CN117298355B - 一种包裹性透明质酸凝胶组合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种包裹性透明质酸凝胶组合物及其制备方法与应用，所述包裹性透明质酸凝胶组合物由二硫键交联透明质酸凝胶和非交联透明质酸溶液团组成，所述非交联透明质酸溶液团被包裹于所述二硫键交联透明质酸凝胶中。本发明提供包裹性透明质酸凝胶组合物，不仅更容易推挤和注射，还提高了凝胶的粘度稳定性；此外，还不需要额外添加交联剂，降低了凝胶中修饰透明质酸的相对占比，提升了凝胶的生物安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种包裹性透明质酸凝胶组合物及其制备方法与应用。
背景技术
透明质酸是一种由重复二糖单元(α-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-N-乙酰-D-葡萄糖胺)组成的非磺化糖胺聚糖，存在于所有结缔组织中，具有良好的生物相容性和独特的理化性质。由于其具有流动性且在体内会被透明质酸酶快速降解，因而在临床中应用受到限制。
交联反应可有效降低透明质酸的流动性和延缓其在体内的降解吸收，然而，不当的交联反应也可能损害透明质酸的生物相容性，当前透明质酸交联反应常规采用二乙烯基亚砜(DVS)或1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，反应中可能存在大量的未反应的单端官能团，该残余的单端官能团与交联材料以化学键连接，无法通过纯化工艺去除，在临床使用中可能引发多种毒副反应(Edsman等，Dermatol Surg 2012，38:1170-1179)。
现有技术中，公开号CN101056891A的专利提供了一种交联剂含量少且显示优异的粘弹性的交联透明质酸凝胶制备方法，在酸性（pH=1~5）或碱性（pH=10~14）条件下将含有透明质酸10W/V％以上、交联剂和水的混合物搅拌混合。此方法通过提高透明质酸浓度，降低了交联剂使用量。公开号CN101107270A的专利提供了一种制备包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的均质水凝胶的方法，包括步骤：(a)提供透明质酸或其盐的碱性溶液；(b)将DVS加到步骤(a)的溶液中，由此用DVS交联透明质酸或其盐以形成凝胶；(c)用缓冲剂处理步骤(b)的凝胶，其中凝胶溶胀且形成包含由DVS交联的透明质酸或其盐的水凝胶。此方法制备的凝胶显示增强的均质性和增强的柔软性。
上述专利方法通过交联反应制备的交联透明质酸凝胶，虽然降低了透明质酸的流动性并延缓其在体内的降解吸收速度，在一定程度上降低了交联剂使用量，提高了凝胶的生物安全性，但是，该等交联透明质酸凝胶产品因具有较大的凝胶强度，即使粉碎为颗粒状后其推挤力依然较大，临床应用受到限制。此外，这种凝胶在注射时会因机械性挤压破坏了聚合物的非交联位点，这会变得更易受到体内生化和酶的攻击，从而导致凝胶的迅速降解，进一步影响产品的临床施用。
故而，为了便于临床注射，对凝胶通过注射针或延长管产生的推挤力提出要求。为了降低产品的推挤力，需要将透明质酸凝胶粉碎成细小颗粒，进一步地，通常还会在交联透明质酸中添加一定比例的非交联透明质酸，以降低凝胶颗粒间的摩擦力。
公开号CN112334167 A的专利提供了一种包含交联聚合物水凝胶组合物，组合物由交联透明质酸、未修饰的透明质酸等组成。其中的一组制备方法为：将巯基修饰的透明质酸、未修饰的透明质酸和盐酸利多卡因同时溶解在水性溶液中。将pH调节至约6.8至7.6后，通过氧将巯基基团氧化为二硫键而使巯基修饰的透明质酸交联，得到聚合物水凝胶组合物即为互穿网络凝胶，该方法添加一定比例非交联透明质酸制得凝胶组合物，然而，互穿网络凝胶并不能降低凝胶的推挤力。
而对于能够降低凝胶挤推力的物理混合双相凝胶而言，如Restylane®、 Durolane®、Pelane®等，它们由交联透明质酸与非交联透明质酸混合均质制备而成，用于面部填充或关节炎的增粘治疗。此类物理混合双相凝胶相当于非交联透明质酸包裹/半包裹着交联透明质酸凝胶颗粒，由于非交联透明质酸热稳定性较差，因而这一类产品虽能降低凝胶的推挤力，但凝胶粘度稳定性也随之降低，因此物理混合双相凝胶的粘度稳定性均较差。
因此，本领域亟需一种新的透明质酸凝胶组合物，能够兼具便于注射、生物安全性好以及凝胶粘度稳定性好的优点，对于透明质酸凝胶组合物及其衍生物的制备和应用产生积极意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，交联透明质酸凝胶虽然延长了降解时间，但不能兼具少添加甚至不添加交联剂的优点，此外也不便于注射且凝胶的稳定性较差。因此，本发明提供一种包裹性透明质酸凝胶组合物，不仅更容易推挤和注射，还提高了凝胶的粘度稳定性；此外，还不需要额外添加交联剂，降低了凝胶中修饰透明质酸的相对占比，提升了凝胶的生物安全性。
