CN115737895A

CN115737895A - 一种用于抗肝癌的磁性栓塞微球及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115737895A
Application number: CN202211405206.3A
Authority: CN
Inventors: 周娟; 陈皓; 陈敬华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种用于抗肝癌作用的磁性栓塞微球及其制备方法与应用，属于生物医药技术科领域。本发明的一种用于抗肝癌作用的磁性栓塞微球制备方法包括将甲基丙烯酰化明胶、磁性纳米粒子、糖原阿霉素Gly‑DOX和光引发剂分散于水中，形成混合体系，作为分散相；将油相作为连续相；采用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得W/O乳液，在紫外光下进行照射，冷冻干燥，即得栓塞微球。该栓塞微球具有很好的机械稳定性、生物相容性以及良好溶胀降解能力，可以充当良好的栓塞剂；微球的制备方法简单，可进行批量生产，并具有良好的应用前景。

Description

一种用于抗肝癌的磁性栓塞微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种用于抗肝癌的磁性栓塞微球及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

随着人口的增长和老龄化，全球癌症负担不断增加，其中肝细胞癌的高发病率和死亡率备受关注。根据肿瘤大小、肿瘤部位、肝外扩散、潜在肝功能和患者状态，可选择手术切除、肝移植、化疗、放疗、介入治疗和热消融治疗肝癌。然而，由于肝癌的隐匿发病率，大多数肝癌患者在首次诊断时已经处于中晚期，此时往往错过手术或消融的机会。

经导管动脉化疗栓塞术(TACE)涉及动脉内灌注栓塞材料和化疗药物，已在肝癌患者中实施了30多年。TACE的主要目的是将高剂量的药物选择性地输送到肿瘤部位，同时尽量减少药物清除。I型胶原蛋白是一种主要的有机成分。而变性胶原明胶由于其与天然细胞外基质(ECM)非常相似，因此在仿生水凝胶研究中被广泛使用。

合成材料作为“生物材料”不仅需要满足“材料”的物理稳定性要求，而且还需要满足“生物”的要求，以使其具有生物可降解性、生物相容性和生物活性，以便它们能够促进细胞增殖、迁移和营养物质的运输并在组织再生过程中逐渐降解或吸收。

磁性纳米粒子有一系列独特而优越的物理和化学性质。随着合成技术的发展，已成功生产出一系列形状可控、稳定性好、单分散的磁性纳米粒子。Fe₃O₄一般对人体不产生毒副作用，整个疗程所用的载体含铁量不超过贫血病人的常规补铁总量，除部分被人体利用外，其余的磁性粒子能通过皮肤、胆汁、肾脏等安全排出体外。磁性纳米粒子在生物医学方面的应用主要分为两大类：体外应用主要包括分离纯化、磁性转染、免疫分析、催化、固相萃取等。体内应用可大致分为治疗和诊断两类，治疗方面的应用如热疗和磁靶向药物，诊断方面的应用如核磁共振成。

糖原是一种动物淀粉，又称肝糖或糖元，由葡萄糖结合而成的支链多糖，其糖苷链为α型，是动物的贮备多糖，可以直接靶向肝脏部位。

水凝胶微球的常用制作方法可分为批量乳化法、光刻法、电喷法、机械破碎法和微流控合成法。批量乳化法是将不相容的液体混合在一起生成可交联的水凝胶液滴；光刻法是将光聚焦在掩模版或者模具上固化交联形成水凝胶微球；电喷法是在针头和接收液滴之间加上电压，使施加的电压克服针尖处的表面张力，形成了带电的液滴射流，在接收液中交联形成水凝胶微球；在机械破碎方法中，将预先形成的块状水凝胶通过机械破碎成水凝胶微球；微流控法将载有不相容液体通过微流道连接，在交汇处产生液滴，然后将液滴交联形成水凝胶微球，该方法适用于快速产生稳定的尺寸可控的微球。但是，这种方法有一些缺点，限制了其生物医学应用。首先，微流体技术需要昂贵的毛细管装置或微通道芯片，这在组装上也存在技术挑战，并极大地影响实验结果；其次，由于微流体装置没有交联，因此水凝胶微滴只能在下游交联，在那里它们会融合并变得不稳定。因此，有必要设计一种新方法，以确保简单、快速的操作使微球交联。另外，已经上市的栓塞微球生物相容性差，不容易降解，会造成二次栓塞。

