CN108379241B - 胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种胆甾醇疏水改性普鲁兰‑多奈哌齐‑聚山梨酯80纳米粒子，该纳米粒子包括纳米粒子包括胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、负载在胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子中的多奈哌齐以及吸附在胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子表面的聚山梨酯80。上述胆甾醇疏水改性普鲁兰‑多奈哌齐‑聚山梨酯80纳米粒子对多奈哌齐具有良好的载药量、包封率及缓释效果，其能在更长时间内维持血药浓度，延长服药间期，提高患者依从性。此外，由于稳定性的提高，进入全身循环的药量减少，更多的纳米粒子在释放药物前便跨过了血脑屏障，使得药物在脑部富集，实现了定位后释放，不仅可以减少给药量，对外周神经系统的毒性也随之减少。

Description

胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子及制 备和应用

技术领域

本发明涉及纳米制剂领域，具体涉及胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，特别是涉及胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子的制备方法和应用。

背景技术

难溶性药物的给药剂型及给药方式是研究的热点。口服固体药物从制剂内释放出并溶解于体液是被吸收的前提，因此溶出性差会使药物在体内吸收速度慢和生物利用度低，不能达到治疗水平的血药浓度，从而导致临床治疗效果差。脂溶性高的药物较容易地跨越血脑屏障在颅内发挥药效，因此在制备针对颅脑疾病的常规制剂时，为了增加药物溶解度常需添加大量的辅料，随之带来了严重毒性问题。目前临床上约有40％的药物因溶出性差而使用受限。

近年来，注射用纳米制剂的出现，为解决脂溶性药物的给药问题带来了希望。纳米粒子是一种微观胶质体系，由纳米微球或纳米微囊构成，其粒径一般小于1μm。由于纳米粒子粒径小，比表面积大，负载药物后可以提高难溶性药物的溶解度和溶出速率，并且可通过选择特定性质的生物材料进行制备和表面修饰，使纳米粒子有长循环、缓控释性、靶向输送、减少剂量、保证药效并减轻毒副反应的作用。

本实验选用治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的临床重点药物——多奈哌齐(donepezil，DZP)作为研究药物，展开了对难溶性药物新型纳米制剂的研制。由于多奈哌齐脂溶性强，在体内溶出性差，一般采取口服给药，药物的吸收和生物利用度低，亦没有组织特异性，对外周神经系统有毒副作用，其临床应用受到限制。另外，常规的多奈哌齐片剂(Aricept，安理申)需每日服用，以维持治疗效果，但对于阿尔茨海默患者而言，病情发展到一定阶段，记忆的缺失给每日按时服药造成了障碍。可见，制备一种新型的注射纳米药物制剂，来克服这些缺陷是十分必要的。

发明内容

基于此，有必要针对现有的多奈哌齐制剂体内溶出性差、没有组织特异性、不具缓释功能的问题，提供一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子及制备和应用。

一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子包括胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、负载在胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子中的多奈哌齐以及吸附在胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子表面的聚山梨酯80。

进一步地，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子由琥珀酸酐作为连接臂将胆甾醇接枝于普鲁兰多糖中制得。

一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、多奈哌齐和三乙胺溶于DMSO中，透析除去DMSO，透析液超声处理，经滤膜过滤得到胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐纳米粒子溶液；

在胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐纳米粒子溶液中加入聚山梨酯80，静置1小时后，超声处理至获得均一分散液，经滤膜过滤除去杂质，即得胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子。

进一步地，聚山梨酯80的浓度为0.7mmol。

进一步地，透析过程具体为：

将溶液转入透析袋，放入蒸馏水中，前12h每3h换水一次，后12h每隔6h换水一次，总共透析24h，透析袋的截留分子量为8～12KDa。

进一步地，超声处理过程具体为：

超声处理三次，超声仪器的输出功率为100W，采用间歇脉冲工作方式：脉冲宽度为2.0s，间歇时间2.0s。

进一步地，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子与多奈哌齐的投料比为1：2～10。

进一步地，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子与多奈哌齐的投料比为1：5。

一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。

上述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物(CHP)为两亲性物质，在水溶液中可以自组装成具有胆甾醇疏水基团的核和糖链亲水性的壳的纳米结构，且能够与Aβ蛋白形成复合物，有效阻止蛋白聚集，同时能很快的从细胞中清除，从而能强有力的抑制细胞毒性。而多奈哌齐作为一种强疏水性药物，可以负载到CHP纳米粒子的疏水中心形成多奈哌齐纳米制剂。聚山梨酯80(PS)涂覆于纳米粒子表面，可通过受体介导的内吞作用或其他机制来穿过血脑屏障，并提高药物对中枢大脑的靶向输送，以增强对大脑部位的靶向治疗作用，并且助于延长纳米颗粒在体内的循环时间。上述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子对多奈哌齐具有良好的载药量、包封率及缓释效果，其能在更长时间内维持血药浓度，延长服药间期，提高患者依从性。此外，由于稳定性的提高，进入全身循环的药量减少，更多的纳米粒子在释放药物前便跨过了血脑屏障，使得药物在脑部富集，实现了定位后释放，不仅可以减少给药量，对外周神经系统的毒性也随之减少。

