CN111603608B - 普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种普鲁兰多糖‑透明质酸‑微纤维脊髓支架及其制备方法，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.1~1g，2%醋酸溶液1~20mL，10%透明质酸溶液0.5~5mL，微纤维0.05~0.5g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。本发明所述的配方原料来源广泛，具有医用高分子材料表面吸附、截留和接枝功能。本发明所述的配方所制备的脊髓支架无毒性和免疫学惰性，改善与血液接触的医用高分子材料的生物相容性。

Description

普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架及其制备方法

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种分区式普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架及其制备方法。

背景技术

近年来，中枢神经系统的损伤已成为临床案例中的常见现象，其中脊髓损伤导致的身体功能性的缺失给患者带来较大的伤害，也给社会带来了沉重的经济负担。脊髓损伤的治疗一直是一个世界性的难题，目前临床上使用的自身神经移植物的治疗手段对脊髓损伤的疗效非常有限，迫切需要研发出新的更为有效的治疗手段。因此，组织工程技术修复脊髓损伤成为神经科学的前沿课题之一。

普鲁兰多糖是由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖。它是1938年由R．Bauer发现的一种特殊的微生物多糖。该多糖主要是由麦芽三糖通过α-1，6糖苷键连接而成。由于该多糖独特的结构和性质，在医药、食品、石油、化工等行业具有广泛的应用前景。同时由于其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。普鲁兰多糖是无色、无味、无臭的高分子物质，非晶体的白色粉末，是非离子性、非还原性多糖，性质可以表现于以下几个方面：无毒性、安全性高，不会引起任何生物学毒性和异常状态的产生，所以用于食品和医药工业十分安全；结构上富有弹性，溶解度比较大。普鲁兰多糖的成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，并且具有易溶于水、无毒无害无致突变作用、无免疫原性、无致畸作用、良好的生物相容性和生物可降解性等优良特性。

透明质酸钠是人体内一种固有的成分，是一种葡聚糖醛酸，没有种属特异性，它广泛存在于胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织；器官中它分布在细胞质、细胞间质中，对其中所含的细胞和细胞器官本身起润滑与滋养作用。

微纤维对人体无毒害作用，安全可靠，具有良好的生物相容性，适于开发成功能性材料，它可应用于医药、卫生、食品、化工等众多领域。透明质酸是非常重要的天然生物高分子材料之一，具有良好的生物相容性和可降解性，已被广泛应用于食品、医药及化工产业。当前应用于脊髓损伤的支架很多，但生物可降解性不好，本发明最大的创新之处在于：支架制备成分都具有好的降解性，同样具有较好的生物可降解性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维支架及其制备方法，采用物理混合方法制备普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架材料，制备方法简单易于操作，无细胞毒副作用，生物相容性好，适用于脊髓组织细胞附着，体内易于代谢。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.1~1g，2%醋酸溶液1~20mL，10%透明质酸溶液0.5~5mL，微纤维0.05~0.5g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

其中，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.3~0.6g，2%醋酸溶液5~12mL，10%透明质酸溶液1~3mL，微纤维0.1~0.4g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

优选的，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.45g，2%醋酸溶液8mL，10%透明质酸溶液2mL，微纤维0.2g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

其中，所述2%醋酸溶液由纯水中加入醋酸配制而成，所述醋酸和纯水的体积比为1:49；

所述10%透明质酸溶液由透明质酸和纯水配制而成，所述透明质酸和纯水的质量比为1:9；

所述5%氢氧化钠溶液由氢氧化钠和纯水配制而成，所述氢氧化钠和纯水的质量比为1:19。

其中，所述微纤维的制备方法包括如下三阶段：

a、从茧制备脱胶纤维；

b、将脱胶纤维水解成微米级纤维，具体步骤为：

将氢氧化钠加入到蒸馏水中，当30%~40%的NaOH放热反应溶解时，加入干燥的脱胶纤维并用刮刀搅拌，进行水解，所述氢氧化钠蒸馏水和脱胶纤维的重量比为1:2.5~3.5:0.15~0.25；

c、微纤维洗涤、中和和冻干成纤维粉末；具体步骤为：

c-1、将8~10倍于蒸馏水体积的水加入到阶段b的反应混合物中，并以离心力2500~3000g、离心5~8min；

c-2、弃上清液，将纤维再悬浮于8~10倍于蒸馏水体积的水中，搅拌并离心；

c-3、重复5~8次步骤c-2，除去过量碱；

c-4、测量pH值，并使用盐酸调节pH值至7.0；

c-5、将中和的纤维溶液再次以3000-4000rpm离心5~20min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在PBS中并冻干，得到纤维粉末。