发明内容

针对上述存在的不足与缺陷，本发明为了解决现有的栓塞微球制备工艺复杂、粒径不均一、生物相容性和可降解性不优良、价格昂贵等缺点，提供一种可栓塞的水凝胶微球及其制备方法与应用，本发明使用微流控技术，以甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、磁性纳米粒子(MNPs)和糖原阿霉素(Gly-DOX)为原料制备了一种栓塞的水凝胶微球，其直径分布在300～500μm之间，粒径可控，理化性质稳定，表面粗糙多孔，生物相容性较好，能够溶胀阻塞血管，并且能够通过核磁共振显影，实时监控栓塞微球在体内的具体活动轨迹，以及抗肿瘤的效果。

本发明的第一个目的是提供一种用于抗肝癌的磁性栓塞微球制备方法，所述方法包括如下过程：

将甲基丙烯酰化明胶、磁性纳米粒子、糖原阿霉素Gly-DOX和光引发剂分散于水中，形成混合体系，作为分散相；将油相作为连续相；然后采用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得W/O乳液，然后将W/O乳液在紫外光下进行照射，冷冻干燥，即得磁性栓塞微球。

在一种实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶相对水的质量浓度为8％～10％。

在一种实施方式中，所述磁性纳米粒子的相对水的质量浓度为0.03％～0.5％；优选为0.05％～0.1％。

在一种实施方式中，所述糖原阿霉素Gly-DOX相对水的质量浓度为0.1％～0.5％。

在一种实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶、磁性纳米粒子和糖原阿霉素Gly-DOX的质量比为100：(0.1～5):(1～10)。

在一种实施方式中，所述光引发剂相对于水的质量分数为0.15～0.25％。

在一种实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶的接枝率为70％～80％。

在一种实施方式中，所述糖原阿霉素Gly-DOX响应的pH值范围为4～6。

在一种实施方式中，所述油相包括蓖麻油，液体石蜡和硅油中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述磁性纳米粒子为铁磁性纳米粒子。

在一种实施方式中，所述光引发剂包括1-羟基环己基苯基甲酮、苯甲酰甲酸甲酯和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述连续相在微通道的流速控制在4～10mL/h：分散相在微通道的流速控制在1～5mL/h；通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。

在一种实施方式中，所述微流控装置选用双通道注射泵，芯片选用的是T型通道微流控芯片，连续相入口是点胶针头，0.8mm，分散相入口是毛细管，外径是1mm，内径是0.58mm。

在一种实施方式中，所述紫外光的照射功率为20-40mWcm^-2；紫外光的波长为365-405nm；照射时间为30-120s。

在一种实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶(GelMA)是通过如下方法制得：利用甲基丙烯酸酐与明胶进行酰胺反应，获得GelMA。

在一种实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶的具体制备过程包括：将明胶分散在PBS缓冲液中，然后加热至50-60℃后搅拌20～60min，实现溶解，在避光并且剧烈搅拌条件下，缓慢加入甲基丙烯酸酐(MA)；MA滴加完之后，使反应充分搅拌且避光条件下进行6～24h，透析、冷冻干燥即得。

在一种实施方式中，所述磁性纳米粒子是通过如下步骤制得：将FeCl₃·6H₂O溶解在水溶液中，然后加入FeCl₂·4H₂O的水溶液，剧烈搅拌反应，之后再加入浓氨水，油酸进行反应，反应结束后洗涤、再加入KMnO₄溶液，超声震荡、再次洗涤、干燥即得磁性纳米粒子MNPs。

在一种实施方式中，所述糖原阿霉素Gly-DOX是通过如下步骤制得：将糖原溶解在水中，然后加入高碘酸钠，之后再加入10倍高碘酸钠当量的乙二醇，得Gly-CHO；再将获得Gly-CHO溶解在甲酰胺溶液中，然后加入盐酸阿霉素DOX和三乙胺TEA，搅拌反应，之后将反应后的混合溶液进行透析、冻干即得Gly-DOX。