附图说明

图1为不同投料比下的DZP-CHP的电位变化和粒径分布图；

图2为不同投料比的CHP载药纳米粒子的释放曲线图；

图3为25℃下聚山梨酯80滴定至DZP-CHP纳米粒子溶液的热力学参数和连接曲线图；

图4A为CHP纳米粒子的透射电子显微镜图像；

图4B为DZP-CHP的透射电子显微镜图像；

图4C为PS-DZP-CHP的透射电子显微镜图像；

图5为纳米粒子载药前后的粒径分布及电位变化；CHP：为空白CHP纳米粒子，DZP-CHP：负载多奈哌齐的CHP纳米粒子，and PS-DZP-CHP：表面吸附tween80的载药CHP纳米粒子；

图6为游离多奈哌齐(DZP)、载药CHP纳米粒子(DZP-CHP)、聚山梨醇酯80乳化的载药CHP纳米粒子(PS-DZP-CHP)在水溶液中72h的释放曲线图；

图7A、B、C分别为100ul游离ICG溶液、ICG-CHP纳米粒子溶液、聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液尾静脉注射10min后的小鼠成像图；

图8A、B分别为100ul ICG-CHP纳米粒子溶液、聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液尾静脉注射1h后的小鼠成像图；

图9为PS-DZP-CHP制备示意图；

图10为PS-DZP-CHP发挥发挥脑靶向作用示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子包括胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、负载在胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子中的多奈哌齐以及吸附在胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子表面的聚山梨酯80。

普鲁兰多糖(Pullulan)，是出芽短孢梗酶产生的胞外多糖，具有对机体无毒，容易生物降解的特点。胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物(CHP)为两亲性物质，在水溶液中可以自组装成具有胆甾醇疏水基团的核和糖链亲水性的壳的纳米结构。有研究表明，CHP纳米粒子能够与Aβ蛋白形成复合物，有效阻止蛋白聚集，同时能很快的从细胞中清除，从而能强有力的抑制细胞毒性，为纳米材料的选择提供了依据。胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物可以用1,6-己二异氰酸酯(HDI)为连接臂，将疏水的胆甾醇分子修饰普鲁兰多糖可获得两亲性胆甾醇基-普鲁兰(CHP)，其具体方法为，将0.85g胆甾醇(2.2mmol-OH官能团)置于圆底烧瓶中并溶于15mL无水THF中。将HDI(0.37g，4.4mmol-NCO官能团)和二月桂酸二丁基锡(DBTDL,12mg)在无水THF(2mL)中的溶液加入到烧瓶中。然后将反应混合物于60℃搅拌4小时，得到-NCO预聚物。之后，将一定量普鲁兰多糖溶于10mL DMSO中并加入到烧瓶中。然后将反应混合物在60℃下搅拌6小时，同时澄清溶液变得显着粘稠，表明聚合。将反应混合物冷却至环境温度，然后滴入200ml无水乙醇中，析出白色沉淀，抽滤，用适量的乙醇，四氢呋喃和乙醚洗涤产物，80℃下干燥，备用。

胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物也可使用琥珀酸酐作为连接臂将胆甾醇接枝于普鲁兰多糖中得到的CHP纳米粒子。胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物能在水中形成自聚集纳米粒子。该纳米粒子疏水中心可负载表阿霉素、米托蒽醌、紫杉醇等脂溶性高体内溶出差的药物增强其溶解度。

使用琥珀酸酐作为连接臂的胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物可采用如下方法制备：将胆甾醇改性2.5g(6.5mmol)和琥珀酸酐2.0g(20mmol)溶解于20mL无水吡啶中，50度下反应48h后停止反应，反应液滴入PH＝1～2的冰盐酸溶液中，析出白色絮状沉淀。冷藏4h，抽滤，收集沉淀，沉淀用蒸馏水洗至中性。于100ml乙酸乙酯/乙醇(1：1)中重结晶，80℃下干燥，得白色针状琥珀酰胆甾醇(CHS)纯品。

取普鲁兰0.5g溶解于15ml除水的二甲基亚砜中，备用；取一定量的琥珀酰胆甾醇(CHS)和4-二甲基吡啶(DMAP/CHS＝1,mmol/mmol),溶解于10ml DMSO中，室温搅拌，反应活化2h，将活化反应液滴入普鲁兰多糖溶液中，室温下反应48h，停止反应。将反应液滴入200ml无水乙醇中，析出白色沉淀，抽滤，用适量的乙醇，四氢呋喃和乙醚洗涤产物，80℃下干燥，备用。

多奈哌齐作为一种强疏水性药物，可以负载到CHP纳米粒子的疏水中心形成多奈哌齐纳米制剂(DZP-CHP)。虽然纳米药物制剂由于小尺寸的性质具有一定的被动靶向性，但要达到精准的特定组织靶向性，必需对纳米表面进行进一步的修饰。