为解决上述技术问题，本发明提供一种包裹性透明质酸凝胶组合物，所述包裹性透明质酸凝胶组合物由以下两部分组成：
1）二硫键交联透明质酸凝胶，和
2）非交联透明质酸溶液团；
其中，所述非交联透明质酸溶液团被包裹于所述二硫键交联透明质酸凝胶中。
临床使用时，透明质酸凝胶通常需通过注射针局部注射至目标位置，或通过延长管推注至患处。通常透明质酸被交联后，由于较大的凝胶强度且流动弥散性较差，使用时较难推挤甚至可能出现爆针的危险情况。此外，透明质酸凝胶产品还需要在有效期内尽可能的维持凝胶的粘度稳定性和弹性模量（G’），因此交联的透明质酸凝胶用于注射/推注时需要特别优化设计。
在本发明中，所述的包裹性透明质酸凝胶组合物包括二硫键交联透明质酸凝胶和非交联透明质酸溶液团，非交联透明质酸溶液团被包裹于二硫键交联透明质酸凝胶中，包裹性透明质酸凝胶在粉碎制粒和/或使用推注时，有部分非交联透明质酸溶液团破裂，这部分破裂的非交联透明质酸溶液团可增加凝胶颗粒的润滑性，可有效的降低凝胶的推挤力，而另一部分存留的完整的非交联透明质酸溶液团则增加了凝胶的粘度稳定性和弹性模量（G’）。
具体地，所述非交联透明质酸溶液团的粒径不大于5000μm。
优选地，所述非交联透明质酸溶液团的粒径为50~2000μm；更优选地，所述非交联透明质酸溶液团的粒径为50μm、100μm、150μm 、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1100μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm或2000μm。
具体地，所述非交联透明质酸溶液团的分子量为100KDa~2500KDa。
优选地，所述非交联透明质酸溶液团的分子量为1000KDa~2200KDa；更优选地，所述非交联透明质酸溶液团的分子量为1100KDa、1200KDa、1300 KDa、1400 KDa、1500 KDa、1600 KDa、1700 KDa、1800 KDa、1900 KDa、2000 KDa、2100 KDa或2200 KDa。
本发明中，大分子量的非交联透明质酸溶液团所制得的包裹性透明质酸凝胶组合物具有较好的润滑效果，显著降低凝胶的推挤力。
具体地，所述二硫键交联透明质酸凝胶的含量为4~50mg/mL。
优选地，所述二硫键交联透明质酸凝胶的含量为10~25mg/mL。
在本发明中，所述二硫键交联透明质酸凝胶的含量表示为组合物中单位体积中含有的二硫键交联透明质酸的重量(mg/mL)。
具体地，所述二硫键交联透明质酸凝胶由透明质酸巯基化衍生物制备而成。所述透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）是指含有巯基的透明质酸衍生物，可通过透明质酸的巯基化改性制备，也包括各种透明质酸衍生物(如羧甲基透明质酸、乙酰化透明质酸及其钠盐、钾盐等)进一步通过巯基化改性所制备的巯基化衍生物，例如采用Shu等，Biomacromolecules 2002，3:1304-1311等在先文件所公开的多种透明质酸巯基化衍生物制备方法均可用于制备本发明所述的透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）；该等透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）较好保持了非交联透明质酸的初始结构、生理功能和生物相容性，且可实现有效的二硫键交联。
具体地，所述透明质酸巯基化衍生物的巯基含量为5~250μmol/g聚合物。
优选地，所述透明质酸巯基化衍生物的巯基含量为20~125μmol/g聚合物。
本发明中，透明质酸巯基化衍生物的巯基含量表示为每克透明质酸巯基化衍生物中含有的巯基的微摩尔数(μmol/g)。
具体地，所述透明质酸也包括其盐的形式，所述盐的形式包括钠盐、钾盐、钙盐和锌盐。
本发明的另一方面提供了一种包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，所述包裹性透明质酸凝胶组合物为前述的包裹性透明质酸凝胶组合物，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1、将透明质酸巯基化衍生物溶于缓冲溶液，加入非交联透明质酸固体颗粒，均匀混合，调节pH，经氧化过程形成二硫键交联透明质酸凝胶；
步骤2、将步骤1得到的二硫键交联透明质酸凝胶置于中性缓冲溶液中浸泡，过滤后得到包裹性透明质酸凝胶组合物；