本发明的第二个目的是提供一种由上述所述方法制备得到的抗肿瘤的磁性栓塞微球。

本发明的第三个目的是提供一种由上述所述的栓塞微球在制备抗肝癌作用的药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种提高栓塞微球在血液中降解率的方法，所述方法包括如下过程：

将甲基丙烯酰化明胶、磁性纳米粒子和糖原阿霉素Gly-DOX和光引发剂分散于水中，形成混合体系，作为分散相；将油相作为连续相；然后采用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得W/O乳液，然后将W/O乳液在紫外光下进行照射，冷冻干燥，即得栓塞微球。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用GelMA、MNPs和Gly-DOX作为原料，具有良好的生物相容性、稳定性、良好的血液相容性、粒径均一及栓塞特性，水凝胶微球可以直接填充到肝脏血管部位，具有良好的溶胀性能，有利于微球溶胀阻塞血管，防止肝癌细胞吸收营养，释放药物杀死癌细胞；同时还具有良好的降解性能，可以进行天然降解，不会造成再次阻塞问题。

(2)本发明的栓塞微球具有较好的载药性能，可以防止药物外泄；同时具备较好的磁性，可以充当显影剂，能够实时监控栓塞微球的治疗效果。

附图说明

图1为本发明制备的GelMA的FT-IR和1H NMR图；

图2为本发明对比例3制备的HepMA的1H NMR图；

图3为本发明制备的MNPs的TEM图；

图4为本发明制备的Gly-DOX的FT-IR图；

图5为本发明实施例1、对比例1和2制备的三种水凝胶微球的SEM图；

图6为本发明实施例1、对比例1和2制备的三种水凝胶微球在水中的形貌大小图；

图7为本发明实施例1和2、对比例1和2制备的水凝胶微球的溶胀图；

图8为本发明实施例1和2、对比例1和2制备的种水凝胶微球的降解图；

图9为本发明对比例3制备的三种水凝胶微球的降解图；

图10为本发明实施例1、对比例1和2制备的三种水凝胶微球的溶血情况；

图11为本发明实施例1、对比例1和2制备的三种水凝胶微球的离心情况；

图12为本发明实施例1、对比例1和2制备的三种水凝胶微球对细胞毒性情况；

图13为本发明实施例1、对比例1和2制备的三种微球对肝癌细胞的毒性测试结果图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

明胶：购自sigma公司；糖原购于源叶公司；盐酸阿霉素购自于阿拉丁；蓖麻油来源于国药试剂，甲基丙烯酸酐购自麦克林。

1、甲基丙烯酰化明胶GelMA的合成与表征

精确称量10g明胶，并量取100mL的pH值为7.4的磷酸盐溶液PBS放入圆底烧瓶中，在50℃水浴中加热搅拌30min使其溶解，明胶溶解后，在避光并且剧烈搅拌条件下，缓慢加入10mL甲基丙烯酸酐(MA)；MA滴加完成之后，使反应在充分搅拌并且避光条件下进行24h；之后，将反应产物转移至3500Da透析袋中，在30℃下进行透析，每4h更换一次蒸馏水，共透析4次；最后，将透析产物冻干，得到疏松多孔的白色固体产物，即为GelMA，保存至-20℃。

分别3mg的冻干产物GelMA和磨成粉的明胶，使用傅里叶变换红外光谱仪在500-4000波长范围内扫描其红外光谱(见图1)。

此外，甲基丙烯酰化前后的明胶使用1H NMR进行表征(见图1)，分别取20mg GelMA和明胶溶解于0.5mL氘代重水(D₂O)中，然后装入核磁管中使用核磁共振波谱仪进行测试。

测定结果表明：明胶的1H NMR光谱极其复杂，因为明胶由大于20种不同的氨基酸组成，这些氨基酸结构单元是-NH-CHR-CO-，其中侧链(R)变化且具有不同的官能团，想要完成光谱的完整分析十分困难。对于计算DS，必须选取一个不能被修饰的基团所对应的峰，通过记录不同氨基酸的1H NMR光谱，可以将1.1ppm处的信号归因于缬氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)侧链中的共振。缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的疏水性烷基侧链可以认为是化学惰性的，它们在合成GelMA的过程中不参与反应。