聚山梨醇酯80是一种常见非离子型表面活化剂。其结构式如下式所示，

其中，脂肪酸链(疏水性)和环氧乙烷单元(亲水性)为该分子提供两亲性。由于它具有亲水性、非电离性、生物可降解性、低浓度时对细胞没有毒性且易于获得，被广泛使用在食物和药物产品的物质分布上。大量研究发现，将它涂覆于纳米粒子表面，可通过受体介导的内吞作用或其他机制来穿过血脑屏障，并提高药物对中枢大脑的靶向输送，以增强对大脑部位的靶向治疗作用。除此之外，已有研究表明，来自聚山梨酯家族的非离子表面活性剂的亲水部分和疏水部分参与相互作用使用，其涂层直接抑制网状内皮系统的作用，从而有助于延长纳米颗粒在体内的循环时间。聚山梨酯80还具有缓释作用。

因此发明人设计使用CHP纳米粒子负载多奈哌，然后加入Tween80乳化，并用等温滴定测热法检测乳化过程，确认Tween80能够成功吸附于CHP粒子表面且能达到理想的吸附率，再对该新型制剂的缓释效果进行测定，旨在为AD的治疗新剂型研究提供实验基础。

上述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物(CHP)为两亲性物质，在水溶液中可以自组装成具有胆甾醇疏水基团的核和糖链亲水性的壳的纳米结构，且能够与Aβ蛋白形成复合物，有效阻止蛋白聚集，同时能很快的从细胞中清除，从而能强有力的抑制细胞毒性。而多奈哌齐作为一种强疏水性药物，可以负载到CHP纳米粒子的疏水中心形成多奈哌齐纳米制剂。聚山梨酯80涂覆于纳米粒子表面，可通过受体介导的内吞作用或其他机制来穿过血脑屏障，并提高药物对中枢大脑的靶向输送，以增强对大脑部位的靶向治疗作用，并且助于延长纳米颗粒在体内的循环时间。上述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子对多奈哌齐具有良好的载药量、包封率及缓释效果，其能在更长时间内维持血药浓度，延长服药间期，提高患者依从性。此外，由于稳定性的提高，进入全身循环的药量减少，更多的纳米粒子在释放药物前便跨过了血脑屏障，使得药物在脑部富集，实现了定位后释放，不仅可以减少给药量，对外周神经系统的毒性也随之减少。

进一步地，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子由琥珀酸酐作为连接臂将胆甾醇接枝于普鲁兰多糖中制得。

由于己二异氰酸酯本身易燃且属于身体外源性物质，可能对人体产生毒性作用。因而使用琥珀酸酐作为连接臂将胆甾醇接枝于普鲁兰多糖中得到的CHP纳米粒子，理论上作为药物载体更具安全性。CHP自聚集体是通过胆甾醇基间的非共价疏水作用而形成的圆形或椭圆形水凝胶纳米粒子，因此其接枝的胆甾醇取代度越高，疏水作用越强，结构越稳定。但取代度大于6％时由于表现的疏水作用过强，反而不利于自我聚集。

一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、多奈哌齐和三乙胺溶于DMSO中，透析除去DMSO，透析液超声处理，经滤膜过滤得到胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐纳米粒子溶液；

在胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐纳米粒子溶液中加入聚山梨酯80，静置1小时后，超声处理至获得均一分散液，经滤膜过滤除去杂质，即得胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子。

进一步地，聚山梨酯80的浓度为0.7mmol。

进一步地，透析过程具体为：

将溶液转入透析袋，放入蒸馏水中，前12h每3h换水一次，后12h每隔6h换水一次，总共透析24h，透析袋的截留分子量为8～12KDa。

进一步地，超声处理过程具体为：

超声处理三次，超声仪器的输出功率为100W，采用间歇脉冲工作方式：脉冲宽度为2.0s，间歇时间2.0s。

进一步地，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子与多奈哌齐的投料比为1：2～10。制备过程中，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子与多奈哌齐的投料比为1：2～10，在该投料比下，DZP-CHP纳米粒子粒径稳定均匀，并且载药量和包封率较大。

进一步地，胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子与多奈哌齐的投料比为1：5。在投料比1：5时为最小，说明在该投料比下，形成的DZP-CHP纳米粒子粒径更为稳定均匀，并且载药量和包封率最大。

一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。

该胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子用Tween80对DZP-CHP纳米粒子进行表面修饰，ITC结果显示Tween80与纳米粒子间吸附性较好。CHP纳米制剂对多奈哌齐具有良好的载药量、包封率及缓释效果，而吸附Tween80后进一步加强了CHP纳米粒子的缓释作用。CHP纳米制剂经过Tween80表面修饰，将来有可能成为一种具有脑靶向功能的治疗神经系统疾病的新型药物制剂，如AD的治疗新剂型。

实施例

Materials.恒温磁力搅拌器(IKA RCT basic,德国)；真空冷冻干燥机(Maxi DryLyo Heto-Holten公司)；透射电子显微镜(TEM)(JIEM-100S日本)；纳米粒子度与Zeta电位分析仪(Malvern ZS-90,英国)；UV-vis分光光度计(JASCO V-560,美国)；等温滴定量热仪(VP-ITC,Microcal,Inc.Northampton,MA)；透析袋(截留分子量8～12KDa,德国)；胆甾醇疏水改性普鲁兰(自制)；多奈哌齐(Donepezil，上海子起生物科技有限公司)；聚山梨醇酯80(Polysorbate-80，天津市福晨试剂所)；其余试剂均为国产分析纯。

制备方法

1、透析法制备CHP及DZP-CHP纳米粒子.

