KR20200036664A

KR20200036664A - 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20200036664A
Application number: KR1020180116587A
Authority: KR
Inventors: 기창석; 류주연
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-04-07

Abstract

히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 필러, 특히 진피 필러, 의료용 생체재료, 화장료 등의 하이드로젤 소재 분야에 다양하게 응용될 수 있다. 또한, 상기 제조 방법에 의하면, 히알루론산 및 실크 피브로인의 복합화를 통하여 하이드로젤의 물성을 조절할 수 있고, 가교 밀도를 증가시켜 지속성을 개선시킬 수 있고, 물성 및 생체안전성이 우수한 실크 피브로인 하이드로젤을 제조할 수 있다.

Description

히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤 및 이의 제조 방법 {Hyaluronic acid-silk fibroin hybrid hydrogels, and preparation method thereof}

히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

필러는 조직의 부피를 증가시키는 생체재료로서, 다양한 성상의 필러 소재가 있으나 최근에는 주사가 용이한 하이드로젤 형태의 필러가 주로 이용되고 있다. 필러는 다양한 목적으로 이용될 수 있는데 진피 조직에 주사하여 진피의 부피를 일시적으로 증가시키는 진피 필러가 미용 목적의 시술에 널리 이용되고 있다. 이외에도 필러는 줄기세포를 체내 조직에 전달하기 위한 목적이나 손상된 조직의 재생을 돕는 치유 목적의 의료 행위에도 사용된다.

하이드로젤 중 히알루론산 하이드로젤은 생체적합성이 매우 우수하나 체내에서 빠르게 분해되어, 필러의 사용에 따른 부피 증가 효과를 3 내지 6개월 내에 상실하게 된다. 또한, 히알루론산 하이드로젤에 세포 부착이 어려워 조직의 재생 또는 신생 효과를 기대하기 어렵다. 히알루론산 하이드로젤은 거의 모든 경우 화학적 가교법에 의해 제조된다. 화학적 가교법에 의해 가교된 히알루론산 하이드로젤은 하이드로젤의 굳기가 증가할수록 주사성(injectability)가 급격히 저하되는 특성을 보여 가교밀도 변화에 의한 물성 변화의 폭이 매우 좁다.

실크 피브로인은 곤충 유래 단백질로써 생체적합성이 매우 우수하며 세포의 부착 및 증식을 촉진하므로, 조직의 재생에 매우 적합한 생체재료로 알려져 있다. 순수한 실크 피브로인만을 이용해서도 물리적인 가교 형성에 의해 하이드로젤을 제조하는 것이 가능하고, 하이드로젤 제조 공정의 용이성과 하이드로젤의 물성 개량을 위해 실크 피브로인 유도체를 합성하여 하이드로젤 제조에 이용할 수 있다.

따라서, 실크 피브로인을 이용하여 히알루론산 하이드로젤의 지속성을 개선하고, 가교 밀도를 조절하여 하이드로젤의 물성을 변화시킬 필요가 있다.

일 양상은 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제공한다.

다른 양상은 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공한다.

일 양상은 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체 및 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 광가교에 의하여 연결한 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제공한다.

용어 "히알루론산 (hyaluronic acid)"은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 분자량이 약 100 kDa 내지 약 13,000 kDa에 이르는 무색 투명한 고점도의 선형 다당류이며, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등 다양한 생물종과 조직으로부터 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 중성 가용화법, 효소 가용화법 등으로 추출 및 정제하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 히알루론산과 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 히알루론산의 염은 예를 들어, 소듐 히알루로네이트, 포타슘 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 코발트 히알루로네이트, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 히알루론산은 초음파처리되어 저분자화될 수 있다. 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체는 상기 히알루론산 및 메타크릴레이트기를 함유하는 단량체와 반응시켜 얻은 생성물일 수 있다. 상기 메타크릴레이트기를 함유하는 단량체는 이소시아나토에틸 메타크릴레이트(isocyanatoethyl methacrylate: IEM), 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl methacrylate), 메타크릴무수물(methacrylic anhydride) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어, "실크 피브로인(silk fibroin)" 또는 "피브로인(fibroin)"는 누에(Bombyx mori)로 대표되는 견사충의 유충 견사샘에서 합성하는 섬유단백질일 수 있다. 고치의 단백질 성분은 피브로인 약 70% 내지 약 80%, 당단백질인 세리신 약 20% 내지 약 30%로 구성되어 있다. 견사는 2 가닥의 피브로인이 평행하게 배열하며, 이것을 세리신이 피복하고 있다.

상기 실크 피브로인은 누에고치로부터 실크 세리신을 제거한 것일 수 있고, 정련제 용액을 사용하여 정련 공정에 의하여 정련된 것일 수 있고, 가수분해 단계를 거쳐 저분자화된 것일 수 있다. 상기 가수분해는 알칼리 가수분해일 수 있다.

상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체는 상기 실크 피브로인에 메타크릴레이트기를 함유하는 단량체와 반응시켜 얻은 생성물일 수 있다. 상기 메타크릴레이트기를 함유하는 단량체는 이소시아나토에틸 메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 메타크릴무수물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "광가교"는 중합체 네트워크 내의 가교결합이 광 조사의 결과로 형성된 것을 의미한다. 상기 광가교는 광가교법에 의하여 형성된 것일 수 있다. 상기 광가교법은 화학적 가교법의 일종으로써 가교도의 조절이 광의 파장, 광도, 조사 시간 등 광조사 조건에 따라 매우 정밀하게 조절될 수 있다. 상기 광은 가시광선 또는 자외선일 수 있다.