本发明还提供一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架的制备方法，、包括如下步骤：

（1）制备普鲁兰多糖-醋酸溶液：取配方量的普鲁兰多糖溶解于2%醋酸溶液中，静置过夜使其完全溶解；

（2）称量配方量的10%透明质酸溶液，将10%透明质酸溶液缓慢倒入步骤（1）制备的普鲁兰多糖-醋酸溶液中，用玻璃棒搅拌至充分溶解；

（3）称量配方量的微纤维，加入到步骤（2）的混合液中，搅拌，使其充分溶解；

（4）用5mL注射器吸取步骤（3）中制备好的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好PtTS模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷冻；

（5）取出步骤（4）冰箱内的PtTS模具，退去PtTS模具外层，将包裹内芯的PtTS轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和，用纯水清洗至中性；

（6）用镊子把步骤（5）中清洗至中性的PtTS模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，冷冻；

（7）取出步骤（6）中冷冻后的冻干瓶，利用冷冻干燥机将冻干瓶完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出PtTS，小心退去PtTS的内芯，得到普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架；

（8）将步骤（7）中制备好的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处保存，使用前取出脊髓支架用Co-60照射、消毒，备用。

优选的，所述的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架的制备方法包括如下步骤：

（1）′制备普鲁兰多糖-醋酸溶液：取0.45g普鲁兰多糖溶解于5mL的醋酸溶液中，静置过夜使其完全溶解；

（2）′称量2mL的10%透明质酸溶液，将10%透明质酸溶液缓慢倒入步骤（1）′制备的普鲁兰多糖-醋酸溶液中，用玻璃棒搅拌至充分溶解；

（3）′称量0.2g的微纤维，加入到步骤（2）′的混合液中，65℃超声搅拌2.5h，使其充分溶解；

（4）′用5mL注射器吸取步骤（3）′中制备好的0.8mL的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好PtTS模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱-20℃，冷冻过夜；

（5）′取出步骤（4）′冰箱内的PtTS模具，退去PtTS模具外层，将包裹内芯的PtTS轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用纯水清洗15min，洗涤8次，至用pH试纸检测浸洗后的水为中性；

（6）′用镊子把步骤（5）′中清洗至中性的PtTS模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱-20℃，冷冻2h后取出冻干瓶；

（7）′提前打开冷冻干燥机，待温度降至-40℃以下，真空降至0.02Pa时，将冻干瓶移接到冷冻干燥机上，并使其与真空泵连通起来，利用冷冻干燥机将冻干瓶冻干2h至完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出PtTS模具，小心退去PtTS的内芯，得到普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架；

（8）′将步骤（7）′中制备好的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处保存，使用前取出脊髓支架用Co-60照射、消毒，备用。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1、本发明所述的配方原料来源广泛，具有医用高分子材料表面吸附、截留和接枝功能。

2、本发明所述的配方所制备的脊髓支架无毒性和免疫学惰性，改善与血液接触的医用高分子材料的生物相容性。

3、本发明所述配方通过分区式组织工程脊髓（PtTS）模具制备的脊髓支架具有孔隙结构，空隙率大于70%，可以装载神经生长因子、干细胞、药物分子等等。

4、本发明所述方法通过分区式模具制备获得的支架能起到正确引导作用，使脊髓灰质与白质及白质内上行纤维束和下行纤维束彼此分在不同区域中生长的分区式组织工程脊髓。

5、本发明所述制备方法获得的脊髓支架具有很好的力学强度，最大荷重为6.453N。

6、本发明所述制备方法获得的脊髓支架具有很好的生物可降解性，易于代谢。

附图说明

图1为本发明制备的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架的扫描电镜图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供了一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.1~1g，2%醋酸溶液1~20mL，10%透明质酸溶液0.5~5mL，微纤维0.05~0.5g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