其中，步骤2中，所述二硫键交联透明质酸凝胶中的非交联透明质酸固体颗粒因吸水恢复溶解状态，成为透明质酸溶液团，并被包裹在二硫键交联透明质酸凝胶中。将二硫键交联透明质酸凝胶置于等渗缓冲溶液中，因渗透作用，中性缓冲液的成分穿透凝胶接触非交联透明质酸固体颗粒，非交联透明质酸固体颗粒因吸水恢复溶解状态，从而得到透明质酸溶液团。
具体地，步骤1中，所述非交联透明质酸固体颗粒为透明质酸水性溶液经由溶剂沉淀和粉碎筛分制得，所述溶剂沉淀所使用的沉淀剂为乙醇、丙酮、乙酸乙酯或二甲基亚砜中的一种，或可为本领域熟知的其他沉淀溶剂。
在一具体实施方式中，向透明质酸2%的氯化钠溶液，一边搅拌一边加入2倍体积的无水乙醇，将得到的絮状沉淀挤干、撕碎，再次加入乙醇，萃取多余水分，过滤。得到的固体沉淀，真空干燥，除去残留乙醇和水分。进一步经粉碎筛分即可得到一定粒径非交联透明质酸固体颗粒。
具体地，所述透明质酸水性溶液为氯化钠、氯化钾或氯化镁中的一种，所述透明质酸水性溶液的浓度为1%~10%，低于1%时，溶剂的不能将透明质酸沉淀出来，高于10%时，盐会随同透明质酸一同析出，不利于后续粉碎时粒径的控制。
优选地，所述透明质酸水性溶液的浓度为2%~4%。
具体地，步骤1中，所述非交联透明质酸固体颗粒溶胀度不超过20%，所述非交联透明质酸固体颗粒加至缓冲溶液中后，所述非交联透明质酸固体颗粒至少30分钟保持吸水溶胀但不溶解。
互穿网络结构的非交联透明质酸不能起到润滑作用，因此互穿网络结凝胶较难降低注射时推挤力。本发明中，非交联透明质酸固体颗粒加至透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）缓冲溶液后，非交联透明质酸固体颗粒溶胀度不超过0.2，以限制非交联透明质酸与透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）互溶形成互穿网络结构。
具体地，步骤2中，所述浸泡的时间不超过4天。
具体地，步骤1中，所述缓冲溶液的pH值为7~10。
优选地，步骤1中，所述缓冲溶液的pH值为8~9。
具体地，步骤1中，温度为10~50℃，混合的搅拌速度为100~2000转/分钟。
具体地，步骤1中，所述氧化过程是指在有氧环境下进行作用，所述有氧环境的氧气来源为搅拌过程中接触空气中的氧气或水溶液中的溶解氧和/或外部通入的纯氧气。
上述的物理混合过程和通入纯氧气可采用本领域技术人员所熟知的方式，如机械搅拌混合或细长管通入氧气等。本制备方法通过透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）缓冲溶液在氧气的氧化作用下实现二硫键交联凝胶，具有不需要添加交联剂的优点，为了加速二硫键交联速率，可通过调节溶解pH至碱性实现，当pH超过10，交联速率过快导致交联不均匀影响凝胶力学性能。二硫键交联反应副产物为水，具有制备工艺简单以及不含杂质等许多优点。
本发明还提供一种包裹性透明质酸凝胶组合物在医学中的应用，所述包裹性透明质酸凝胶组合物采用如前所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法制备而成。
具体地，所述包裹性透明质酸凝胶组合物经灌装或粉碎处理后，进行灭菌，制成最终产品；
其中，所述粉碎处理是指将包裹性透明质酸凝胶组合物粉碎成透明质酸凝胶颗粒后再灌装至容器中，经灭菌后得最终产品，所述透明质酸凝胶颗粒的粒径大于非交联透明质酸固体颗粒的粒径。
具体地，所述最终产品在医学中的应用包括宫腔、盆腹腔和五官科的术后组织粘连预防、骨性关节炎增粘治疗、软组织填充与增强和水光注射。
具体地，根据不同临床适应症，包裹性透明质酸凝胶组合物可直接灌装于容器中，也可进一步粉碎筛分后得透明质酸凝胶颗粒再灌装于容器中，容器为各种规格的注射器和/或共挤膜袋。
宫腔、盆腹腔、五官科等术后组织粘连预防用凝胶，一般灌装至注射器内或共挤膜袋内，使用前无菌容器需链接一次性延长管，其内径为2.0~5mm，长度为60~350mm，非交联透明质酸固体颗粒粒径不大于2000μm且不少于500μm，在灌装和临床推注使用时，部分被包裹透明质酸溶液团被挤碎，透明质酸溶液流出，可降低包裹性透明质酸凝胶的推挤力。非交联透明质酸固体颗粒粒径小于500μm时，灌装和临床推注使用时只有极少部分透明质酸溶液团被挤碎，不能起到降低推挤力的目的。
在骨性关节炎增粘治疗，软组织填充与增强注射时，一般采用20~30G针头，非交联透明质酸固体颗粒粒径控制在200 ~800μm。
一些特别的应用场景，如面颈部、手部、私处皮肤水光注射，通常为点状密级注射，采用细针头（如32G、34G）可有效的降低注射时疼痛感，因此需要控制凝胶的颗粒大小以及凝胶颗粒之间的摩擦力以便凝胶顺利平滑的通过针头。此时，非交联透明质酸固体颗粒粒径需小于200μm大于50μm。
本发明的包裹性透明质酸凝胶组合物具有以下有益效果：