将胆甾醇改性2.5g(6.5mmol)和琥珀酸酐2.0g(20mmol)溶解于20mL无水吡啶中，50度下反应48h后停止反应，反应液滴入PH＝1～2的冰盐酸溶液中，析出白色絮状沉淀。冷藏4h，抽滤，收集沉淀，沉淀用蒸馏水洗至中性。于100ml乙酸乙酯/乙醇(1：1)中重结晶，80℃下干燥，得白色针状琥珀酰胆甾醇(CHS)纯品。

取普鲁兰0.5g溶解于15ml除水的二甲基亚砜中，备用；取一定量的琥珀酰胆甾醇(CHS)和4-二甲基吡啶(DMAP/CHS＝1,mmol/mmol),溶解于10ml DMSO中，室温搅拌，反应活化2h，将活化反应液滴入普鲁兰多糖溶液中，室温下反应48h，停止反应。将反应液滴入200ml无水乙醇中，析出白色沉淀，抽滤，用适量的乙醇，四氢呋喃和乙醚洗涤产物，80℃下干燥，得到使用琥珀酸酐作为连接臂的胆甾醇接枝的普鲁兰聚合物CHP，备用。

准确称取接枝材料CHP聚合物20mg，加入2ml DMSO溶剂溶解。溶液转入透析袋(MWCO 8～12KDa)，放入1L蒸馏水中，前12h每3h换水一次，后12h每隔6h换水一次，总共透析24h。

称取20mgCHP、4mg DZP和三乙胺(TEA/DZP＝2,mmol/mmol)溶于适量的DMSO中，将药物和材料溶液分别按照不同的投料比为1：2，1：5与1：10的比例进行充分混合，采用透析方法制备载药纳米粒子。溶液转入透析袋(MWCO 8～12KDa)，放入1L蒸馏水中，前12h每3h换水一次，后12h每隔6h换水一次，总共透析24h。DMSO透析干净后，取出溶液，探头超声仪50W超声2min，于10mL容量瓶中定容。用0.45μm滤膜过滤即得到DZP-CHP纳米粒子。放于4℃冰箱备用。

2、聚山梨酯80乳化DZP-CHP纳米粒子制备PS-DZP-CHP

将一定浓度的DZP-CHP定容到10ML的烧杯，将其吸入含有浓度为0.7mmol的聚山梨酯80(PS)乳化剂烧杯中，两者静置1h后，将混合溶液放置于EP管中，然后进行探头超声处理3min(输出功率为100W，采用间歇脉冲工作方式：脉冲宽度为2.0s，间歇时间2.0s),重复操作三次直至获得均一分散液，经滤膜过滤除去杂质即得聚山梨酯80乳化的多奈哌齐载药纳米粒子(PS-DZP-CHP)。

测试方法

1、多奈哌齐标准曲线的制备

精密称取适量多奈哌齐对照品，加DMSO溶解并稀释至1μg/ml的溶液。以DMSO为空白对照，在200-400nm波长范围内扫描，检测其最大紫外吸收波长。

精密称取多奈哌齐标准品1mg，置于10mL容量瓶中，用DMSO溶解并定容至刻度，得到100μg·mL^-1的标准贮备溶液。取适量，用DMSO稀释成浓度为5、10、15、20、25μg·mL^-1的系列多奈哌齐标准溶液。以DMSO溶液为参比,于最大吸收波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标作图，得回归方程。

2、等温滴定量热法

将一定浓度的聚山梨酯80溶液滴入DZP-CHP纳米粒子溶液中，等温滴定量热仪测定其热量的变化。80ml聚山梨酯80注射到250ml含有DZP-CHP纳米粒子滴定池里，滴定20次,每次4ml。滴定时温度设定25℃，通过20次滴定，即可得到热力学参数和连接曲线。

3、纳米粒子径、Zeta电位测定以及形貌观察

CHP、DZP-CHP和PS-DZP-CHP纳米粒子的粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位用Malvern ZS-90(英国)测得。粒子的形貌通过透射电子显微镜(TEM)进行评价，将新制备好的CHP、DZP-CHP和PS-DZP-CHP纳米粒子水溶液滴在具有碳支持膜的铜网上，待干燥后，用2％(w)磷钨酸进行负染，自然干燥，将样品置于TECNAI Spirit(120kV)型透射电镜(FEL,中国香港)下进行观察。将冻干的纳米粒子溶于纯水，滴加到洁净的硅片上，置于室温下干燥，通过扫描电子显微镜下观察其表面结构。

4、DZP-CHP和PS-DZP-CHP的载药量(LC)及包封率(EE)的测定

载药纳米粒子DZP载药量(LC)与包封率(EE)的测定参照文献16，具体步骤为:取4mL新鲜制备的DZP-CHP和PS-DZP-CHP纳米粒子，在UV-vis分光光度计上测定312nm处吸光度，相同溶剂的空白CHP纳米粒子做空白。根据标准曲线求出药物含量，进而根据以下公式得出载药量和包封率。