优选的，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.45g，2%醋酸溶液8mL，10%透明质酸溶液2mL，微纤维0.2g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

所述2%醋酸溶液由纯水中加入醋酸配制而成，所述醋酸和纯水的体积比为1:49。所述10%透明质酸溶液由透明质酸和纯水配制而成，所述透明质酸和纯水的质量比为1:9。所述5%氢氧化钠溶液由氢氧化钠和纯水配制而成，所述氢氧化钠和纯水的质量比为1:19。

本发明所用的微纤维的制备方法包括如下三阶段：

a、从茧制备脱胶纤维；

b、将脱胶纤维水解成微米级纤维，具体步骤为：

将氢氧化钠加入到蒸馏水中，当30%~40%的NaOH放热反应溶解时，加入干燥的脱胶纤维并用刮刀搅拌，进行水解，所述氢氧化钠蒸馏水和脱胶纤维的重量比为1:2.5~3.5:0.15~0.25。

c、微纤维洗涤、中和和冻干成纤维粉末；具体步骤为：

c-1、将8~10倍于蒸馏水体积的水加入到阶段b的反应混合物中，并以离心力2500~3000g、离心5~8min；

c-2、弃上清液，将纤维再悬浮于8~10倍于蒸馏水体积的水中，搅拌并离心；

c-3、重复5~8次步骤c-2，除去过量碱；

c-4、测量pH值，并使用盐酸调节pH值至7.0；

c-5、将中和的纤维溶液再次以3000-4000rpm离心5~20min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在PBS中并冻干，得到纤维粉末。

本发明中，为了微纤维的水解，使用了重1.75g的氢氧化钠加入到5mL蒸馏水中。当大约35%的NaOH放热反应溶解时，加入重0.35g的干燥的脱胶丝纤维并用刮刀搅拌。为了停止水解，将45mL水加入到反应混合物中。并以3000g力离心5分钟。弃上清液，将纤维再悬浮于50mL水中，搅拌并离心。重复该步骤5~8次除去过量碱。测量PH，并使用盐酸调节PH至7.0。将中和的纤维溶液再次以3500rpm离心5min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在PBS中并冻干以产生丝纤维粉末。（注:为获得400~500m和中等150~200m超细纤维，水解反应的时间分别进行30s和180s。为了获得10~20m的丝纤维，将反应混合物置于沸水浴中60s以帮助快速水解）。

本发明还提供一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备普鲁兰多糖-醋酸溶液：取配方量的普鲁兰多糖溶解于2%醋酸溶液中，静置过夜使其完全溶解；

（2）称量配方量的10%透明质酸溶液，将10%透明质酸溶液缓慢倒入步骤（1）制备的普鲁兰多糖-醋酸溶液中，用玻璃棒搅拌至充分溶解；

（3）称量配方量的微纤维，加入到步骤（2）的混合液中，搅拌，使其充分溶解；

（4）用5mL注射器吸取步骤（3）中制备好的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓（PtTS）模具中，固定好PtTS模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷冻；

（5）取出步骤（4）冰箱内的PtTS模具，退去PtTS模具外层，将包裹内芯的PtTS轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和，用纯水清洗至中性；

（6）用镊子把步骤（5）中清洗至中性的PtTS模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，冷冻；

（7）取出步骤（6）中冷冻后的冻干瓶，利用冷冻干燥机将冻干瓶完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出PtTS，小心退去PtTS的内芯，得到普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架；

（8）将步骤（7）中制备好的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处保存，使用前取出脊髓支架用Co-60照射、消毒，备用。

按照上述的制备方法具体制备下述3份样品，并对3份样品的孔隙率和力学强度进行比较，3份样品的组分比和各实验参数是目前实验条件下的较优组合，但不是限定本发明保护范围的唯一组合。