根据已知的组成(100g明胶中含0.0190mol Val，0.0235mol Leu，0.0102molIle)，可以计算出该峰(18个质子)的积分对应于0.3162mol/100g。同样，还需要考虑明胶中可用胺基的总量(0.0821mol/100g)，因此将DS定义为明胶中游离胺基的初始量的函数。所以GelMA的接枝率(DS)的计算公式为：

根据测得的核磁结果GelMA的接枝率在75％-80％之间。

2、磁性纳米粒子的合成与表征

将8.0g FeCl₃·6H₂O在150mL去离子水中溶解后，转移到三口烧瓶中，搅拌加热至70℃。称取4.5g FeCl₂·4H₂O溶于10ml去离子水，过滤，取7.5ml加入到上述三口烧瓶中；在剧烈搅拌下，快速加入20ml质量分数为25％的浓氨水，1min后逐滴加入4.66g油酸，于70℃下继续快速搅拌1h。反应结束后，得到黑色溶胶状物质，利用外加磁场将所得的沉淀从反应体系中分离出来；用乙醇洗涤2次除去多余的油酸，再用去离子水洗涤至pH值为7；然后加入160ml浓度为10mg/ml的KMnO₄溶液，在超声波清洗仪中超声振8h，磁分离后用去离子水洗涤3次，得到磁流体或者在洗涤后真空冷冻干燥40h，得到磁性纳米粒子(MNPs)。

该磁性纳米粒子的TEM如图3所示：结果显示磁性纳米粒子的平均粒径大小在10nm以下。

3、糖原阿霉素Gly-DOX的合成与表征

取1.6g糖原溶解在10mL水中，与400mg的高碘酸钠混合；在室温下反应1h，加入过量的乙二醇(10倍高碘酸盐当量)；混合溶液用纯水透析两天，冻干，得到Gly-CHO；

再取50mg Gly-CHO溶解在30mL甲酰胺中，加入5mL含有35.0mg盐酸阿霉素(DOX)和50μL三乙胺(TEA)的DMSO溶液，搅拌48h；然后将溶液放入3500Da透析袋中，用DMSO透析1天，以除去未反应的DOX，用蒸馏水透析3天除去杂质和有机溶剂，冻干，即得产物Gly-DOX。

分别取少量的冻干产物糖原、Gly-CHO和Gly-DOX，使用傅里叶变换红外光谱仪在500-4000长范围内扫描其红外光谱，结果如图4所示，糖原首先被高碘酸钠氧化成醛基化糖原，随后和阿霉素反应生成Gly-DOX,在红外谱图的分析下，在1700cm处出现了新的特征峰为-C＝O-的吸收峰，证明醛基化糖原成功；由于和阿霉素反应，在1300cm到1700cm之前出现了峰，为阿霉素的特征峰，在1641cm处为-C＝N-双键的伸缩震动峰。证明席夫碱合成成功，阿霉素成功接枝。

4、甲基丙烯酰胺化肝素(HepMA)的合成及表征

称量500mg肝素溶解于25mL的H₂O中，待肝素完全溶解后，使用3mol/L NaOH调节溶液的pH至8～9，然后在剧烈搅拌条件下，缓慢滴加4mL甲基丙烯酸酐，在冰水浴中使反应进行24h，pH值在整个过程中一直维持在8～9之间。反应结束后，将反应液倒入500mL的乙醇中进行醇沉，-20℃过夜；醇沉结束后使用离心机在6000rpm速度下离心10min，收集HepMA沉淀产物，然后将HepMA沉淀物复溶于水，使用3500Da的透析袋透析2天，冷冻干燥，即得到纯HepMA产物，-20℃保存。

分别取少量的冻干产物HepMA和肝素。此外，甲基丙烯酰化前后的肝素使用1H NMR进行表征，分别取10mg HepMA和肝素溶解于0.5mL D₂O中，然后装入核磁管中使用核磁共振波谱仪进行测试，测试结果如图2所示。HepMA的接枝率(DS)使用如下公式进行计算：

其中a和b分别是指两个甲基丙烯酸酯乙烯基质子峰面积，c是指肝素的二糖重复单元质子峰面积；根据测得的核磁结果计算出甲基丙烯酰化肝素上的双键接枝率在80％～90％之间。