용어, "하이드로젤(hydrogel)"은 분산매가 물 또는 수성 용매거나 물 또는 수성 용매가 기본 성분으로 들어 있는 젤리 모양의 물질을 의미한다. 하이드로젤은 친수성 고분자를 화학 또는 물리적으로 가교하여 네트워크 구조를 구축하여 제조될 수 있다.

상기 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 에탄올을 처리하여 이중 네트워크 구조를 형성한 것일 수 있다. 상기 에탄올은 추가적인 물리적 가교를 형성하기 위한 것으로 이중 네트워크 구조는 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤에 추가적으로 물리적 가교를 형성한 것일 수 있다.

상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체는 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체 약 1 중량부를 기준으로 약 0.8 중량부 내지 약 17 중량부 함유된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체는 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체 약 1 중량부를 기준으로 약 1 중량부 내지 약 15 중량부, 약 3 중량부 내지 약 12 중량부, 약 5 중량부 내지 약 8 중량부 함유된 것일 수 있다.

상기 하이드로젤은 전단저장탄성률 (average shear storage modulus)이 약 50 Pa 내지 약 3000 Pa, 약 100 Pa 내지 약 3000 Pa, 약 100 Pa 내지 약 2900 Pa, 약 150 Pa 내지 약 2800 Pa, 약 200 Pa 내지 약 2700 Pa, 약 300 Pa 내지 약 2500 Pa일 수 있다. 따라서, 상기 하이드로젤은 필러(filler), 구체적으로 진피 필러(dermal filler)의 용도로 사용할 수 있는 물성 범위를 가질 수 있다.

상기 하이드로젤은 건조중량에 대한 습윤중량의 비율인 무게팽윤도 (mass swelling ratio)가 약 1 내지 약 150, 약 2 내지 약 125, 약 3 내지 약 100, 약 4 내지 약 90, 약 5 내지 약 80일 수 있다.

다른 양상은 히알루론산에 메타크릴레이트기를 도입하여, 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체를 제조하는 단계;

실크 피브로인에 메타크릴레이트기를 도입하여, 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 제조하는 단계; 및

상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체, 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체, 및 광개시제를 포함하는 용액에 광을 조사하여 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 단계;를 포함하는, 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체를 제조하는 단계 전에, 히알루론산을 초음파처리하여 저분자화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 초음파처리 시간을 조절하여 히알루론산의 수평균분자량을 조절할 수 있다. 따라서, 상기 초음파처리 단계를 수행하여 하일루론산을 저분자화 할 수 있다.

구체적으로, 상기 초음파처리는 약 5분 내지 약 60분, 약 10분 내지 약 55분, 약 15분 내지 약 50분, 약 20분 내지 약 45분, 약 25분 내지 약 40분, 예를 들어, 약 30분 동안 수행할 수 있다. 초음파처리 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우 초음파처리된 히알루론산의 수평균분자량이 지나치게 크거나 작아 재료의 구조안정성이 저하될 수 있다. 또한, 초음파처리 시간이 지나치게 길 경우 히알루론산의 특성을 잃을 수 있다.

상기 초음파처리시키는 단계 후에, 저분자화된 히알루론산을 투석하여 불순물 등을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 저분자화된 히알루론산은 수평균분자량 약 100 내지 약 500 kDa, 약 120 내지 약 400 kDa, 약 150 내지 약 350 kDa, 약 200 내지 약 300 kDa일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 수평균분자량을 갖는 히알루론산을 사용할 경우, 히알루론산의 고유의 성질을 잃거나 고점성으로 인해 후속 공정에 어려움이 있을 수 있다.

상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체를 제조하는 단계는 상기 저분자화된 히알루론산을 메타크릴무수물과 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 메타크릴무수물은 저분자화된 히알루론산 약 1 g당 약 1.0 mL 내지 약 15 mL, 약 2.0 mL 내지 약 10.0 mL, 약 3.0 mL 내지 약 8.0 mL, 약 4.0 mL 내지 약 6.0 mL, 약 4.6 mL 내지 약 5.0 mL일 수 있다. 상기 메타크릴무수물의 양이 많은 경우 소수성이 높아져 합성 후 물에 대한 용해성이 낮아질 수 있다. 상기 메타크릴무수물의 양이 적은 경우 히알루론산에 고정화된 메타크릴레이트기의 양이 적어 광중합에 의해 젤을 형성하기에 충분하지 않아 젤을 제조하지 못할 수 있다.

상기 반응은 약 1.0℃ 내지 약 9.0℃, 약 2.0℃ 내지 약 7.0℃, 약 3.0℃ 내지 약 5.0℃, 약 3.3℃ 내지 약 4.7℃, 약 3.5℃ 내지 약 4.5℃, 약 3.7℃ 내지 약 4.3℃, 약 3.9℃ 내지 약 4.1℃. 약 7.3 pH 내지 약 11.0 pH, 약 7.5 pH 내지 약 10.0 pH, 약 8.0 pH 내지 약 9.0 pH 조건에서, 약 12 시간 내지 약 38 시간, 약 15 시간 내지 약 34 시간, 약 16 시간 내지 약 32 시간, 약 18 시간 내지 약 30 시간, 약 20 시간 내지 약 28 시간, 약 22 시간 내지 약 26 시간 동안 수행할 수 있다.

상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 제조하는 단계 전에, 상기 실크 피브로인을 가수분해시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 가수분해시키는 단계 전에, 누에고치로부터 실크 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 실크 피브로인을 얻는 단계는 정련제 용액을 사용하여 세리신과 기타 불순물을 제거하는 정련 공정에 의해 수행될 수 있다. 상기 정련 공정은 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 탄산나트륨 및 올레산나트륨을 물에 첨가한 혼합용액에 누에고치를 넣은 후 가열하여 세리신을 제거할 수 있다.