样品G1的制备，包括如下步骤：

（1）′制备普鲁兰多糖-醋酸溶液：取0.45g普鲁兰多糖溶解于5mL的醋酸溶液中，静置过夜使其完全溶解；

（2）′称量2mL的10%透明质酸溶液，将10%透明质酸溶液缓慢倒入步骤（1）′制备的普鲁兰多糖-醋酸溶液中，用玻璃棒搅拌至充分溶解；

（3）′称量0.2g的微纤维，加入到步骤（2）′的混合液中，65℃超声搅拌2.5h，使其充分溶解；

（4）′用5mL注射器吸取步骤（3）′中制备好的0.8mL的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓（PtTS）模具中，固定好PtTS模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱-20℃，冷冻过夜；

（5）′取出步骤（4）′冰箱内的PtTS模具，退去PtTS模具外层，将包裹内芯的PtTS轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用纯水清洗15min，洗涤8次，至用pH试纸检测浸洗后的水为中性；

（6）′用镊子把步骤（5）′中清洗至中性的PtTS模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱-20℃，冷冻2h后取出冻干瓶；

（7）′提前打开冷冻干燥机，待温度降至-40℃以下，真空降至0.02Pa时，将冻干瓶移接到冷冻干燥机上，并使其与真空泵连通起来，利用冷冻干燥机将冻干瓶冻干2h至完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出PtTS模具，小心退去PtTS的内芯，得到普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架；

（8）′将步骤（7）′中制备好的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处保存，使用前取出脊髓支架用Co-60照射、消毒，备用。

样品G2和G3除部分组分含量不同外，其余实施过程同样品G1，样品G2和G3的组方含量如下表一所示。

表一：

。

分别对样品G1、G2、G3进行孔隙率和拉力荷重检测，结果如表二所示。

表二：

由表二可知：G1组配方具有很好的孔隙率和力学强度，较好的满足细胞培养和细胞产物研究领域的要求，是研究组织工程的良好脊髓支架。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1、本发明所述的配方原料来源广泛，具有医用高分子材料表面吸附、截留和接枝功能。

2、本发明所述的配方所制备的脊髓支架无毒性和免疫学惰性，改善与血液接触的医用高分子材料的生物相容性。

3、本发明所述配方通过分区式组织工程脊髓（PtTS）模具制备的脊髓支架具有孔隙结构，空隙率大于70%，可以装载神经生长因子、干细胞、药物分子等等。

4、本发明所述方法通过分区式模具制备获得的支架能起到正确引导作用，使脊髓灰质与白质及白质内上行纤维束和下行纤维束彼此分在不同区域中生长的分区式组织工程脊髓。

5、本发明所述制备方法获得的脊髓支架具有很好的力学强度，最大荷重为6.453N。

6、本发明所述制备方法获得的脊髓支架具有很好的生物可降解性，易于代谢。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架，其特征在于，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.1~1g，2%醋酸溶液1~20mL，10%透明质酸溶液0.5~5mL，微纤维0.05~0.5g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性；

所述微纤维的制备方法包括如下三阶段：

a、从茧制备脱胶纤维；

b、将脱胶纤维水解成微米级纤维，具体步骤为：

将氢氧化钠加入到蒸馏水中，当30%~40%的NaOH放热反应溶解时，加入干燥的脱胶纤维并用刮刀搅拌，进行水解，所述氢氧化钠蒸馏水和脱胶纤维的重量比为1:2.5~3.5:0.15~0.25；

c、微纤维洗涤、中和和冻干成纤维粉末；具体步骤为：

c-1、将8~10倍于蒸馏水体积的水加入到阶段b的反应混合物中，并以离心力2500~3000g、离心5~8min；

c-2、弃上清液，将纤维再悬浮于8~10倍于蒸馏水体积的水中，搅拌并离心；

c-3、重复5~8次步骤c-2，除去过量碱；

c-4、测量pH值，并使用盐酸调节pH值至7.0；

c-5、将中和的纤维溶液再次以3000-4000rpm离心5~20min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在PBS中并冻干，得到纤维粉末。

2.根据权利要求1所述的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架，其特征在于，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.3~0.6g，2%醋酸溶液5~12mL，10%透明质酸溶液1~3mL，微纤维0.1~0.4g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

3.根据权利要求1或2所述的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架，其特征在于，每100mL的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：普鲁兰多糖0.45g，2%醋酸溶液8mL，10%透明质酸溶液2mL，微纤维0.2g，上述原料的混合液由5%氢氧化钠溶液中和后，水洗至中性。