5、DZP-CHP和PS-DZP-CHP纳米粒子的体外释放

采用透析袋扩散技术测定多奈哌齐体外释放情况，分别准确称取10mgDZP-CHP和PS-DZP-CHP纳米粒子溶于5ml 0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，转移至透析袋(MWCO 8～12kDa)置于20mL相同的PBS溶液中，37℃恒温避光磁力搅拌，分别在0,0.5,1,2,4,8,12,24,48,72h取出4ml透析液，同时加入4ml新鲜的相同pH的PBS溶液。UV-vis在312nm处测定不同时间点透析液的吸光度，由标准曲线求出溶液中多奈哌齐的含量，体外释放试验共重复三次。

Cn:Tn时间点的样品浓度,μg/mL；V:释放介质总体积，mL；Ti时间点的释放介质体积，mL；Ci:Ti时间点的样品浓度，μg/mL

6、统计分析

采用SPSS 12.0软件进行统计分析。数据均以Mean±SD表示，采用多个样本均数比较的方差分析中的Student’s-test进行统计学分析，p＜0.05认为有统计学差异。

实验结果

3.1多奈哌齐标准曲线的测定

为了测定载药纳米粒子的载药量及包封率，先建立多奈哌齐的标准曲线。本实验中根据紫外扫描图谱1，可知多奈哌齐在波长为270nm与312nm时具有最大吸收峰，实际选取数值较大的312nm作为多奈哌齐的检测波长以减少测量误差。以多奈哌齐标准溶液的浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制的标准曲线,标准曲线方程为Y＝-0.00373+0.01574X。由此可知，在0-30ug/ml浓度范围内，浓度与吸光度呈线性关系，相关系数为0.99885，满足要求。

3.2.DZP-CHP纳米粒子粒径、zeta电位、载药量和包封率与投料比关系的测定

将制备好的CHP纳米粒子按照不同的投料比负载多奈哌齐后使用动态光散射法(DLS)检测粒径和zeta电位。测得结果如图2所示，纳米粒子的平均粒径在投料比为1：2，1：5与1：10时，分别为：273.3±3.72，260.7±1.76，266.8±4.56nm，而多分散性指数PDI值分别为：0.138±0.013，0.123±0.004，0.196±0.019，粒度分布均匀，投料比为1：5时最小，且分散最均匀。在本实验结果中投料比为1：2的粒径最大，这可能是由于纳米疏水中心中包裹的疏水性多奈哌齐过少，自组装过程中纳米粒子疏水端与疏水药物二者间产生疏水相互作用较弱，导致聚集不够紧密，粒径偏大。而粒度分布结果也与该猜想一致，在投料比1：5时为最小，说明在该投料比下，形成的纳米粒子更为稳定均匀。

接着按照前述实验方法测定载药纳米粒子在608nm的吸光值。通过多奈哌齐浓度对吸光值的标准曲线求算药物浓度，根据实验方法列出的公式计算DZP-CHP纳米粒子的载药量和包封率。如表2，不同投料比1：2,1：5,1：10的纳米粒子载药后的载药量分别为：(12.02±1.90)％，(13.42±2.03)％，(7.40±1.72)％；包封率分别为：(42.00±5.65)％，(86.54±1.31)％，(59.71±4.43)％；DZP-CHP纳米粒子的载药量和包封率在投料比为1：5时达到最大。该结果表明使用该纳米粒子装载多奈哌齐可获得较好的载药量与包封率，且最佳投料比位于1：5附近。有文献报道，CHP纳米粒子的载药量和包封率具有饱和性，即药物与CHP纳米粒子质量比超过一定量时，投料比越大，纳米粒子的载药量和包封率反而越小。从上述实验结果中可以看出，在CHP与多奈哌齐的最适投料比为1：5。因此选用投料比为1：5的DZP-CHP进行下一步操作。

Table 1:不同药物投料比下(1:2、1:5、1:10)CHP纳米粒子的粒径、PDI、Zeta、载药量及包封率

3.3.DZP-CHP纳米粒子的体外药物释放与投料比的关系

在蒸馏水中，不同投料比的DZP-CHP载药纳米粒子的释放曲线，见图2。载药纳米粒子药物释放分两个阶段，初始阶段快速释放(Ⅰ相)，随后为持续长时间的缓慢释放(Ⅱ相)。这种释放特点的可能原因与多奈哌齐在DZP-CHP纳米粒子中的存在方式有关。其中一部分药物通过弱的相互作用吸附在DZP-CHP自聚集纳米粒子表面；而多数药物与DZP-CHP分子中的胆甾醇通过疏水相互作用进入纳米粒子的疏水内核。通过分子间的氢键黏附在CHP纳米粒子的表面糖链上的药物迅速释放引起Ⅰ相快速释放，而包载在颗粒疏水内核的药物缓慢扩散导致Ⅱ相的缓慢释放。通过不同的投料比获得了不同的载药量与包封率。药物包入纳米粒子内核数量增多而吸附表面的药物量减少使得药物Ⅰ相的快速释放减弱而Ⅱ相缓慢释放增强。由图5可见，投料比为1：5的DZP-CHP纳米粒子。这与其具有最高的包封率结果相一致。纳米粒子的粒径也会影响药物的释放速率，一般来说同种载体材料制成的纳米粒子，粒径越小界面积越大，释放速率也会越高。有意思的是，具有最小粒径的DZP-CHP(1：5)释放速率最慢，而最大粒径的DZP-CHP(1：2)释放最快。这可能是由于疏水相互作用最强的DZP-CHP(1：5)聚集最为紧密，处于较为稳定的状态，所以内部药物释放较为缓慢，而DZP-CHP(1：2)则反之，则此结果与先前的粒径结果相一致。