상기 실크 피브로인을 가수분해시키는 단계는 실크 피브로인을 용해시킬 수 있는 용매에 알칼리성 용액을 첨가하고, 실크 피브로인을 첨가하여 알칼리 가수분해를 시키는 단계일 수 있다.

상기 실크 피브로인을 용해시킬 수 있는 용매는, 그 종류를 제한하지 않으나, 예를 들어 브롬화리튬(LiBr) 용액, 염화칼슘(CaCl₂) 용액, 티오시안산리튬(LiSCN) 용액, 요소 용액, 헥사플로로이소프로판올(hexafluoroisopropanol) 용액, 헥사플로로아세톤(hexafluoroacetone) 용액 등을 사용할 수 있다.

상기 실크 피브로인을 용해시킬 수 있는 용매로서 브롬화리튬 용액을 사용하는 경우, 브롬화리튬의 농도는 약 5 M 내지 약 15 M, 약 6 M 내지 약 14 M, 약 7 M 내지 약 13 M, 약 8 M 내지 약 12 M, 약 9 M 내지 약 11 M, 약 9 M 내지 약 10 M, 약 9 M 내지 약 9.5 M일 수 있다. 브롬화리튬의 농도가 약 9 M 내지 약 9.5 M인 경우, 약 50 wt%의 농도일 수 있다. 브롬화리튬의 농도가 너무 높으면 염이 지나치게 많아서 비용 및 공정상 문제가 발생할 수 있고, 브롬화리튬의 농도가 너무 낮으면 실크 피브로인의 용해성에 문제가 발생할 수 있다.

상기 실크 피브로인을 용해시킬 수 있는 용매의 양은 실크 피브로인 약 1 g당 약 3 mL 내지 약 15 mL, 약 4 mL 내지 약 13 mL, 약 4 mL 내지 약 10 mL, 약 4 mL 내지 약 7 mL, 약 4 mL 내지 약 6 mL, 약 4.5 mL 내지 약 5.5 mL일 수 있다. 용매의 양이 너무 적으면 용액의 점도가 높아 수득률이 낮아지고, 투석 후 용액의 농도가 높아 용액 안정성이 상대적으로 낮아질 수 있다. 용매의 양이 너무 많아 용액의 농도가 낮아지면 시약 및 투석막의 사용량이 많아져 고가의 비용이 든다는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 알칼리성 용액은 수산화나트륨(NaOH) 수용액, 암모니아(NH₄OH) 수용액, 또는 수산화칼륨(KOH) 수용액일 수 있다. 상기 알칼리성 용액은 pH 8 내지 13.5, pH 9 내지 13일 수 있다.

상기 실크 피브로인을 가수분해시키는 단계는 약 60℃ 내지 약 100℃, 약 70℃ 내지 약 90℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 77℃ 내지 약 83℃, 약 79℃ 내지 약 81℃ 조건에서 수행할 수 있다.

상기 가수분해(hydrolysis) 시간을 조절하여 가수분해된 실크 피브로인의 수평균분자량을 조절할 수 있다. 따라서, 상기 가수분해 단계를 수행하여 실크 피브로인을 저분자화 할 수 있다.

구체적으로, 상기 가수분해는 약 2 시간 내지 약 15 시간, 약 2.5 시간 내지 약 14.5 시간, 약 2.5 시간 내지 약 14 시간, 약 2.5 시간 내지 약 13.5 시간, 약 2.5 시간 내지 약 13 시간, 약 2.5 시간 내지 약 12.5 시간, 약 2.8 시간 내지 약 12.2 시간, 예를 들어 약 3 시간 내지 약 12 시간 동안 수행할 수 있다. 가수분해 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우 가수분해된 실크 피브로인의 수평균분자량이 지나치게 크거나 작아 안정성이 저하될 수 있다. 또한, 가수분해 시간이 지나치게 길 경우 실크 피브로인이 실크의 특성을 잃을 수 있다.

상기 가수분해된 실크 피브로인은 수평균분자량 20 내지 120 kDa, 20 내지 110 kDa, 20 내지 105 kDa, 23 내지 102 kDa, 24 내지 101 kDa, 25 내지 100 kDa일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 수평균분자량을 갖는 실크 피브로인을 사용할 경우, 장기 보관이 어렵거나 후속 공정에서 응고 현상이 발생하는 등 안정성이 저하될 수 있다.

상기 가수분해시키는 단계 후에, 가수분해된 실크 피브로인을 투석하여 불순물 등을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

실크 피브로인은 고농도의 염용액에 일시적으로 용해되더라도 쉽게 응고되는 특성이 있어 다양한 부가 공정을 적용하기에 부적합하며, 이에 따라 광중합을 위한 유도체 합성에도 쉽게 적용될 수 없다는 한계점이 있다. 그러나, 상기 알칼리 가수분해에 의한 분자량 저하법을 적용할 경우, 실크 피브로인 용액을 안정화하여 장기 보관이 가능하고 후속 공정에서 응고 현상을 방지할 뿐만 아니라 재건조된 실크 피브로인이 다시 쉽게 재용해될 수 있다. 따라서, 상기 가수분해시키는 단계를 수행하여 안정성이 우수하며 재용해가 가능한 실크 피브로인을 제조할 수 있다.

상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 제조하는 단계는 상기 가수분해된 실크 피브로인에 이소시아나토에틸 메타크릴레이트(isocyanatoethyl methacrylate)를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 반응은 유기용매 중에서 이루어질 수 있다. 상기 유기용매는 상기 가수분해된 실크 피브로인 약 1 g당 약 5 mL 내지 약 25 mL, 약 8 mL 내지 약 22 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 11 mL 내지 약 19 mL, 약 12 mL 내지 약 18 mL, 약 14 mL 내지 약 16 mL일 수 있다. 용매의 양이 너무 적으면, 반응 중 침전, 응고 등의 문제가 발생할 수 있고, 투석 이후 합성된 용액의 농도가 높아 실크 용액의 안정성을 낮출 수 있다. 용매의 양이 너무 많으면, 수득률이 낮아져 반응 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.

