率约为65.24％，载药量约为6.21％。
实施例5 RBCM-BH-GNPs和BH-GNPs的结构观察
第一组制剂：
取BH GNPs(记为1-1制剂)溶液，摇匀，滴一滴在铜网上，滴加超纯水清洗三遍，滴一滴2％磷钨酸钠溶液，晾干后，置于透射电镜下观察并进行拍照。图3ATEM观察结果显示，大部分GNPs呈现均匀的球形结构，少部分粒径较大GNPs呈现不规则的多边形，可能是交联反应的搅拌过程中，磁力搅拌子与液面接触的部分有空气进入体系内，导致部分纳米粒交联反应不彻底，使得其呈现不规则的多边形且粒径较大。但是总体观察，大部分GNPs的结构良好，证明研究所采用的单凝聚合并加热法稳定可靠。图3B TEM结果显示，RBCM-GNPs(1-2制剂)呈现明显的壳-核结构，单层红细胞膜包裹在GNPs纳米粒外部，边界较清晰，与粒径测定结果一致。
第二组制剂：
取BH GNPs(记为2-1制剂)溶液，摇匀，滴一滴在铜网上，滴加超纯水清洗三遍，滴一滴2％磷钨酸钠溶液，晾干后，置于透射电镜下观察并进行拍照。同1-1制剂，大部分GNPs呈现均匀的球形结构。RBCM-GNPs(2-2制剂)呈现明显的壳-核结构，单层红细胞膜包裹在GNPs纳米粒外部，边界较清晰，与粒径测定结果一致。
第三组制剂：
取BH GNPs(记为3-1制剂)溶液，摇匀，滴一滴在铜网上，滴加超纯水清洗三遍，滴一滴2％磷钨酸钠溶液，晾干后，置于透射电镜下观察并进行拍照。同1-1制剂，大部分GNPs呈现均匀的球形结构。RBCM-GNPs(3-2制剂)呈现明显的壳-核结构，单层红细胞膜包裹在GNPs纳米粒外部，边界较清晰，与粒径测定结果一致。
实施例6 SDS-PAGE凝胶电泳验证RBCM膜表面蛋白
(1)配胶：将玻璃薄板和厚板底端对齐并插入蝴蝶夹中卡紧，固定至胶架上；按SDS-PAGE凝胶快速配配制试剂盒的说明，配制浓度为8％的分离胶，并使用移液枪紧贴厚板中央加入胶液至与蝴蝶夹红色横杆平齐，随后加入无水乙醇进行液封，使胶面平齐并消除气泡；室温下使分离胶凝固后，倒掉上层乙醇，再配置5％的浓缩胶按分离胶的加入方法加入到胶板中并立即插入15孔梳，室温静置等待胶凝；
(2)样品制备：根据实施例2中的方法制备BH-GNPs和RBCM-BH-GNPs，离心除去RBCM-BH-GNPs样品中游离的RBCM。分别取20μL BH-GNPs、RBCM-BH-GNPs和未经任何处理的RBCM，加入5μL上样缓冲液(Loading buffer)，混匀后于99℃煮沸10min，得到上样用样品；
(3)上样：浓缩胶凝固后，将玻璃板表面擦拭干净，薄板(短板)朝内放入电泳卡槽中夹紧，加入1×电泳缓冲液至电泳卡槽满，从左往右开始每孔依次加入10μL样品，第一个孔加入4μL蛋白Marker；
(4)电泳：加入1×电泳缓冲液至参考刻度线盖上槽改，连接电泳仪。设置电泳参数，电压：浓缩胶80V，时间40min；分离胶120V，时间1h；
(5)染色与脱色：电泳结束后，取出凝胶片于培养皿中，加入适量染色液染色1h后除去染色液，加入脱色液室温震荡脱色至背景几乎显无色，拍照记录蛋白分离情况；
第一组制剂：
如图4显示，天然RBCM实验组和RBCM-BH GNPs(记为1-2制剂)实验组经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，所显示的蛋白条带相同，而BH GNPs(记为1-1制剂)对照组没有相应蛋白条带，说明RBCM-BH GNPs(记为1-2制剂)保留了天然RBCM表面蛋白，证明了超声处理不会破坏天然RBCM的生物活性。可以预测，RBCM-BH GNPs(记为1-2制剂)在生物体内也可保持天然RBCM的生物活性，增加RBCN-BH GNPs(记为1-2制剂)的生物相容性，实现体内长循环，显著延长BH血液半衰期。
第二组制剂：
天然RBCM实验组和RBCM-BH GNPs(记为2-2制剂)实验组经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，蛋白条带相同，而BH GNPs(记为2-1制剂)对照组没有相应蛋白条带，说明RBCM-BH GNPs(记为2-2制剂)保留了天然RBCM表面蛋白，证明了超声处理不会破坏天然RBCM的生物活性。