3.4.DZP-CHP纳米粒子与聚山梨酯80作用的热力学分析

等温滴定量热法经常用来测定两种物质的连接特性。因为物质结合的过程中伴有热量的产生或吸收，所以我们可以通过将聚山梨酯80滴定到DZP-CHP纳米粒子的溶液中并测定该反应体系的热量的变化，以反应二者接合情况。实验测得结果如图3，每次加入4ml的Tween80产生一个相对应的吸热峰，随着滴入次数大的增加，峰值逐渐降低，在第15次滴入时，峰值出现反转，变为尖端朝下的放热峰。测得相关的数据(如表2)分别为，coverage：2.70±0.372；KA(105M-1)：2.98±1.66；△H(cal/mol)：1710±311.4；△S(cal/mol/deg)：30.8。聚山梨酯80分子滴入CHP纳米粒子溶液的过程中，聚山梨酯80吸附到CHP纳米粒子表面。由图3可知，聚山梨酯80吸附到DZP-CHP纳米粒子表面的过程是一个吸热的过程17，而尾部微弱的放热峰可能是聚山梨酯80与黏附在纳米粒子表面的多奈哌齐发生反应，或者部分药物释放溶解于吐温80所致18。根据吉布斯自由能公式得出的结果为△G<0,表明该反应为自发反应。KA(105M-1)为2.98±1.66，说明了两者之间具有较好的亲和力。Coverage为2.7±0.372，意味着一个CHP分子表面约可吸附2.7个聚山梨酯80分子，而一个CHP纳米粒子由若干个CHP构成，该结果表明Tween80在CHP纳米粒子表面具有较好的覆盖率。

Table 2:25℃下DZP-CHP纳米粒子与聚山梨酯80作用的热力学分析结果

3.5 CHP、DZP-CHP和PS-DZP-CHP纳米粒子的表征

由透射电子显微镜照片(TEM×3万)(图4)可见所制得CHP、DZP-CHP、PS-DZP-CHP纳米粒子呈均匀的球形，形态较为均一。由表3和图5可知,以CHP为载体所制备的多奈哌齐载药纳米粒子DZP-CHP，载药前后的粒径分别为257.5±3.05、266.3±4.46，粒径比较均匀，分散指数分别为0.169±0.020、122±0.01，表明微球的粒径在载药前后变化不大比较稳定，而乳化后的粒径为335.2±5.46，有所增大。有文献报道，带有正电荷或负电荷的纳米粒子比中性纳米粒子表现出更多的药物释放量19。在CHP纳米颗粒中包载多奈哌齐后，Zeta电位从-2.81±0.27mV升至-0.66±0.04mV，这应该是由于聚合物与多奈哌齐之间的分子相互作用。根据相关研究结果，与带电纳米粒子比较，中性纳米粒子在体内巨噬细胞的吞噬明显减少，而吞噬作用是纳米粒子的主要清除因素，减少吞噬可能能显著延长纳米粒子在体内的循环时间，因此，DZP-CHP和游离药物多奈哌齐相比，在体内可能具有更长的循环时间。其在涂覆聚山梨醇酯80后又降至-2.22±0.86mV，文献报道，牛血清白蛋白(BSA)的表面电荷为-5.6mV，吸附于纳米粒子表面后能导致纳米粒子的电位降低，因此在本研究中，纳米粒子在0.7mmol的聚山梨酯80(PS)乳化剂中电位降低可能也与的吸附有关。也可能是由于增大的粒径引起纳米粒子表面电荷密度的降低，导致其zeta电位值减小。或者是由于纳米颗粒通过吸附的聚山梨酯80对表面电荷的屏蔽作用。

Table 3:三种CHP纳米粒子的粒径、PDI、Zeta、载药量及包封率

3.6.涂覆与未涂覆tween80的DZP-CHP纳米粒子体外药物释放比较

如图6所示，游离多奈哌齐(DZP)、载药CHP纳米粒子(DZP-CHP)、聚山梨醇酯80乳化的载药CHP纳米粒子(PS-DZP-CHP)在水溶液中72h的释放曲线，游离药物在很短的时间内释放完全，而负载多奈哌齐的CHP纳米粒子72h药物释放大约55.12％，有明显的控缓释作用。经聚山梨醇酯80乳化的载药CHP纳米粒子在72h药物释放约42.71％，释放相对较载多奈哌齐的CHP纳米粒子更缓慢。聚山梨醇酯80乳化的载药CHP纳米粒子释放较慢的原因可能为：PS-DZP-CHP纳米粒子周围有聚山梨醇酯80的存在，而聚山梨醇酯80的疏水区域对疏水小分子药物有强的吸附性，因此阻碍了药物向媒体的释放。