상기 유기용매는 가수분해된 실크 피브로인을 용해시킬 수 있는 유기용매라면 그 종류를 제한하지 않으나, 예를 들어 염화리튬(lithium chloride)이 용해된 DMSO(dimethyl sulfoxide)을 사용할 수 있다.

상기 이소시아나토에틸 메타크릴레이트는 상기 가수분해된 실크 피브로인1g당 약 0.5 mmol 내지 약 2.0 mmol, 약 0.6 mmol 내지 약 1.8 mmol, 약 0.7 mmol 내지 약 1.6 mmol, 약 0.8 mmol 내지 약 1.4 mmol, 약 0.9 mmol 내지 약 1.2 mmol, 약 1.0 mmol의 양을 반응시킬 수 있다. 상기 이소시아나토에틸 메타크릴레이트의 양이 많은 경우 소수성이 높아져 실크 피브로인에 많이 붙게 되어 합성 후 물에 대한 용해성이 낮아질 수 있다. 상기 이소시아나토에틸 메타크릴레이트의 양이 적은 경우 실크 피브로인에 고정화된 메타크릴레이트기의 양이 적어 광중합에 의해 젤을 형성하기에 충분하지 않아 젤을 제조하지 못할 수 있다.

상기 반응은 약 50℃ 내지 약 100℃, 약 50℃ 내지 약 90℃, 약 50℃ 내지 약 80℃, 약 55℃ 내지 약 75℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 55℃ 내지 약 65℃, 약 58℃ 내지 약 62℃에서 수행할 수 있다. 반응 온도가 상기 범위를 벗어나는 경우, 반응 효율이 저하되거나 단백질의 구조가 변성되는 등의 문제가 발생할 수 있다.

상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 방법은 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체, 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체, 및 광개시제를 포함하는 용액에 광을 조사하여 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함한다.

상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 단계 전에, 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체, 및 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 동결건조할 경우, 용액상태로 보관하는 것에 비해 장기적인 보관이 가능하며, 이를 질소가 충전된 용기에 보관할 경우 광중합의 반응성을 보존하는 데 효과적일 수 있다. 이때, 용액상태로 보관할 경우 장기간 보관 시 석출되거나 침전될 가능성이 있다.

상기 용액은 수성 용매, 예를 들어, 인산완충생리식염수(Phosphate Buffer Saline: PBS), 물, 트리스완충식염수(Tris Buffered Saline: TBS), 또는 초산완충용액을 포함할 수 있다.

상기 용액에서 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체의 농도는 약 0.1 중량% 내지 2.0 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 1.6 중량%, 약 0.3 중량% 내지 약 1.3 중량%, 약 0.4 중량% 내지 약 1.0 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 0.7 중량%일 수 있다. 상기 용액에서 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체의 농도는 약 1 중량% 내지 30 중량%, 약 2 중량% 내지 약 25 중량%, 약 4 중량% 내지 약 20 중량%, 약 5 중량% 내지 약 15 중량%, 약 8 중량% 내지 약 12 중량%일 수 있다. 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체와 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체의 부피비는 약 100:0, 약 99.99:0.01, 약 99.9:0.1, 약 99:1, 약 95:5, 약 90:10, 약 80:20, 약 70:30, 약 60:40, 약 50:50일 수 있다.

용어, "광개시제(photoinitiator)"는 수지에 첨가 되어, 자외선 에너지를 흡수하여 중합(polymerization) 반응을 시작하게 하는 물질을 의미하며, 모노머, 올리고머, 자유기가 광중합하는데 필요한 에너지를 가하면 광중합을 개시시켜 이 물질들이 경화된 후 고분자 물질로 바뀔 수 있도록 한다.

상기 광개시제는 당업자에게 공지된 것을 사용할 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않으나, 예를 들어, 리튬 아릴포스피네이트(lithium arylphoshinate: LAP), 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone), 벤질디메틸케탈(benzyldimethylketal), 에틸벤조인에테르(ethylbenzoin ether), 이소프로필벤조인에테르(isopropylbenzoin ether), 2,2-디에톡시아세토페논(2,2-diethoxyacetophenone), 2-히드록시-2-메틸-1-페닐프로판-1-온(2-hydroxy-2-methyl-1-phenylpropan-1-one), 1-히드록시시클로헥실페닐케톤(1-hydroxycyclohexylphenylketone), 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone), 벤질벤조에이트(benzylbenzoate), 에오신와이(eosin Y), 리보플라빈(riboflavin), 로즈벵갈(rose bengal), 또는 벤조일이소부틸에테르(benzoylisobutyl ether)를 사용할 수 있다.

상기 용액에서 상기 광개시제의 농도는 약 0.3 mM 내지 약 2.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2.0 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.2 mM일 수 있다.

다양한 가교 방법 중 광가교법은 화학적 가교법의 일종으로써 가교도의 조절이 광의 파장, 광도, 조사 시간 등 광조사 조건에 따라 매우 정밀하게 조절할 수 있기 때문에, 하이드로젤의 물성 조절에 유리하다.