第三组制剂：
天然RBCM实验组和RBCM-BH GNPs(记为3-2制剂)实验组经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，蛋白条带相同，而BH GNPs(记为3-1制剂)对照组没有相应蛋白条带，说明RBCM-BH GNPs(记为3-2制剂)保留了天然RBCM表面蛋白，证明了超声处理不会破坏天然RBCM的生物活性。
实施例7 激光共聚焦显微镜验证RBCM-BH-GNPs细胞内的结构
(1)人胚肾293T细胞培养：取冻存细胞，37℃水浴条件下快速融化，1000rpm离心5min，吸弃上清液；加入1mL完全培养液(DMEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗)，吹打均匀后加入培养皿中，培养24h；吸弃发黄的培养液，用PBS充分冲洗细胞表面，并弃去；加入1mL0.25％胰酶消化液，轻轻摇晃，使消化液与细胞充分接触；37℃孵育1min后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀，置15ml离心管，1000rpm离心5min后吸弃上清液加入2mL完全培养基培，吹打均匀(轻柔)；取50ml离心管，加入2ml吹打均匀的细胞液，用完培稀释；
(2)细胞铺板：将细胞计数器和盖玻片用75％的酒精消毒，将盖玻片盖在细胞计数板上后，将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间(不可有气泡)，于低倍镜下观察，计算计数板中四个角上的四大格细胞总数(压线细胞只计左侧和上方)：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104
取灭菌24孔细胞培养板，接种灭菌爬片，每孔约105个细胞。向爬片中央接种约40μL细胞液，培养4h帖壁后，再加入960μL完全培养基，放入CO2培养箱培养过夜；
(3)RBCM染色：取10μL 1mg/mL的Dil储备液，用1×PBS稀释到1mL作为Dil工作液(浓度为10μg/mL)，取0.5mL红细胞膜，加入0.5mL Dil工作液，37℃条件下避光恒温孵育40min，用0.5mL 1×PBS洗4次，4000r/min 4℃离心8min，最后得到的沉淀用0.5mL1×PBS溶解备用；
(4)FITC-GNPs制备：向20mL 0.5％的明胶溶液中加入200μL 1mg/mL的FITC溶液，单凝聚合法制备FITC-GNPs，得到染色纳米粒；
(5)染色RBCM-BH-GNPs制备：用染色的RBCM和FITC-GNPs制备染色的RBCM-FITC-GNPs。
(6)细胞定性摄取实验:：吸弃上述细胞培养液，以PBS清洗细胞两遍后，向其中加入500μL含有1％双抗的DMEM培养基和100μL样品，于37℃的CO2培养箱培养中孵育4h，从细胞培养箱中取出，后续操作均避光完成；
①弃掉培液，用PBS清洗细胞两次(浸泡约1min后再弃掉PBS)；
②加入400μL 4％的多聚甲醛溶液，固定15min；
③吸弃溶液，用PBS清洗细胞三次(浸泡约1min后再弃掉PBS)；
④取10μL DAPI储备液于1mL 1×PBS中，制得DAPI工作液。向每个样品孔中加入400μL DAPI工作液，染核8min；
⑤吸弃溶液，用PBS清洗细胞三次(浸泡约1min后再弃掉PBS)；
⑥取载玻片，向载波片中心滴加20μL抗荧光淬灭液，用镊子取爬片倒扣于载玻片上，注意不要产生气泡，无色指甲油封片；
⑦激光共聚焦显微镜下观察。
第一组制剂：
由图5可看出，RBCM(B)和纳米粒(C)均出现在蓝色细胞核(A)周围，且二者位置重合(D)，显示RBCM-FITC-GNPs(记为1-2制剂)在体外能够被HEK 293T细胞摄取并且在细胞内保持基本的壳-核结构。