1、本发明提供的包裹性透明质酸凝胶组合物，相较于互穿网络凝胶，本发明提供的包裹性透明质酸凝胶组合物通过较细注射针时推挤力更小，解决了推挤困难的问题；相较于混合凝胶，本发明提供的包裹性透明质酸凝胶组合物具有更好的粘度稳定性，特别是非交联比例较高的复合凝胶。因此，本发明的包裹性透明质酸凝胶组合物兼具推挤力小和粘度稳定性好的优点。此外，本发明提供的包裹性透明质酸凝胶组合物在制备过程中，不需要额外添加交联剂，降低了凝胶中修饰透明质酸的相对占比，化学修饰度相对更低，生物相容性好的同时也提升了凝胶的生物安全性。
2、本发明提供的包裹性透明质酸凝胶组合物，制备工艺的操作步骤简单，易操作，且可以适用于多种类型的临床症状，如宫腔、盆腹腔和五官科的术后组织粘连预防、骨性关节炎增粘治疗、软组织填充与增强和水光注射等，应用范围广泛。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某个实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例10~12、对比例2、对比例4和对比例6制备的透明质酸凝胶所得的体外酶解曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 非交联透明质酸固体颗粒的制备及其抗溶解性能和溶胀度测试
将2g分子量1500KDa非交联透明质酸溶解于200mL，2%氯化钠溶液中，一边搅拌一边加入400mL乙醇，收集絮状沉淀，挤干，加入100mL乙醇，静置12小时，萃取多余水分，过滤，减压除去沉淀中残留乙醇，沉淀经粉碎、筛分出粒径50~2000μm的颗粒。
将筛分出粒径50~2000μm的非交联透明质酸固体颗粒加至30℃，pH=8.0水溶液中，搅拌30分钟后过滤，得吸水溶胀后的非交联透明质酸固体颗粒，滤液采用葡萄糖醛酸法测试（YY/T 0962-2021，附录C，透明质酸钠含量的测定），当水溶液中透明质酸比例低于1%，可认为非交联透明质酸固体颗粒在测试条件下不发生溶解；过滤后颗粒吸干表面水分，计算固体颗粒溶胀度。
固体颗粒溶胀度计算方法：
Q=(m2-m1)/m1；式中，Q为非交联透明质酸固体颗粒溶胀度；m1为测试前非交联透明质酸固体颗粒质量（g）；m2为测试后非交联透明质酸固体颗粒质量（g）
实施例2 非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例2中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸固体颗粒粒径为200~800μm。
实施例3非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例3中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸固体颗粒粒径为50~200μm。
实施例4 非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例4中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸固体颗粒粒径为50~200μm，所用氯化钠为1%氯化钠。
实施例5 非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例5中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸分子量为1000KDa。
实施例6 非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例6中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸分子量为1000KDa，非交联透明质酸固体颗粒粒径为50~200μm。
实施例7 非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例7中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸分子量为2200KDa。
实施例8非交联透明质酸固体颗粒制备以及抗溶解性能、溶胀度测试
实施例8中，非交联透明质酸固体颗粒的制作方法同实施例1，区别在于非交联透明质酸分子量为2200KDa，非交联透明质酸固体颗粒粒径为50~200μm。
实施例1~8测试结果如下表1：
表1
根据上表1的内容可以看出，在温度范围10~50℃，pH值7~9，搅拌速度100~2000转/分钟任一组合条件下，非交联透明质酸固体颗粒至少30分钟保持吸水溶胀但不溶解。
实施例9 透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）制备