상기 광을 조사하는 단계에서, 상기 광은 가시광선 또는 자외선일 수 있다.상기 광은 약 200 nm 내지 약 800 nm, 200 nm 내지 약 600 nm, 200 nm 내지 약 400 nm, 300 nm 내지 약 400 nm, 320 nm 내지 약 380 nm, 350 nm 내지 약 370 nm의 파장, 예를 들어 LAP를 개시제로 이용할 경우 365 nm의 파장을 가질 수 있다. 최적의 파장 조건은 사용하는 광개시제의 종류에 따라 달라질 수 있다. 최적의 파장 조건에서는 상대적으로 짧은 시간 내에 젤화를 완료할 수 있다. 만약 최적 조건이 아닌 경우라도 개시제의 흡수 파장과 중첩이 된다면 광조사 시간을 증가시켜 젤화를 완료할 수 있다.

상기 광을 조사하는 단계에서, 상기 광은 약 1 mW/cm^-2내지 약 100 mW/cm^-2, 약 1 mW/cm^-2내지 약 50 mW/cm^-2, 약 1 mW/cm^-2내지 약 30 mW/cm^-2, 약 1 mW/cm^-2내지 약 20 mW/cm^-2, 약 1 mW/cm^-2내지 약 10 mW/cm^-2, 약 3 mW/cm^-2내지 약 7 mW/cm^-2, 약 4 mW/cm^-2내지 약 6 mW/cm^-2의 광도 조건, 예를 들어 약 5 mW/cm^-2의 광도를 가질 수 있다. 광도가 강할수록 젤화가 완료되는 시간이 짧아질 수 있다. 광도가 낮은 경우, 조사 시간이 충분하지 않으면 가교반응이 불완전하게 되어 하이드로젤의 강도가 상대적으로 낮아질 수 있다. 따라서, 조사시간을 고정한 경우 광도를 조절하여 가교 밀도를 달리함으로써 하이드로젤의 강도를 조절할 수 있다.

상기 광을 조사하는 단계에서, 상기 조사는 약 30초 내지 약 10분, 약 1분 내지 약 10분, 약 1분 내지 약 9분, 약 1분 내지 약 8분, 약 1분 내지 약 7분, 약 1분 내지 약 6분, 예를 들어5분 동안 이루어질 수 있다. 조사 광의 파장 및 광도가 고정된 경우, 조사 시간을 조절하여 하이드로젤의 강도를 조절할 수 있다. 예를 들어, 젤화가 완전히 완료되기 전에 광조사를 중단하면 상대적으로 낮은 강도의 실크 하이드로젤을 제조할 수 있다. 반대로 광조사 시간을 늘리는 경우, 완전히 젤화가 일어난 후에는 더 이상 하이드로젤의 강도가 증가되지 않고 건조가 일어날 수 있기 때문에, 상기 조건을 벗어나는 오랜 시간의 광조사는 적합하지 않을 수 있다.

상기 광가교법을 사용하는 경우, 다른 화학적 가교방법에 비해 독성 물질의 사용이 적기 때문에 생체재료로 사용되는 하이드로젤 제조에 더욱 적합할 수 있다. 따라서, 광가교 반응을 이용하여 물성 조절이 용이하고 생체안전성이 우수하고, 실크 피브로인 및 히알루론산의 장점을 모두 가진 하이드로젤을 제조할 수 있다.

상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 방법은 상기 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤에 에탄올을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 에탄올의 처리는 약 1 시간 내지 약 10 시간, 약 1.2 시간 내지 약 8 시간, 약 1.5 시간 내지 약 6 시간, 약 1.2 시간 내지 약 4 시간, 예를 들어, 약 2시간 동안 이루어질 수 있다.

상기 에탄올을 처리하는 단계 전에, 상기 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 수성 용매에 불리는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 예를 들어, 인산완충생리식염수, 물, 트리스완충식염수, 또는 초산완충용액일 수 있다. 상기 불리는 시간은 약 30 분 내지 약 10 시간, 약 1시간 내지 약 8 시간, 약 2시간 내지 약 6 시간, 약 3 시간 내지 약 4 시간 동안 이루어질 수 있다.

상기 에탄올을 처리하는 단계를 통하여 추가적인 물리적 가교를 유도하여 상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤이 이중 네트워크 구조를 형성하도록 할 수 있다. 또한, 상기 에탄올을 처리하는 단계 후, 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 베타-시트(β-sheet) 구조의 실크 피브로인 단백질 구조를 가질 수 있다. 상기 에탄올을 처리하는 단계를 통하여 무게팽윤도가 낮은 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조할 수 있다.

상기 베타-시트 형태는 베타 구조(β-structure), 플레이트 시트 구조(pleated sheet structure)라고도 불리는 단백질 또는 폴리펩티드 사슬이 취하는 2차 구조의 하나로, 폴리펩티드 사슬 사이가 수소결합을 형성하는 형태일 수 있다. 상기 베타-시트 구조의 형성을 통하여 상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 가교 밀도를 증가시킬 수 있다.

다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제공한다.

상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 제조 과정에서 초음파처리 시간, 가수분해 시간, 메타크릴무수물 첨가량, IEM 첨가량, 실크피브로인의 함량, 광의 파장, 광도, 조사 시간 등의 광가교 조건, 에탄올 처리시간 등을 조절하여 가교 밀도 및 물성을 조절할 수 있다. 구체적으로, 상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 제조 과정에서 실크 피브로인의 부피비율을 증가시켜 세포 부착 효과를 증대시킬 수 있고, 생분해 속도를 늦출 수 있다.

상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 생체적합성이 요구되는 하이드로젤 소재 응용분야에 다양하게 응용될 수 있다. 구체적으로, 의료용 또는 위생용품과 관련된 생체재료 분야, 예를 들어, 창상피복, 약물전달, 경구용 제제, 조직배양 등에 활용될 수 있다.

또한, 상기 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 소재의 안정화, 보습, 및 피부, 및 두피 재생 효과 등을 활용하여 화장 조성물로도 응용될 수 있다.