第二组制剂：
RBCM-FITC-GNPs(记为2-2制剂)在体外能够被HEK 293T细胞摄取并且在细胞内保持基本的壳-核结构。
第三组制剂：
RBCM-FITC-GNPs(记为3-2制剂)在体外能够被HEK 293T细胞摄取并且在细胞内保持基本的壳-核结构。
实施例8 RBCM-BH-GNPs的体外免疫逃离实验
(1)RAW 264.7巨噬细胞培养：取冻存细胞，37℃水浴条件下快速融化，1000rpm离心5min，吸弃上清液；加入1mL完全培养液(1640培养基+10％胎牛血清+1％双抗)，吹打均匀后加入培养皿中，培养24h；吸弃发黄的培养液弃去；用完全培养基反复吹打帖壁细胞直至全部细胞脱落，吹打均匀，置15ml离心管，1000rpm离心5min后吸弃上清液加入2mL完全培养基培，吹打均匀(轻柔)；取50ml离心管，加入2ml吹打均匀的细胞液，用完培稀释；
(2)细胞铺板：细胞计数后，取灭菌24孔细胞培养板，接种灭菌爬片，每孔约105个细胞。向爬片中央接种约40μL细胞液，培养4h帖壁后，再加入960μL完全培养基，放入CO2培养箱培养过夜；
(3)Cy5-GNPs制备：向20mL 0.5％的明胶溶液中加入200μL 1mg/mL的Cy5-NHS溶液，单凝聚合法制备Cy5-GNPs；
(4)RBCM-Cy5-GNPs制备：RBCM和Cy5-GNPs混合后超声制备RBCM-Cy5-GNPs；
(5)细胞定性摄取实验:：吸弃上述细胞培养液，以PBS清洗细胞两遍后，向其中加入500μL含有1％双抗的1640培养基和100μL样品，于37℃的CO2培养箱培养中孵育2h，从细胞培养箱中取出，后续操作均避光完成；
①弃掉培液，用PBS清洗细胞两次(浸泡约1min后再弃掉PBS)；
②加入400μL 4％的多聚甲醛溶液，固定15min；
③吸弃溶液，用PBS清洗细胞三次(浸泡约1min后再弃掉PBS)；
④取载玻片，向载波片中心滴加20μL抗荧光淬灭液，用镊子取爬片倒扣于载玻片上，注意不要产生气泡，无色指甲油封片；
⑤激光共聚焦显微镜下观察。
第一组制剂：
由图6可看出，RAW 264.7巨噬细胞在体外能够摄取Cy5-GNPs(记为1-1制剂)而对RBCM-Cy5-GNPs(记为1-2制剂)没有明显的摄取作用，证明通过RBCM的包裹，能够帮助纳米粒实现免疫逃离。可以预测，RBCM-BH-GNPs能够在体内实现免疫逃离，避免被巨噬细胞清除，进而实现体内的长循环作用。
第二组制剂：
RAW 264.7巨噬细胞在体外能够摄取Cy5-GNPs(记为2-1制剂)而对RBCM-Cy5-GNPs(记为2-2制剂)没有明显的摄取作用，证明通过RBCM的包裹，能够帮助纳米粒实现免疫逃离。
第三组制剂：
RAW 264.7巨噬细胞在体外能够摄取Cy5-GNPs(记为3-1制剂)而对RBCM-Cy5-GNPs(记为3-2制剂)没有明显的摄取作用，证明通过RBCM的包裹，能够帮助纳米粒实现免疫逃离。
实施例9：RBCM-BH-GNPs在体外对人胚肾293T细胞和人肝LO2细胞的毒性验证(1)细胞培养：HEK 293T细胞的培养条件为DMEM培养基+10％FBS+1％双抗，LO2细胞的培养条件为1640培养基+10％FBS+1％双抗，37℃，5％CO2；
(2)细胞铺板：细胞计数后，取灭菌96孔细胞培养板，向每孔加入100μL细胞液，每孔接种约104个细胞，培养过夜；
(3)细胞给药：吸弃培养基，加入不同浓度的RBCM-BH-GNPs(30,60,120,240,300,480,600and 750μg/mL)，并补加完全培养基至总体积为100μL，培养24h。
(4)显色：吸弃培养基，加入100μL完全培养家与10μL CCK-8溶液，避光条件下继续孵育4h。
(5)450nm波长处用酶标仪读取各孔吸光度并记录。
第一组制剂：
如图7显示，不同浓度的RBCM-BH-GNPs(记为1-2制剂)在体外对HEK 293T细胞和LO2细胞均没有明显毒性，证明该递药系统具有很好的安全性。
第二组制剂：