透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）以200KDa分子量的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002，3:1304-1311)，其巯基含量分别为25μmol/g、62μmol/g和128μmol/g。
实施例10 骨性关节炎增粘治疗、软组织填充与增强注射用包裹性透明质酸凝胶组合物制备
将巯基含量为128μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）2.0g溶于100mL缓冲溶液，加入0.2g非交联透明质酸固体颗粒（1500KDa，粒径200~800μm），均匀混合，调节pH至8.0，搅拌，混合液逐渐失去流动性，5分钟后形成二硫键交联透明质酸凝胶。
将上述二硫键交联透明质酸凝胶置于3L等渗缓冲溶液，4次，每间隔2小时更换等渗缓冲溶液。最后一次静置24小时，包裹的非交联透明质酸固体颗粒吸水膨胀最终溶解，过滤后得包裹性透明质酸凝胶。
包裹性透明质酸凝胶经300μm筛孔版粉碎2次后灌装于1mL注射器中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得骨性关节炎增粘治疗、软组织填充与增强注射用包裹性透明质酸凝胶组合物。
实施例11 水光注射用包裹性透明质酸凝胶组合物制备
将巯基含量为62μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）0.8g溶于100mL缓冲溶液，加入0.4g非交联透明质酸固体颗粒（1500KDa，粒径50 ~200μm），均匀混合，调节pH至8.0，搅拌，混合液逐渐失去流动性，15分钟后形成二硫键交联透明质酸凝胶。
将上述二硫键交联透明质酸凝胶置于3L等渗缓冲溶液，4次，每间隔2小时更换等渗缓冲溶液。最后一次静置24小时，包裹的非交联透明质酸固体颗粒吸水膨胀最终溶解，即得包裹性透明质酸凝胶。
包裹性透明质酸凝胶经100μm筛孔版粉碎2次后灌装于1mL注射器中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得水光注射用包裹性透明质酸凝胶组合物。
实施例12 术后组织粘连预防用包裹性透明质酸凝胶组合物制备
将巯基含量为25μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）0.5g溶于100mL缓冲溶液，加入0.2g非交联透明质酸固体颗粒（1500KDa，粒径500 ~2000μm），均匀混合，调节pH至9.0，搅拌并通入纯氧气，混合液逐渐失去流动性，25分钟后形成二硫键交联透明质酸凝胶；
将上述二硫键交联透明质酸凝胶置于3L等渗缓冲溶液，4次，每间隔2小时更换等渗缓冲溶液。最后一次静置12小时，包裹的非交联透明质酸固体颗粒吸水膨胀最终溶解，即得包裹性透明质酸凝胶。
包裹性透明质酸凝胶灌装于3mL注射器中或100mL共挤膜袋中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得术后组织粘连预防用包裹性透明质酸凝胶组合物。
设置对比例1-6，分别制备在不同治疗用途下的互穿网络凝胶与双相透明质酸凝胶，并与本发明所提供的包裹性透明质酸凝胶进行挤推力、粘度和体外抗酶解能力的测试对比。
对比例1 骨性关节炎增粘治疗，软组织填充与增强注射用包裹性透明质酸凝胶制备（互穿网络凝胶）
将巯基含量为128μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）2.0g溶于100mL缓冲溶液；0.2g非交联透明质酸（1500KDa）溶于100mL缓冲溶液；透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）与非交联透明质酸按质量比9：1混合并搅拌至均匀，调节pH至7.2，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；50℃密闭静置保存1周，溶液失去流动性并形成互穿网络透明质酸水凝胶。
互穿网络透明质酸凝胶经300μm筛孔版粉碎2次后灌装于1mL注射器中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得骨性关节炎增粘治疗，软组织填充与增强注射用互穿网络透明质酸凝胶。
对比例2 骨性关节炎增粘治疗、软组织填充与增强注射用包裹性透明质酸凝胶制备（双相透明质酸凝胶）
将巯基含量为128μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）2.0g溶于100mL缓冲溶液，调节pH至7.2，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；50℃密闭静置保存1周，溶液失去流动性并形成二硫键交联透明质酸凝胶。