일 양상에 따른 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 필러, 특히 진피 필러, 의료용 생체재료, 화장료 등의 하이드로젤 소재 분야에 다양하게 응용될 수 있다.

다른 양상에 따른 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 방법에 의하면, 히알루론산 및 실크 피브로인의 복합화를 통하여 하이드로젤의 물성을 조절할 수 있고, 가교 밀도를 증가시켜 지속성을 개선시킬 수 있고, 물성 및 생체안전성이 우수한 실크 피브로인 하이드로젤을 제조할 수 있다.

도 1은 히알루론산-메타아크릴레이트 및 실크 피브로인-메타아크릴레이트를 이용하여 광가교 복합 하이드로젤을 제조하는 방법을 나타낸다.
도 2는 히알루론산 용액의 전단 점도 (shear viscosity)의 변화를 초음파처리 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 3은 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 (HA-MA)의 합성 과정을 나타낸다.
도 4는 히알루론산 유도체에 메타크릴레이트기를 도입하기 전 및 후의 H¹ NMR 분광분석 결과를 나타낸다.
도 5는 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 (SF-MA)의 합성 과정을 나타낸다.
도 6은 실크 피브로인 유도체에 메타크릴레이트기를 도입하기 전 및 후의 H¹ NMR 분광분석 결과를 나타낸다.
도 7은 HA-MA 및 SF-MA의 부피비를 달리한 후, 광가교에 의해 제조된 하이드로젤을 각각 에탄올 처리 또는 미처리하여 찍은 사진이다.
도 8은 HA-MA 및 SF-MA의 부피비를 달리한 광가교에 의해 제조된 하이드로젤에서 FTIR 스펙트럼 결과로, 실크 피브로인의 이차구조변화를 나타낸다.
도 9는 각 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 전단저장탄성률을 나타낸다.
도 10은 각 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 팽윤도를 나타낸다.
도 11은 각 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 농도별 세포독성을 나타낸다.
도 12는 에탄올을 처리하지 않은 각 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 주사전자현미경을 통하여 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 13은 에탄올을 처리한 각 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 주사전자현미경을 통하여 관찰한 이미지를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 히알루론산의 저분자화

소듐 히알루론산염(Soduim hyaluronate)을10 mg/mL 농도로 초순수 (ultrapure water)에 용해한 후25 mL의 히알루론산 용액을 50 mL 코니칼 튜브에 옮겨 초음파파쇄기(VCX-130, SONICS)로 초음파처리하였다. 초음파처리 시간은 도2에 나타낸 바와 같이 전단점도의 변화를 측정하여 결정하며, 본 실시예에서는 초음파를 30분간 처리하여 저분자화를 실시하였다.

저분자화된 용액은 분획분자량 (molecular weight cut-off: MWCO)이 12,000 내지 14,000 Da인 셀룰로오스 아세테이트 투석막에 담아3일간 흐르는 증류수에서 투석한 후 동결건조하였다. 상기 과정에 의하여 분자량 14,000 Da이하의 히알루론산 (HA)을 수득하였으며, 실제 GPC 측정 결과 수평균분자량은 약 242 kDa였다.

실시예 2. 실크 피브로인의 정련과 가수분해

0.3 %(w/v)의 올레산 나트륨과 0.2 %(w/v)의 탄산나트륨 무수물을 혼합한 용액에 완전 건조된 누에고치(Bombyx mori silk cocoon)을 넣고 1시간 동안 100℃로 가열하였다. 열이 고루 전달되도록 10 내지 15분 간격으로 플라스크를 흔드는 방식으로 내용물을 혼합하고, 약 1시간이 경과한 후 서로 얽힌 실크 덩어리를 꺼내 표면을 고루 문질러 세리신을 제거하였다. 상기 정련을 마친 실크는 건조 오븐을 사용하여 건조한 후, 실크 피브로인 (SF)을 수득하였다.

80℃를 유지하는 9.3 M의 브롬화리튬 수화물 용액에 SF 용액의 1/5에 해당하는 부피의 0.6 M의 수산화나트륨 수용액을 첨가한 후, 상기 건조한 SF를 넣어 알칼리 가수분해를 시작하였다. 가수분해 시간은 젤 투과 크로마토그래피 (gel permeation chromatography: GPC)를 통해 분자량의 변화를 측정하여 결정하였으며, 본 실시 예에서는 12시간 진행하였다. 가수분해된 용액은 분획분자량이 12,000 내지 14,000 Da인 셀룰로오스 아세테이트 투석막에 담아 3일간 실온에서 투석한 후 동결건조하였다. 상기 과정에 의하여 분자량 14,000 Da이하의 실크피브로인을 수득하였으며, 실제 HPLC 측정 결과, 가수분해된 실크 피브로인 용액의 분자량은 약 42 kDa 였다.

실시예 3. 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산(HA-MA) 제조

초음파처리된 히알루론산을 10 mg/mL 농도로 초순수에 용해하였다. 히알루론산 1 g 당 4.8 mL의 메타크릴무수물(methacrylic anhydride)를 천천히 떨어뜨려 히알루론산에 메타크릴기를 도입하는 합성 반응을 4℃에서 하루 동안 진행하였다. 빛을 차단한 조건에서 실험을 진행하고, 반응이 진행되는 동안 수산화나트륨을 이용하여 혼합물의 pH를 8 내지 9로 조정하였다.

상기 반응이 종료된 후, 저온에서 반응 용액을 에탄올에 침전시키고, 침전된 용액을 초고속 원심분리기를 이용하여 4℃, 8000 rpm 조건에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 용액의 상등액은 제거하고, 건조 오븐을 이용하여 남은 에탄올을 모두 증발시켰다. 건조된 침전물을 다시 초순수에 녹여 3일간 투석 후 용액을 동결건조하였다. 히알루론산 유도체에 메타크릴레이트기를 도입하기 전 및 후의 H¹ NMR 분광분석 결과는 도 4와 같다. 도4에 나타낸 바와 같이, 히알루론산 유도체에 메타크릴레이트기가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다.

