CN115260527B - 一种光固化丝素/透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种力学性能良好的紫外光固化丝素/透明质酸水凝胶及其制备方法。将巯基化改性的丝素蛋白和双键化改性的透明质酸均匀共混，添加光引发剂和还原剂，在紫外光的条件下，制备互穿网络水凝胶。水凝胶前驱体液经紫外光引发后可迅速固化成型，压缩强度达490kpa且能经受40％的形变压缩循环数十次。通过控制巯基化改性的丝素蛋白的含量可以调控水凝胶的力学性能。此外，该水凝胶具有良好的生物相容性，可以很好地支持细胞粘附及生长。该水凝胶原料为蚕茧和透明质酸，均为天然高分子，原料易得、价格低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种力学性能良好且降解性能可调的快速光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法
背景技术
水凝胶是一种高分子材料，其特点是水含量高，物理性质多样。它们可被设计成类似人体组织的细胞外环境，从而使它们能够在医疗植入物、生物传感器、药物输送设备和组织工程中使用。天然高分子材料由于其普遍的高生物相容性、生物降解性以及与哺乳动物细胞外基质(ECM)成分的相似性，多年来作为水凝胶材料引起了相当大的关注。
丝素蛋白(Silk fibroin,SF)是一种天然纤维聚合物，由于其生物相容性、生物降解性、优异的力学性能和优良的生物学特性，已被广泛应用于组织工程。例如用于药物缓释、骨组织工程、生物传感器、3D打印材料等。此外，透明质酸是一种低成本、高水结合能力、可生物降解的天然多糖。全生物来源、高力学性能水凝胶的快速成型是目前生物凝胶材料发展的趋势。然而不同的交联策略会影响水凝胶的性能，物理交联的水凝胶的主要限制之一是机械强度低、成型差且交联速度慢，限制了其在生物医学中的广泛应用。
目前，关于丝素蛋白和透明质酸的化学交联水凝胶有一定的文献记载，例如，透明质酸进行双键化改性，辅以小分子四巯基交联剂及引发剂。在紫外光条件下，该体系虽能快速光固化成型，但其力学性能很弱，且小分子巯基交联剂毒性较大，将对水凝胶的细胞毒性产生严重影响。丝素蛋白的双键化改性也在3D打印方面取得了广泛的应用，但是这种自由基聚合的光固化只能通过调节甲基丙烯酸程度来调控交联聚合物的机械性能，可控性较低，而且通常需要低氧环境来进行交联；丝素的二络氨酸键交联，可通过钌合物自由基聚合或酶促交联，但存在细胞毒性及交联时间过长的问题。此外，也有研究学者开发了一种由丝素蛋白和透明质酸与碳化二亚胺交联的水凝胶，虽可调控交联度但其凝胶化时间长达半个小时且压缩强度也较低。
发明内容
针对现有水凝胶存在的的交联度难调、固化时间慢、水凝胶小分子交联剂毒性大、力学性能差的缺陷，本发明提供一种力学性能良好且降解性能可调的快速光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，利用硫醇点击化学及双键自由基聚合制备了一种能够快速紫外光固化的具有高交联密度的互穿网络水凝胶。该水凝胶可通过调节丝素及透明质酸的比例调节降解性能，且两者改性后无毒无害，生物相容性极佳。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种光固化丝素/透明质酸水凝胶，所述光固化丝素/透明质酸水凝胶按如下方法制备：
将巯基化改性的丝素蛋白、水溶性强还原剂、双键化改性的透明质酸、水溶性的光引发剂放入水中混合均匀，得到水凝胶前驱体溶液，紫外光下固化(一般3～4min)，得到所述光固化丝素/透明质酸水凝胶；
在所述水凝胶前驱体溶液中，所述巯基化改性的丝素蛋白的浓度为3-30wt％(优选15wt％)，所述水溶性强还原剂的浓度为0.1-0.3wt％(优选0.15wt％)，所述双键化改性的透明质酸2-6wt％(优选5wt％)，所述水溶性的光引发剂的浓度为0.1-0.5wt％(优选0.5wt％，反应速度较快)。
实际操作中出于溶解更容易的原则，可以将巯基化改性的丝素蛋白溶于水溶性强还原剂的水溶液中，得到溶液A；将双键化改性的透明质酸溶于水溶性的光引发剂的水溶液中，得到溶液B；将所述溶液A与所述溶液B混合均匀。