将0.2g非交联透明质酸（1500KDa）溶于100mL缓冲溶液；透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）与非交联透明质酸按质量比9：1混合并搅拌至均匀，经300μm筛孔版粉碎2次后灌装于1mL注射器中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得骨性关节炎增粘治疗，软组织填充与增强注射用双相透明质酸凝胶。
对比例3 水光注射用包裹性透明质酸凝胶制备（互穿网络凝胶）
将巯基含量为62μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）0.8g溶于100mL缓冲溶液；0.4g非交联透明质酸（1500KDa）溶于100mL缓冲溶液；透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）与非交联透明质酸按质量比2：1混合并搅拌至均匀，调节pH至7.2，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；50℃密闭静置保存1周，溶液失去流动性并形成互穿网络透明质酸水凝胶。
互穿网络透明质酸凝胶经100μm筛孔版粉碎2次后灌装于1mL注射器中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得水光注射用互穿网络透明质酸凝胶。
对比例4 水光注射用包裹性透明质酸凝胶制备（双相透明质酸凝胶）
将巯基含量为62μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）0.8g溶于100mL缓冲溶液，调节pH至7.2，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；50℃密闭静置保存1周，溶液失去流动性并形成二硫键交联透明质酸凝胶。
将0.4g非交联透明质酸（1500KDa）溶于100mL缓冲溶液；透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）与非交联透明质酸按质量比2：1混合并搅拌至均匀，经100μm筛孔版粉碎2次后灌装于1mL注射器中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得水光注射用双相透明质酸凝胶。
对比例5 术后组织粘连预防用包裹性透明质酸凝胶制备（互穿网络凝胶）
将巯基含量为25μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）0.5g溶于100mL缓冲溶液；0.2g非交联透明质酸（1500KDa）溶于100mL缓冲溶液；透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）与非交联透明质酸按质量比5：2混合并搅拌至均匀，调节pH至7.2，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；50℃密闭静置保存2周，溶液失去流动性并形成互穿网络透明质酸水凝胶。
互穿网络透明质酸凝胶灌装于3mL注射器中或100mL共挤膜袋中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得术后组织粘连预防用互穿网络透明质酸凝胶。
对比例6 术后组织粘连预防用包裹性透明质酸凝胶制备（双相透明质酸凝胶）
将巯基含量为25μmol/g透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）0.5g溶于100mL缓冲溶液，调节pH至7.2，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；50℃密闭静置保存1周，溶液失去流动性并形成二硫键交联透明质酸凝胶。
将0.2g非交联透明质酸（1500KDa）溶于100mL缓冲溶液；透明质酸巯基化衍生物（HA-SH）与非交联透明质酸按质量比5：2混合并搅拌至均匀，双相透明质酸凝胶灌装于3mL注射器中或100mL共挤膜袋中，经湿热灭菌(121℃，15分钟)后即得术后组织粘连预防用双相透明质酸凝胶。
测试例1透明质酸凝胶推挤力，粘度测试
对实施例10~12，对比例1、对比例3、对比例5所制备的凝胶进行推挤力，粘度测试。
推挤力测试方法：实施例10和对比例1安装27G针头；实施例11和对比例3安装32G针头；实施例12和对比例5安装延长管（内径为2.5mm，长度为150mm），以30 mm/min的速度推动，记录注射器柄平均推挤力。