실시예 4. 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인(SF-MA) 제조

DMSO(dimethyl sulfoxide) 28.3 mL에 1.7 g의 염화리튬을 투입 후 60℃에서 용해하였다. 염화리튬이 완전히 용해되면 상기 실시예 2에서 수득한 SF 파우더 2 g을 투입하고, SF 잔부스러기가 보이지 않을 때까지 완전히 용해하였다. 용해된 SF 용액을 오일 배쓰로 옮겨 실크 용액이 60℃에 이를 때까지 안정화시킨 후 10분 정도 질소를 주입해주었다.

아이소시아노에틸 메타크릴레이트(isocyanoethyl methacrylate)를 SF 1 g 당 1 mmol의 비율로 준비하여, DMSO 10 mL에 희석한 후 천천히 떨어뜨려주었다. 이 때 지속적으로 질소를 주입해주었다. 상기 아이소시아노에틸 메타크릴레이트가 모두 투입되면, 고무 마개로 완전히 밀봉 후 빛을 차단하여 60℃에서 5시간 반응을 진행하였다. 반응을 종결하기 위해 전체 부피의 9배에 해당하는 초순수를 첨가하여 셀룰로오스 투석막(MWCO:12-14 kDa)에 담아 3일간 초순수에 투석 후, 초고속 원심분리기를 이용해 20℃, 15000 RCF 조건에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리한 용액을 여과하여 침전물을 제거한 후, 최종적으로 용액을 동결건조하여 스펀지 형태의 실크 피브로인-메타크릴레이트(SF-MA)를 수득하였다. 실크 피브로인 유도체에 메타크릴레이트기를 도입하기 전 및 후의 H¹ NMR 분광분석 결과는 도 6과 같다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 히알루론산 유도체에 메타크릴레이트기가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다.

실시예 5. 광가교 히알루론산/ 실크 피브로인 복합 하이드로젤 제조

메타크릴레이트기가 도입된 HA (HA-MA) 및 SF (SF-MA)를 각각 광개시제인 리튬 아릴포스피네이트 (lithium arylphosphinate: LAP)가 포함된 pH 7.4의 인산 완충 식염수 (phosphate buffer saline: PBS)에 용해하여 전구 용액을 제조하였다. 상기 HA-MA 및 SF-MA의 농도는 각각 0.6 중량% 및 10 중량%로, LAP의 농도는 1 mM로 고정하고, 고정된 농도의 두 전구 용액의 부피비를 하기와 같이 다르게 하여 5가지 종류의 전구용액을 준비하였다 (HA-MA 용액:SF-MA용액 = 100:0, 95:5, 90:10, 70:30, 및 50:50).

전구 용액에 5분간 자외선(365 nm, 5 mW/cm²)을 조사하여 히알루론산/실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하고, pH 7.4의 PBS에 하루간 불렸다. 에탄올 처리를 통해 이중 네트워크 구조를 형성하는 경우, 제조된 하이드로젤을 3~4시간 정도 pH 7.4의 PBS에 불린 후, 2시간 동안 에탄올에 담갔다. 이후 pH 7.4의 PBS를 이용해 하루 이상 세척하였다. 상기 과정에 따라 에탄올이 처리되거나 처리되지 않은 HA-MA 및 SF-MA의 부피비가 다른, 광가교에 의해 제조된 하이드로젤의 사진은 도 7과 같으며, FTIR 스펙트럼 결과는 도 8과 같다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리하지 않은 형태보다 에탄올을 처리한 형태의 하이드로젤이 상대적으로 불투명하며, 실크 피브로인의 비율이 높을 수록 투명도가 감소하였다. 이는 에탄올 처리에 의해 실크 피브로인의 물리적 가교가 형성된 것에 기인한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 실크가 함유된 하이드로젤의 경우 에탄올 처리전에는 랜덤코일 구조의 단백질 구조가 관찰되지만 에탄올 처리 후에는 베타구조가 형성된 것을 알 수 있었다.

실험예 6. 히알루론산- 실크 피브로인 복합 하이드로로젤의 유변학적 물성 평가

실시예 5의 과정을 통하여 제조된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 생검펀치를 이용하여 직경 8mm의 원형으로 잘랐다. 레오미터(HAAKE MARS III, Thermo scientific)를 이용해 진동 모드(oscillatory mode)에서 변형률 0.1 내지 5%, 진동수 1 Hz 조건에서 측정하였다. 이 때 직경 8 mm의 평행한 지오메트리를 이용하였고, 수직항력은 0.2 내지 0.3 N로 설정하였으며 시료의 평균 전단저장탄성률(average shear storage modulus) 값은 선형 점탄성 구간(Linear viscoelastic region, LVR)으로부터 도출하였다. 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 전단저장탄성률은 도 9와 같다. 도9에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리하지 않은 경우 실크 피브로인 함량에 따른 하이드로젤의 전단저장탄성율 변화는 크지 않았다. 반면 에탄올을 처리한 하이드로젤의 경우 실크 피브로인의 비율이 높을수록 전단저장탄성율이 증가하는 것을 알 수 있다. 에탄올 처리된 히드로젤의 경우 히알루론산 및 실크 피브로인의 부피비율이 50:50일 때, 전단저장탄성률이 가장 높음을 확인할 수 있었다.