不同浓度的RBCM-BH-GNPs(记为2-2制剂)在体外对HEK 293T细胞和LO2细胞均没有明显毒性，证明该递药系统具有很好的安全性。
第三组制剂：
不同浓度的RBCM-BH-GNPs(记为3-2制剂)在体外对HEK 293T细胞和LO2细胞均没有明显毒性，证明该递药系统具有很好的安全性。
实施例10 体外释放实验
分别取2mL BH溶液、BH-GNPs溶液、和RBCM-BH-GNPs溶液于透析袋中(MW 3500)，封口后置于20mL 1×PBS中，样品于恒温震荡箱(37℃)中，分别于0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120h取出1mL释放液并补加1mL新鲜释放外液，于12h和36h时用20mL新鲜释放外液替换全部释放液。HPLC测定各个时间点释放液的BH浓度，计算BH的累计释放量。
第一组制剂：
由图8看出，RBCM-BH-GNPs(记为1-2制剂)和BH-GNPs(记为1-1制剂)相比于游离BH，均对BH有明显的缓释作用。在0-2h内，BH-GNPs的对BH的缓释作用优于RBCM-BH-GNPs，可能是由于超声处理使得部分BH外泄。4h-120h的释放时间内，RBCM-BH-GNPs对BH的缓释效果优于BH-GNPs。累计释放时间为4h时，BH-GNPs的BH累计释放量为65.4％，而RBCM-BH-GNPs的BH累计释放量小于60％；累计释放时间为120h时，BH-GNPs的BH累计释放量为82.46％，而RBCM-BH-GNPs的BH累计释放量为78.42％。实验证明RBCM在BH-GNPs外面形成的物理屏障能够进一步加强BH-GNPs的缓释效果。
第二组制剂：
累计释放时间为120h时，BH-GNPs(记为2-1制剂)的BH累计释放量为80.39％，而RBCM-BH-GNPs(记为2-2制剂)的BH累计释放量为75.91％。实验证明RBCM在BH-GNPs外面形成的物理屏障能够进一步加强BH-GNPs的缓释效果。
第三组制剂：
累计释放时间为120h时，BH-GNPs(记为3-1制剂)的BH累计释放量为84.83％，而RBCM-BH-GNPs(记为3-2制剂)的BH累计释放量为79.99％。实验证明RBCM在BH-GNPs外面形成的物理屏障能够进一步加强BH-GNPs的缓释效果。
实施例11 体外溶血实验
取无菌脱纤维绵羊血5mL，加入等体积生理盐水混合后2000rpm，离心4min，吸弃上层液体。重复用生理盐水洗涤3次，直至上清呈无色澄清。离心收集红细胞，加入生理盐水，制成2％(v/v)的红细胞混悬液。取7支试管，按表1列出的配比量依次加入红细胞混悬液、生理盐水和蒸馏水。混匀后，置于37℃恒温箱中30min，然后按表1要求分别加入不同量的RBCM-BH-GNPs，试管6用生理盐水代替样品作为阴性对照，试管7用蒸馏水代替样品作为阳性对照。摇匀后，置于37℃恒温箱中孵育3h，观察记录。继续静置24h，记录溶血情况并进一步在倒置显微镜下观察红细胞聚集情况。
第一组制剂：
由图9看出，阳性对照(蒸馏水)组溶液为澄清的红色，底部无细胞残留，显示红细胞全部溶血。给药组在由低至高的浓度梯度下，红细胞全部下沉，上清无色澄清，进一步在倒置显微镜下观察，无红细胞聚集，与阴性对照组没有明显差异，显示各浓度下的RBCM-BH-GNPs(记为1-2制剂)均不会引起红细胞溶血或聚集，可用于静脉注射。
表1 RBCM-BH-GNPs的体外溶血实验分组
Figure BDA0001559184260000171
第二组制剂：
浓度下的RBCM-BH-GNPs(记为2-2制剂)均不会引起红细胞溶血或聚集，可用于静脉注射。
第三组制剂：
浓度下的RBCM-BH-GNPs(记为3-2制剂)均不会引起红细胞溶血或聚集，可用于静脉注射。