实施例1

GM@MNPs@GD水凝胶微球的制备

(1)取GelMA(78％)和MNPs和Gly-DOX分散在水中，配制得到质量分数为10％的GelMA溶液和质量分数0.1％的MNPs溶液和质量分数为0.5％的Gly-DOX，并且加入相对水质量的0.25wt％的光引发剂(LAP)后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；

(2)将步骤(1)中的分散相、连续相两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制3mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射；收集的W/O乳液在25mWcm^-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和imageJ软件确定所得微球的大小；

(3)将步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，即得GM@MNPs@GD水凝胶微球。

实施例2

调整实施例1中步骤(1)GelMA和MNPs的质量配比；具体配比如下表1所示；其他与实施例1保持一致，分别制备出的水凝胶微球。

表1水凝胶微球制备的不同比列

对比例1

水凝胶微球GM的制备

(1)取GelMA(78％)分散在水中，配制得到质量分数为10％的GelMA溶液，并且加入相对水质量的0.25wt％的光引发剂(LAP)后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；

(2)将步骤(1)中的分散相和连续相两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制3mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射；收集的W/O乳液在25mWcm^-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球；通过使用显微镜图像和imageJ软件确定所得微球的大小；

(3)将步骤(2)制备得到的凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及光引发剂，最后将微球冻干，即得GM水凝胶微球。

对比例2

GM@MNPs水凝胶微球的制备

(1)取GelMA(78％)和MNPs分散在水中，配制得到质量分数10％的GelMA溶液和质量分数为0.1％的MNPs溶液，并且加入相对水质量的0.25wt％的光引发剂(LAP)后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；

(3)将步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，即得GM@MNPs水凝胶微球。

对比例3

S1.HM水凝胶微球的制备

(1)取HepMA(82％)分散在水中，配制得到质量分数为10％的HepMA溶液，并且加入相对水质量的0.25wt％的光引发剂后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；

(2)将步骤(1)中的分散相、连续相两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制3mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射；收集的W/O乳液在25mWcm^-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球；

(3)将步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，即得HM水凝胶微球。

S2.HM@MNPs水凝胶微球的制备

(1)取HepMA(82％)和MNPs分散在水中，配制得到质量分数为10％的HepMA溶液，质量分数0.1％的MNPs溶液并且加入相对水质量的0.25wt％的光引发剂后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。

(3)将步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，即得HM@MNPs水凝胶微球。

S3.HM@MNPs@GD水凝胶微球的制备

(1)取HepMA(82％)和MNPs和Gly-DOX分散在水中，配制得到质量分数为10％的HepMA溶液，质量分数为0.1％的MNPs溶液和质量分数为0.5％的Gly-DOX并且加入相对水质量的0.25wt％的光引发剂后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；

(2)将步骤(1)中的分散相、连续相两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制3mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。收集的W/O乳液在25mWcm^-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球；

(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，即得HM@MNPs@GD水凝胶微球。

性能特征结果测定：

1.水凝胶微球的SEM图

分别将实施例1和对比例1和2制备的水凝胶微球，通过扫描电子显微镜(SEM)对水凝胶微球形貌进行观察：将冷冻干燥得到的样品平整的用导电胶固定到SEM载物台上，喷金处理后观察不同视野范围内样品的形貌结构；随后将三种不同的水凝胶微球放在水中浸泡2h后，显微镜观察。

三种水凝胶微球表面粗糙度的扫描结果如图5所示：三种水凝胶微球都呈现出多孔形状，在这有利于细胞的生长，其中GM@MNPs@GD微球的孔隙最小，说明负载了药物会使微球的孔隙变小。三种水凝胶微球的吸水后在显微镜下拍照如图6所示，由结果显示，复配不同的三种微球在吸水后微球的直径大小随着MNPs和Gly-DOX的加入逐级递增。

2.水凝胶微球的溶胀性能

分别取10mg实施例1和实施例2以及对比例1和2制备的水凝胶微球记为W，并将样品放置到离心管中进行实验。在0min称量样品+离心管的质量为W₀。将样品浸泡在PBS中并放置到37℃，100rpm/min的环境中，在一定时间点，吸干水分并称重，记为W_t。每组至少三个平行实验，微球的溶胀率使用下列公式计算：