추가로, 실시예 5의 과정을 통하여 제조된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 이용해 팽윤도를 측정하였다. 하이드로젤의 습윤 중량(Wswollen)을 측정한 뒤, 다시 증류수에서 24시간 침지시켜 미반응 물질과 PBS의 염을 제거하였다. 가교 반응에 참여한 부분의 건조 중량을 얻기 위해 하이드로젤을 충분히 진공 건조한 뒤 하이드로젤의 무게(Wdry)를 측정하였다. 측정한 습윤 중량(Wswollen)과 건조 중량(Wdry)을 이용하여, 하기 식과 같이 무게팽윤도(mass swelling ratio)를 계산하였다.

상기 식에 의해 계산된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 무게팽윤도은 도 10과 같다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리하지 않은 하이드로젤 보다 에탄올을 처리한 하이드로젤이 무게팽윤도가 낮았고, 실크 피브로인의 비율이 높을수록 무게팽윤도가 낮음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 히알루론산- 실크 피브로인 복합 하이드로젤의 세포독성 평가

실시예5의 과정에서 HA-MA 용액 대SF-MA용액의 부피비를 100:0, 90:10, 및0:100으로 하여 제조된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤의 세포독성 평가를 위해 웰(well) 당 5,000마리의 섬유아세포(NIH-3T3)를 하루 동안 10%의 소혈청을 함유하는 배지(Dulbecco's modified eagle's medium: DMEM)에 배양하였다. 그 후, 하이드로젤 용출물을 하루 동안 처리하여 하이드로젤의 용출물을 처리하지 않은 대조군 대비 상대적 세포 대사활성(relative cell metabolic activity)을 MTT assay를 통해 측정하였다. 이 때, 하이드로젤의 용출물은 하이드로젤에 하이드로젤 무게의 10배에 해당하는 양의 배지를 24시간 처리 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다. 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로로젤의 자체적인 세포독성을 평가하기 위해 용출물의 희석 배율을 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64배로 하여 희석 배율에 따른 세포독성을 평가하였다.

도11은 하이드로젤 용출물의 농도에 따른 섬유아세포의 상대적 세포 대사 활성(%)을 나타낸 그래프이다. 도11에 나타낸 바와 같이, 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤은 실크 피브로인의 부피비 및 에탄올의 처리유무와 관계 없이 세포독성 없이 안전하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

실험예3 . 히알루론산- 실크 피브로인 복합 하이드로젤의 형태

실시예 5의 과정을 통하여 제조한 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 증류수에 하루 동안 담궈 염을 제거하였다. 액체 질소로 젤을 얼린 후 면도칼로 언 젤을 잘라 단면을 드러낸 하이드로젤을 동결건조하였다. 상기 젤의 단면을 백금으로 코팅한 후 주사전자현미경(Field-Emission Scanning Electron Microscope), (SIGMA, Cari Zeiss)을 이용하여 도 12 및 도 13과 같이 이미지를 관찰하였다. 에탄올이 처리되지 않은 하이드로젤의 경우 실크 피브로인의 함량이 높아질수록 전체 고분자의 함량이 높아져 치밀한 공극 구조를 확인할 수 있었다. 에탄올 처리 후에는 베타쉬트 구조의 형성으로 인해 전체 네트워크 밀도가 증가하여 공극을 형성하는 벽의 두께가 증가한 것을 관찰할 수 있었다.

Claims

메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체 및 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 광가교에 의하여 연결한 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤.
청구항 1에 있어서, 상기 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤에 에탄올을 처리하여 이중 네트워크 구조를 형성한 하이드로젤.
청구항 1에 있어서, 상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체는 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체 1 중량부를 기준으로 0.8 중량부 내지 17 중량부 함유된 것인 하이드로젤.
청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 전단저장탄성률 (average shear storage modulus)이 100 내지 3000 Pa인 것인 하이드로젤.
청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 건조중량에 대한 습윤중량의 비율인 무게팽윤도 (mass swelling ratio)가 5 내지 80인 것인 하이드로젤.
히알루론산에 메타크릴레이트기를 도입하여, 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체를 제조하는 단계;
실크 피브로인에 메타크릴레이트기를 도입하여, 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 제조하는 단계; 및
상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체, 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체, 및 광개시제를 포함하는 용액에 광을 조사하여 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 단계;를 포함하는, 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤을 제조하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체를 제조하는 단계 전에, 히알루론산을 초음파처리하여 저분자화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 메타크릴레이트기가 도입된 히알루론산 유도체를 제조하는 단계는 상기 저분자화된 히알루론산을 메타크릴무수물과 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 반응시키는 단계는 pH 7.5 내지 10에서 수행되는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 제조하는 단계 전에, 실크 피브로인을 가수분해시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 가수분해시키는 단계 전에, 누에고치로부터 실크 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 얻는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 메타크릴레이트기가 도입된 실크 피브로인 유도체를 제조하는 단계는 상기 가수분해된 실크 피브로인에 이소시아나토에틸 메타크릴레이트(isocyanatoethyl methacrylate)를 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 광개시제는 리튬 아릴포스피네이트, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 벤질디메틸케탈, 에틸벤조인에테르, 이소프로필벤조인에테르, 2,2-디에톡시아세토페논, 2-히드록시-2-메틸-1-페닐프로판-1-온, 1-히드록시시클로헥실페닐케톤, 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 벤질벤조에이트, 에오신와이, 리보플라빈, 로즈벵갈, 또는 벤조일이소부틸에테르인 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 광은 가시광선, 또는 자외선인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 광은 200 내지 400 nm의 파장을 갖는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 광은 1 내지 100 mW/cm²의 광도를 갖는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 조사는 1 내지 10분 동안 이루어지는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 광가교된 히알루론산-실크 피브로인 복합 하이드로젤에 에탄올을 처리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 에탄올의 처리는 1 내지 10 시간 동안 이루어지는 것인 방법.