3.7 CHP、PS–CHP在小鼠体内靶向性比较

实验动物

实验用小鼠购买于南京君科生物工程有限公司，品系为C57小鼠，清洁级，雄性/雌性5-6周，体重：18-22g，所有小鼠饲养于湖南师范大学医学院动物房，饲养环境光照时间和黑暗时间各12小时，环境温度控制在22-26℃，相对湿度控制在50％～60％；EVC小鼠笼中每笼饲养5只小鼠，采用玉米芯灭菌垫料每4天换一次，应用灭菌鼠粮和纯净水喂养。在实验过程中对实验用裸鼠的处置均严格参照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的规定执行。

透析法制备ICG-CHP纳米粒子.

称取400mgCHP、20mg ICG(靛氰绿)溶于适量的DMSO中，将药物和材料溶液按照1:20的比例进行充分混合，采用以上方法制备荧光纳米粒子。DMSO透析干净后，取出溶液,探头超声仪50W超声2min，于10mL容量瓶中定容。用0.45μm滤膜过滤即得到ICG-CHP纳米粒子。放于4℃冰箱备用。

聚山梨酯80乳化ICG-CHP纳米粒子

将一定浓度的ICG-CHP定容到10ML的烧杯，将其吸入含有浓度为0.7mmol的聚山梨酯80(PS)乳化剂烧杯中，两者净置1h后，将混合溶液放置于EP管中，然后进行探头超声处理3min(输出功率为100W，采用间歇脉冲工作方式：脉冲宽度为2.0s，间歇时间2.0s),重复操作三次直至获得均一分散液，经滤膜过滤除去杂质即得聚山梨酯80乳化的吲哚箐绿载药纳米粒子(PS-ICG-CHP)。

荧光纳米颗粒在小鼠体内分布行为考察

将c57小鼠随机分为3组(每组3只)，剔除腹部及脑部毛发，1组小鼠尾静脉注射100μL游离ICG(20mgICG溶于适量的DMSO中)作为对照。第2组小鼠注射100μL ICG-CHP纳米粒子溶液，第3组小鼠注射100μL聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液，分别于注射后0h，1h，2h和4h活体成像系统(Cri maestro，PerkinElmer，USA)采集荧光活体图像。4h后处死的小鼠，收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏)进行离体成像和生物分布分析。

二、实验结果

通过近红外活体成像来评价CHP纳米粒子在小鼠体内的分布行为。

图7为尾静脉注射游离ICG、ICG-CHP纳米粒子溶液和聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液10min后的荧光信号及体内分布。图7A、B、C分别为100ul(A.游离ICG溶液B.ICG-CHP纳米粒子溶液C.聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液)尾静脉注射10min后的小鼠成像图。

由图7可见，ICG-CHP纳米粒子组比游离ICG组荧光信号强，同时，聚山梨酯80乳化后的CHP纳米颗粒组荧光信号强度进一步升高。以上实验结果显示将ICG负载于CHP纳米粒子后其体内的循环时间显著延长。图8为尾静脉注射游离ICG-CHP纳米粒子溶液和聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液1h后的荧光信号及体内分布。图8A、B分别为100ul(A.ICG-CHP纳米粒子溶液B.聚山梨酯80乳化的ICG-CHP纳米粒子溶液)尾静脉注射1h后的小鼠成像图。由图8可见，经聚山梨酯80乳化后CHP纳米颗粒的脑靶向作用进一步增强。

讨论

我们对本次实验吐温80与DZP-CHP纳米粒子的吸附进行热力学分析。一般情况下，结合反应是由氢键作用、静电作用、疏水作用及范德华力共同作用的结果。许多学者认为，当ΔH>0、ΔS>0时，疏水作用为主；当ΔH<0、ΔS<0时,氢键和范德华力为主要驱动力；当ΔH<0、ΔS>0时,静电作用力为主要作用力。因此,根据本次ITC实验结果显示，疏水作用在DZP-CHP纳米粒子与Tween80相互作用过程中都具有重要的作用。而根据Abhayraj S.等人的研究，聚山梨醇酯80在吸附CHP纳米粒子初始阶段可能发生结构变化，酰基链获得高度灵活的结构，吸附时，酰基链(-CH2)和酯基(-C＝O)在聚山梨酯80与CHP纳米粒子在疏水作用力dominates氢键下相互作用，使得polysorbate 80molecule approaches CHP纳米粒子表面,获得单层平面结构(如图9)。这与本次实验结果相一致。