溶胀率(SR)＝(W_t-W₀)/W×100％

结果如图7和表2所示；在PH＝7.4的PBS中进行的吸水溶胀实验，三种水凝胶微球的溶胀速度很快，在前6min基本就达到了溶胀平衡。

对比例1的GM微球的溶胀率最高可以达到600％以上，随着磁性纳米粒子和药物的逐级加入，可以发现溶胀率也是逐级下降，说明负载的东西越多，溶胀率逐步下降。栓塞微球为了适应血管的大小，负载0.03％和0.05％磁性纳米粒子的微球溶胀率较大，可能会撑破血管。负载0.1％的磁性纳米粒子比较符合预期(溶胀率在420-550％)，而负载0.2％磁性纳米粒子的微球溶胀率太低，达不到栓塞微球的大小。微球的溶胀速度都很快，在10分钟内基本都可以达到饱和状态。

表2水凝胶微球在不同浸泡时间下的溶胀结果

3.水凝胶微球的体外降解实验

分别取10mg的实施例1和2以及对比例1～3制备的水凝胶微球记为W。将样品放入2mL的离心管内，连同离心管一起称重(W₀)；向离心管中分别加入2μg/ml的胶原酶1ml，置于37℃，100rpm/min的环境中。分别在不同的时间取出离心管，用超纯水洗涤三次，离心除去溶液并冻干。冻干后，称量剩余样品加离心管质量(W₁)，计算降解率(DR)。每组至少三个平行试验，计算五个样品的平均值。

DR(％)＝(W₀-W₁)/W×100％

实验结果如图8、9和表3所示。对于微球在血管中充当栓塞剂，如果长时间不降解清除，会造成二次栓塞。因此微球的降解能力极为重要。在加入胶原酶的作用下，GM微球在5天的时间降解率就可以达到95％，在7天的时间可以完全降解。GM@MNPs微球的和GM@MNPs@GD微球降解差距不大。加入磁性纳米粒子可以延缓降解的时间；加入Gly-DOX药物发现微球的降解率基本不变，说明Gly-DOX的加入不会影响降解率，为了适应微球在人体体内7天的降解率，所以磁性纳米粒子的负载不能过高，而肝素微球在体内7天几乎不怎么降解。所以GelMA微球作为栓塞剂更为合适。详细结果见表3所示。

表3水凝胶微球在胶原酶的影响下的降解速率

4.水凝胶微球的体外溶血能力

为防止血液与水凝胶材料接触后，材料可能会导致红细胞破裂而发生溶血现象，首先评估水凝胶材料的溶血性能。适龄C57小鼠取血，将血液与柠檬酸葡萄糖溶液按5:1混合，制备抗凝小鼠血液；于5000r/min离心5min，加入适量PBS缓冲液冲洗，此过程重复3次；吸取下层细胞沉淀液，加入PBS缓冲液混合均匀制得质量分数为15％的红细胞(RBCs)悬液。将500μL红细胞(RBCs)悬液与950μLPBS缓冲液加入装有水凝胶微球的离心管中，37℃培养箱培养2h后，5000rpm/min离心5min得到上层清液，用酶标仪测量540nm处的吸光度。其中，阳性对照组为500μlRBCs悬液与950μl去离子水混合的OD值，阴性对照组为500μlRBSc悬液与950μl的PBS缓冲液混合的OD值。溶液率(HR)，每组至三个平行实验。

HR(％)＝(OD_sample-OD_ngative)/(OD_positive-OD_negative)×100％

实施例1以及对比例1和2制备的水凝胶微球的体内溶血实验结果如图10所示。与血液直接或间接接触的医用材料需具备血液相容性，包括不产生溶血效应。与阳性对照组相比，离心后的微球组与阴性对照组相似，如图11所示；GM微球，GM@MNPs微球和GM@MNPs@GD微球的溶血率均低于5％，加入磁性纳米粒子的微球溶血率没有升高，加入药物的微球溶血率升高，说明药物还是对血液有一定的影响，但整体不高，详细数据如表4所示，符合国家医疗标准；说明本发明实施例1制备的微球具有良好的血液相容性。

表4三种水凝胶微球在血液中的溶血能力

5.水凝胶微球对细胞的毒性影响

将各个微球样品置于EP管中，先紫外灭菌1h，然后用75％乙醇浸泡2h，再用无菌PBS洗涤3次，每次5min。采用小鼠的纤维细胞(NIH3T3)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并用MTT法检测。