4.根据权利要求1或2所述的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架，其特征在于，所述2%醋酸溶液由纯水中加入醋酸配制而成，所述醋酸和纯水的体积比为1:49；

所述10%透明质酸溶液由透明质酸和纯水配制而成，所述透明质酸和纯水的质量比为1:9；

所述5%氢氧化钠溶液由氢氧化钠和纯水配制而成，所述氢氧化钠和纯水的质量比为1:19。

5.一种普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备普鲁兰多糖-醋酸溶液：取配方量的普鲁兰多糖溶解于2%醋酸溶液中，静置过夜使其完全溶解；

（2）称量配方量的10%透明质酸溶液，将10%透明质酸溶液缓慢倒入步骤（1）制备的普鲁兰多糖-醋酸溶液中，用玻璃棒搅拌至充分溶解；

（3）称量配方量的微纤维，加入到步骤（2）的混合液中，搅拌，使其充分溶解；

所述微纤维的制备方法包括如下三阶段：

a、从茧制备脱胶纤维；

b、将脱胶纤维水解成微米级纤维，具体步骤为：

将氢氧化钠加入到蒸馏水中，当30%~40%的NaOH放热反应溶解时，加入干燥的脱胶纤维并用刮刀搅拌，进行水解，所述氢氧化钠蒸馏水和脱胶纤维的重量比为1:2.5~3.5:0.15~0.25；

c、微纤维洗涤、中和和冻干成纤维粉末；具体步骤为：

c-1、将8~10倍于蒸馏水体积的水加入到阶段b的反应混合物中，并以离心力2500~3000g、离心5~8min；

c-2、弃上清液，将纤维再悬浮于8~10倍于蒸馏水体积的水中，搅拌并离心；

c-3、重复5~8次步骤c-2，除去过量碱；

c-4、测量pH值，并使用盐酸调节pH值至7.0；

c-5、将中和的纤维溶液再次以3000-4000rpm离心5~20min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在PBS中并冻干，得到纤维粉末；

（4）用5mL注射器吸取步骤（3）中制备好的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好PtTS模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷冻；

（5）取出步骤（4）冰箱内的PtTS模具，退去PtTS模具外层，将包裹内芯的PtTS轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和，用纯水清洗至中性；

（6）用镊子把步骤（5）中清洗至中性的PtTS模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，冷冻；

（7）取出步骤（6）中冷冻后的冻干瓶，利用冷冻干燥机将冻干瓶完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出PtTS，小心退去PtTS的内芯，得到普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架；

（8）将步骤（7）中制备好的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处保存，使用前取出脊髓支架用Co-60照射、消毒，备用。

6.根据权利要求5 所述的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）′制备普鲁兰多糖-醋酸溶液：取0.45g普鲁兰多糖溶解于5mL的醋酸溶液中，静置过夜使其完全溶解；

（2）′称量2mL的10%透明质酸溶液，将10%透明质酸溶液缓慢倒入步骤（1）′制备的普鲁兰多糖-醋酸溶液中，用玻璃棒搅拌至充分溶解；

（3）′称量0.2g的微纤维，加入到步骤（2）′的混合液中，65℃超声搅拌2.5h，使其充分溶解；

（4）′用5mL注射器吸取步骤（3）′中制备好的0.8mL的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好PtTS模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱-20℃，冷冻过夜；

（5）′取出步骤（4）′冰箱内的PtTS模具，退去PtTS模具外层，将包裹内芯的PtTS轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用纯水清洗15min，洗涤8次，至用pH试纸检测浸洗后的水为中性；

（6）′用镊子把步骤（5）′中清洗至中性的PtTS模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱-20℃，冷冻2h后取出冻干瓶；

（7）′提前打开冷冻干燥机，待温度降至-40℃以下，真空降至0.02Pa时，将冻干瓶移接到冷冻干燥机上，并使其与真空泵连通起来，利用冷冻干燥机将冻干瓶冻干2h至完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出PtTS模具，小心退去PtTS的内芯，得到普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架；

（8）′将步骤（7）′中制备好的普鲁兰多糖-透明质酸-微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处保存，使用前取出脊髓支架用Co-60照射、消毒，备用。

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