综上所述，本发明的发明人经过广泛而深入的研究发现，明胶是一种天然高分子材料，具有无毒、生物相容性好、生物可降解等特点。其作为药物载体有明显的缓释作用，从而增加药物的治疗效果，降低毒副作用。红细胞(Red blood cell,RBC)是血液中数量最多且寿命最长的血细胞，可以在体内存活120天，具备成为药物载体，发挥药物长效的理论基础。红细胞膜(Red blood cell membrane,RBCM)量大，来源与提取相对简单，本身也能作为药物输送载体在血管内运输。其包裹小分子药物，不仅可以延缓药物释放，还能提高药物输送系统的生物相容性，避免其被免疫系统清除，从而实现药物在生物体内的长循环，显著延长其血液半衰。
本发明构建了红细胞膜包裹明胶载BH纳米粒递药系统，该递药系统通过明胶和天然RBCM的包裹对BH实现缓释，利用天然RBCM来提高系统的生物相容性，实现递药系统的长循环功能，实现了BH的长效缓释。并解决了BH半衰期短、普通注射剂缺乏缓释从而导致血管扩张、血压下降、心脏抑制等副反应等问题，提高疗效以拓宽BH的临床应用。
此外，经过试验发现，丙酮还可采用、乙醇、硫酸钠或异丙醇来代替，均可取得与第一组制剂、第二组制剂或第三组制剂类似的效果。
戊二醛还可采用D,L-甘油醛、乙二醛、京尼平、碳化二亚胺/N-羟基、或离子交联剂如氯化钙来代替，均可取得与第一组制剂、第二组制剂或第三组制剂类似的效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法，所述纳米粒的结构中包括红细胞膜、明胶纳米粒和盐酸小檗碱，所述盐酸小檗碱包封于所述纳米粒内部，所述红细胞膜包裹于所述明胶纳米粒外部；
所述方法包括如下步骤：
(1)制备明胶水溶液；所述明胶的胶强度为100～260g Bloom；所述明胶水溶液的质量分数为0.1％～5％；
(2)将盐酸小檗碱溶解于步骤(1)中所得明胶水溶液中，获得溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液中；明胶与盐酸小檗碱的质量比例为1:5～1:20；
(3)在步骤(2)中获得的溶解有盐酸小檗碱的明胶水溶液中，加入脱水剂，进行脱水；所述脱水剂选自丙酮、硫酸钠或异丙醇；
(4)脱水后，在加热搅拌条件下加入交联剂，进行交联反应；交联反应的时间为1～2h；所述交联剂选自戊二醛、D,L-甘油醛、乙二醛、京尼平、或氯化钙，所述交联剂与明胶之间的质量比例为1:20～1:2；
(5)交联反应完毕后，加入焦亚硫酸钠中止交联；
(6)透析除去游离的盐酸小檗碱，获得明胶载盐酸小檗碱纳米粒水溶液；
(7)将红细胞膜与步骤(6)获得的明胶载盐酸小檗碱纳米粒水溶液混合均匀，进行超声，获得红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒；每0.5mL全血对应获得的红细胞膜与0.6～1.2mL的明胶载盐酸小檗碱纳米粒水溶液混合。
2.根据权利要求1所述的红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法，其特征在于，所述红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的粒径为90～306nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述加热的温度为45～55℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述搅拌速度为100～500rpm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的超声条件为功率80-100w，超声时间为2-5min。
6.由权利要求1～5之任一项所述制备方法获得的红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒。
7.如权利要求6所述红细胞膜包裹的明胶载盐酸小檗碱纳米粒在制备细菌感染治疗药物、高血糖治疗药物、高血压治疗药物、高血脂治疗药物、心律失常治疗药物、或肿瘤治疗药物中的用途。
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