粘度测试方法：取各组样品凝胶适量，按照《中华人民共和国药典》2020 版四部通则 0633 黏度测定法 第三法 旋转黏度计测定法进行测试，测试条件为剪切速率不小于0.25Hz、（25±0.1）℃。
稳定性加速实验条件：50℃，湿度75%，加速0天、137天、274天后测试样品的推挤力以及粘度，测试结果如下表2。
表2
实施例10~12为本发明提供的包裹性透明质酸凝胶，对比例1、对比例3、对比例5为互穿网络凝胶。实施例10和对比例1凝胶各组分含量一致，交联透明质酸含量以及凝胶粒径均一致。实施例11和对比例3以及实施例12和对比例5同上述实施例10和对比例1情况一致。
根据表2可以看出，以实施例10和对比例1为例，实施例10为包裹性透明质酸凝胶，与对比例1相比，其推挤力更小，粘度略大，粘度稳定性相当。
说明包裹性透明质酸凝胶相对于互穿网络凝胶，在粘度稳定性相当的前提下，包裹性透明质酸凝胶的推挤力更小，更有利于临床便捷使用。
测试例2透明质酸凝胶推挤力，粘度测试
实施例10~12，对比例2、对比例4、对比例6所制备的凝胶进行推挤力，粘度以及弹性模量G＇测试。
推挤力测试方法：实施例10和对比例2安装27G针头；实施例11和对比例4安装32G针头；实施例12和对比例6安装延长管（内径为2.5mm，长度为150mm），以30 mm/min的速度推动，记录注射器柄平均推挤力。
粘度测试方法：取各组样品凝胶适量，按照《中华人民共和国药典》2020 版四部通则 0633 黏度测定法 第三法 旋转黏度计测定法进行测试，测试条件为剪切速率不小于0.25Hz、温度（25±0.1）℃。
稳定性加速实验条件：50℃，湿度75%，加速0天、137天、274天后测试样品的推挤力以及粘度。
弹性模量G＇测试方法：取1g样品，使用流变仪(Anton Paar， MCR 301)对样品进行测试，测试选用直径为50mm的平板，板间距设置为0.5mm，测试温度25C，剪切应力0.001，测试结果如下表3。
表3
实施例10~12为包裹性透明质酸凝胶，对比例2、对比例4、对比例6为双相透明质酸凝胶。实施例10和对比例2凝胶各组分含量一致，交联透明质酸含量以及凝胶粒径均一致。实施例11和对比例4以及实施例12和对比例5同上述实施例10和对比例2情况一致。
根据表3数据可看出，以实施例10和对比例2为例，实施例10为包裹性透明质酸凝胶，与对比例2相比，其推挤力相当，但其粘度更大，粘度稳定性更好。
说明包裹性透明质酸凝胶相对于双相透明质酸凝胶，在推挤力相当的前提下，包裹性透明质酸凝胶的粘度更大，粘度稳定性更好。
测试例3透明质酸凝胶体外抗酶解性能测试
体外抗酶解性能测试方法：精密称取0.5g实施例10~12，对比例2、对比例4、对比例6所制备得到的凝胶，加入1.5ml玻璃酸酶溶液（10 U/mL），样品置于恒温摇床（37℃，20rmp/min），规定时间内取出， 100℃煮沸10 min灭活，灭活液经离心，0.22um微孔滤膜过滤，取滤液1.0 mL，采用葡萄糖醛酸法测试（YY/T 0962-2021，附录C，透明质酸钠含量的测定）进行含量测试。
透明质酸凝胶体外酶解计算方法：
酶解率/%=4a / b*100%；其中，a为离心后的灭活液中透明质酸钠含量；b为样品中透明质酸钠含量。
酶解率越低，表示凝胶的抗酶解性能越好，在体内存量的时间越长。
如图1所示，为实施例10~12，对比例2、对比例4、对比例6制备的透明质酸凝胶所得体外酶解曲线。
其中，实施例10~12为包裹性透明质酸凝胶，对比例1、对比例3、对比例5为互穿网络凝胶，对比例2、对比例4、对比例6为双相透明质酸凝胶。从图1可以看出，实施例10~12与其他对比例相比，在相同时间点时，酶解百分率更低，凝胶的抗酶解性能更好，在体内存量的时间更长。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (20)
1. 一种包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述包裹性透明质酸凝胶组合物由以下两部分组成：
1）二硫键交联透明质酸凝胶，和
2）非交联透明质酸溶液团；
其中，所述非交联透明质酸溶液团被包裹于所述二硫键交联透明质酸凝胶中，所述二硫键交联透明质酸凝胶的含量为25~50mg/mL，所述非交联透明质酸溶液团由非交联透明质酸固体颗粒形成，所述非交联透明质酸固体颗粒加入所述二硫键交联透明质酸凝胶并被置于中性缓冲溶液中，吸水后恢复溶解状态，从而成为非交联透明质酸溶液团，并被包裹在所述二硫键交联透明质酸凝胶中。
2.根据权利要求1所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述非交联透明质酸溶液团的粒径不大于5000μm。
3.根据权利要求1所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述非交联透明质酸溶液团的粒径为50~2000μm。