将灭菌处理后的实施例1种的三种冻干微球材料分别浸泡于培养基中以0.2g/mL的比例在37℃，5％CO₂的培养箱中浸提24h；然后将浸提液过膜备用。

将NIH3T3细胞和HUVEC细胞以5000个/孔(每孔100μL)的密度接种于96孔细胞培养板中并贴壁培养24h，之后吸出其中的培养基，替换成100μL不同微球的浸提液，每个设置6个平行，普通培养基作为空白对照，然后分别在培养箱中培养1～3天。在到达预设的培养时间用移液枪缓慢贴壁吸走孔板中的溶液，在避光条件下，每孔加入100μL浓度为0.5mg/ml的MTT的磷酸盐缓冲液溶液，在37℃无菌培养箱中孵育4h，弃去孔中的MTT溶液，各加入100μlDMSO并在室温下振荡15min混合均匀，之后用酶标仪记录570nm处的吸光度值(OD值)。每组样品设置6个平行实验，细胞的相对存活率计算方法如下式：

细胞相对存活率(％)＝OD₅₇₀(sample)/OD₅₇₀(control)×100％

本发明实施例1以及对比例1和2制备水凝胶微球对NIH3T3细胞和HUVEC细胞的毒性测试如图12和表5、6所示：水凝胶微球的浸提液对NIH3T3细胞和HUVEC细胞基本没有毒性，细胞存活率都在80％以上，结果表明实施例1和2制备的水凝胶微球对正常细胞不具有杀伤作用，具有良好的生物相容性。

表5三种水凝胶微球对NIH3T3的细胞相对存活率结果

表6三种水凝胶微球对HUVEC的细胞相对存活率结果

6.水凝胶微球对肝癌细胞的作用

将各个微球样品置于EP管中，先紫外灭菌1h，然后用75％乙醇浸泡2h，再用无菌PBS洗涤3次，每次5min。采用肝癌细胞(HepG2)并用MTT法检测。

将处理好的GM、GM@MNPs、GM@MNPs@GD三种微球浸泡在培养基中，将HepG2细胞8000个/孔(每孔200μL)的密度接种于24孔transwell细胞培养板中并贴壁培养24h，之后吸出其中的培养基，替换成200μL新的培养基，在上层transwell小室中加入10mg的微球，后继续在上层加入200μL带有2μg/ml胶原酶的培养基(注意不要使液体溢出)，普通培养基组作为空白对照，培养箱中培养1～3天。在到达预设的培养时间用移液枪缓慢贴壁吸走孔板中的溶液，在避光条件下，每孔加入200μL浓度为0.5mg/ml的MTT的磷酸盐缓冲液溶液，在37℃无菌培养箱中孵育4h，弃去孔中的MTT溶液，各加入100μl的DMSO并在室温下振荡15min混合均匀，之后用酶标仪记录570nm处的吸光度值(OD值)。每组样品设置4个平行实验，细胞的相对存活率计算方法如下式：

细胞相对存活率(％)＝OD₅₇₀(sample)/OD₅₇₀(control)×100％

本发明实施例1以及对比例1和2制备的水凝胶微球对HepG2细胞的影响，如图13和表7所示。微球先在胶原酶的作用下降解释放出药物，到下层肝癌细胞的环境呈现酸性，Gly-DOX中席夫碱断裂，释放药物DOX，从而杀死肝癌细胞。

表7三种水凝胶微球对HepG2细胞的影响

以上所述，实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于抗肝癌的磁性栓塞微球制备方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶相对水的质量浓度为8％～10％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子的相对水的质量浓度为0.03％～0.5％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖原阿霉素Gly-DOX相对水的质量浓度为0.1％～0.5％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶、磁性纳米粒子和pH敏感型药物的质量比为100：(0.1～5):(1～10)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光引发剂相对于水的质量分数为0.15～0.25％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖原阿霉素Gly-DOX响应的pH值范围为4～6。

8.由权利要求1～7任一所述方法制备得到的具有抗肝癌作用的磁性栓塞微球。

9.由权利要求8所述的栓塞微球在制备抗肝癌作用的药物中的应用。

10.一种提高栓塞微球在血液中降解率的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：