纳米粒子粒径小等特性使得药物在体内的溶出性与缓释作用增强。此外，有研究表明，表面吸附了tween80的纳米制剂具有脑靶向性且更易透过血脑屏障，Tween80并不是因为具有细胞毒性而损伤血脑屏障的内皮细胞，使得紧密连接出现缝隙增加通透性才发挥脑靶向的其机制可能(如图10)Tween80涂覆于纳米粒子表面，可作为锚点，与载脂蛋白ApoB和ApoE发生吸附作用，此时，吸附了载脂蛋白的纳米粒子将模拟脂蛋白颗粒，可通过脂蛋白受体LDL-R和/或LRP介导的内吞作用与脑毛细血管内皮细胞相互作用而被其吸收。在这种情况下，该纳米粒子将作为绑定药物的特洛伊木马通过血脑屏障，而后药物释放于内皮细胞，通过扩散进一步转运到脑中，或者通过转胞吞作用被输送到脑组织，从而实现脑靶向发挥多奈哌齐胆碱酯酶抑制剂等作用以治疗AD。此外，聚山梨酯80还可能通过阻碍P-糖蛋白的特异性排外作用来增加药物转运。

Tween80覆盖的纳米粒子要实现跨血脑屏障还得经过与血浆中的ApoB和ApoE蛋白吸附的步骤。根据Atsushi IKAI的研究报道，Tween80与脂蛋白几乎是1：1结合，且结合是缓慢而紧密的，报道称15h后两者处于稳定反应状态，这有利于新剂型在体内缓慢稳定的发挥药效。Tween80与脂蛋白间是交联反应，电镜下可见弦样结构，长短不一(其和CHP之间很有可能也是交联，插在中间)。同时Tween80不会影响APOE和LDL的物理结构，较为安全。

另一方面，纳米粒子与蛋白的吸附也受多因素的影响，如纳米粒子的疏水性，Zeta电位，表面曲率以及表面粗糙程度等。其中，以前两者的影响最为重要。疏水性越强，蛋白与纳米粒子的吸附作用越强。由于构成该纳米粒子骨架的材料为CHP分子，其疏水基团为胆甾醇，疏水性极强，所以较易与血液中的蛋白质相互作用。Zeta电位对二者的吸附也有着重要影响，一般来说，带正电的纳米粒子会优先吸附等电点小于5.5的蛋白如白蛋白，而带负电荷的纳米粒子则正相反，且两者间的吸附作用随着表面电荷密度的增加而增强。我们的实验结果显示涂覆了Tween80的载药纳米粒子的zeta电位的绝对值要大于未涂覆Tween80的载药纳米粒子，且带负电，也就意味着Tween80可能增强了纳米粒子与蛋白的吸附作用，并且相比白蛋白，该新型纳米制剂应优先与血液中的载脂蛋白E(三种亚型E2，E3，E4的等电点均大于5.5)结合。

我们的实验已经证明PS-DZP-CHP除具有小分子疏水药物增溶作用外，还具有良好的缓释作用，体外释放实验结果表明，经聚山梨醇酯80乳化的载药CHP纳米粒子在72h药物释放约42.71％，释放量相对较未经乳化的纳米粒子下降约13个百分点。也就是说，该新型纳米制剂能够更加稳定的存于血液之中。这意味着其能在更长时间内维持血药浓度，延长服药间期，提高患者依从性。此外，由于稳定性的提高，进入全身循环的药量减少，更多的纳米粒子在释放药物前便跨过了血脑屏障，使得药物在脑部富集，实现了定位后释放，不仅可以减少给药量，对外周神经系统的毒性也随之减少。

结论

多奈哌齐与纳米材料的投料比对CHP纳米粒子的载药量、包封率及缓释效果有一定的影响，且为1：5附近时最佳。用Tween80对DZP-CHP纳米粒子进行表面修饰，ITC结果显示Tween80与纳米粒子间吸附性较好。CHP纳米制剂对多奈哌齐具有良好的载药量、包封率及缓释效果，而吸附Tween80后进一步加强了CHP纳米粒子的缓释作用。CHP纳米制剂经过Tween80表面修饰，将来有可能成为一种具有脑靶向功能的治疗神经系统疾病的新型药物制剂。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，其特征在于，所述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子包括胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、负载在所述胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子中的多奈哌齐以及吸附在所述胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子表面的聚山梨酯80；

所述纳米粒子制备方法包括以下步骤：将胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子、多奈哌齐和三乙胺溶于DMSO中，透析除去DMSO，透析液超声处理，经滤膜过滤得到胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐纳米粒子溶液；在所述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐纳米粒子溶液中加入聚山梨酯80，静置1小时后，超声处理至获得均一分散液，经滤膜过滤除去杂质，即得所述胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子；

其中，所述聚山梨酯80的浓度为0.7mM；所述胆甾醇疏水改性普鲁兰纳米粒子与所述多奈哌齐的投料比为1：5。

2.根据权利要求1所述的胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，其特征在于，所述透析过程具体为：将溶液转入透析袋，放入蒸馏水中，前12h每3h换水一次，后12h每隔6h换水一次，总共透析24h，所述透析袋的截留分子量为8～12KDa。

3.根据权利要求1所述的胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子，其特征在于，所述超声处理过程具体为：超声处理三次，超声仪器的输出功率为100W，采用间歇脉冲工作方式：脉冲宽度为2.0s，间歇时间2.0s。

4.一种权利要求1～3中任一项的胆甾醇疏水改性普鲁兰-多奈哌齐-聚山梨酯80纳米粒子在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。