4.根据权利要求1所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述非交联透明质酸溶液团的分子量为100KDa~2500KDa。
5.根据权利要求1所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述非交联透明质酸溶液团的分子量为1000KDa~2200KDa。
6.根据权利要求1所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述二硫键交联透明质酸凝胶由透明质酸巯基化衍生物制备而成。
7.根据权利要求6所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述透明质酸巯基化衍生物的巯基含量为5~250μmol/g聚合物。
8.根据权利要求7所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，其特征在于，所述透明质酸巯基化衍生物的巯基含量为20~125μmol/g聚合物。
9.一种包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，所述包裹性透明质酸凝胶组合物为权利要求1-8中任一项所述的包裹性透明质酸凝胶组合物，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1、将透明质酸巯基化衍生物溶于缓冲溶液，加入非交联透明质酸固体颗粒，均匀混合，调节pH，经氧化过程形成二硫键交联透明质酸凝胶，所述二硫键交联透明质酸凝胶的含量大于10 mg/mL 且小于50mg/mL；
步骤2、将步骤1得到的二硫键交联透明质酸凝胶置于中性缓冲溶液中浸泡，过滤后得到包裹性透明质酸凝胶组合物；
其中，步骤2中，所述二硫键交联透明质酸凝胶中的非交联透明质酸固体颗粒因吸水恢复溶解状态，成为透明质酸溶液团，并被包裹在二硫键交联透明质酸凝胶中。
10.根据权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述非交联透明质酸固体颗粒为透明质酸水性溶液经由溶剂沉淀和粉碎筛分制得。
11.根据权利要求10所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，所述透明质酸水性溶液为氯化钠、氯化钾或氯化镁中的一种，所述透明质酸水性溶液的浓度为1%~10%。
12.根据权利要求11所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，所述透明质酸水性溶液的浓度为2%~4%。
13.根据权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述非交联透明质酸固体颗粒溶胀度不超过20%，所述非交联透明质酸固体颗粒加至缓冲溶液中后，所述非交联透明质酸固体颗粒至少30分钟保持吸水溶胀但不溶解。
14.根据权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述浸泡的时间不超过4天。
15.根据权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述缓冲溶液的pH值为7~10。
16.根据权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述缓冲溶液的pH值为8~9。
17.根据权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述氧化过程是指在有氧环境下进行作用，所述有氧环境的氧气来源为搅拌过程中接触空气中的氧气或水溶液中的溶解氧和/或外部通入的纯氧气。
18.一种包裹性透明质酸凝胶组合物在医学中的应用，其特征在于，所述包裹性透明质酸凝胶组合物采用如权利要求9所述的包裹性透明质酸凝胶组合物的制备方法制备而成。
19.根据权利要求18所述的包裹性透明质酸凝胶组合物在医学中的应用，其特征在于，所述包裹性透明质酸凝胶组合物经灌装或粉碎处理后，进行灭菌，制成最终产品；
其中，所述粉碎处理是指将包裹性透明质酸凝胶组合物粉碎成透明质酸凝胶颗粒后再灌装至容器中，经灭菌后得最终产品，所述透明质酸凝胶颗粒的粒径大于非交联透明质酸固体颗粒的粒径。
20.根据权利要求19所述的包裹性透明质酸凝胶组合物在医学中的应用，其特征在于，所述最终产品在医学中的应用包括宫腔、盆腹腔和五官科的术后组织粘连预防、骨性关节炎增粘治疗、软组织填充与增强和水光注射。
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