进一步，所述水溶性强还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、氯化亚锡、硼氢化钾、硼氢化钠中的一种或两种以上的混合物(优选三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)。
进一步，所述水溶性的光引发剂为Irgacure 2959、光引发剂ITX、Omnirad水性引发剂、2-羟基-2,2’-二甲基苯乙酮中的一种或两种以上的混合物(优选Irgacure 2959)。
本发明的实施例中以三(2-羰基乙基)磷盐酸盐作为还原剂的还原反应在室温下15～20min完成，本领域人员应该知道，还原性越强，还原所需时间越短。
丝素上接的还原型谷胱甘肽两位点间极易氧化，两个巯基形成二硫键，加入水溶性强还原剂进行还原可以打开二硫键变成两个巯基位点，从而进行巯基-烯烃点击反应。
本发明还提供一种巯基化改性的丝素蛋白的制备方法，所述巯基化改性的丝素蛋白按如下方法制备：
以含0.05M氯化钠的pH6～6.5，0.1～0.2M的MES缓冲液为透析液调节丝素水溶液的pH,待pH稳定后，向所得含丝素的缓冲溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合溶液A，在室温下活化反应15～30min，加入还原型的谷胱甘肽，得到混合溶液B，室温下进行巯基化反应18～24h，所得反应液经后处理A，得到所述巯基化改性的丝素蛋白；
所述混合溶液A中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.2～0.4mol/L,所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.4～0.6mol/L；所述混合溶液B中，所述还原型的谷胱甘肽的浓度为0.18～0.2mol/L。
为了调节透析袋内液体的PH值，使其在后期反应过程中维持较为稳定的PH环境，使反应顺利进行，以MES缓冲液为透析液，因为其它符合pH值范围缓冲液中的某些离子可能会参与反应。而MES不存在额外的羧基和氨基，可以保证EDC体系最佳交联活性。
进一步，所述后处理A为：将所述反应液在纯水中3～4℃透析2～3天，冷冻干燥，即得所述巯基化改性的丝素蛋白。
所述丝素水溶液按本领域常规方法即可获得，浓度一般在1wt％～4wt％。如文献Zhang X,Bao H,Donley C,et al.Thiolation and characterization of regeneratedBombyx mori silk fibroin films with reduced glutathione[J].BMC chemistry,2019,13(1):1-9.此处不再赘述。
本发明还提供一种双键化改性的透明质酸的获得方法，所述双键化改性的透明质酸按如下方法制备：
将分子量为5000～150000的透明质酸溶于去离子水中，得到2～3wt％的透明质酸水溶液；加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，均匀分散后降温至3～4℃，缓慢滴加甲基丙烯酸酐(密度1.04g/mL)，滴毕，反应20～30min，(0.5～1mol/L氢氧化钠溶液)调节pH至8～9,反应20～24h,加入氯化钠进行破乳反应0.5～1h，所得反应液B经后处理B，得到所述双键化改性的透明质酸；
所述去离子水与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:0.6～0.8(优选1:0.64)，所述透明质酸、甲基丙烯酸酐与氯化钠的质量比为1:0.5～2：0.3～0.8(优选1:1.6:0.5)。
进一步，所述后处理B为：向所述反应液B中加入2.5～3倍所述反应液B体积的无水乙醇，得到白色絮状沉淀，离心，所得固体物用去离子水溶解后，于去离子水中透析2～3天，冷冻干燥，得所述双键化改性的透明质酸(HAMA，白色海绵状固体)。
进一步，所述的巯基化改性的丝素蛋白是一种水溶性蛋白。
所述的巯基化改性的丝素蛋白由丝素分子和还原型谷胱甘肽经过酰胺缩合反应制备所得。
所述步骤(3)中的互穿网络水凝胶，改性丝素和改性透明质酸在紫外光下经过硫醇点击化学及双键自由基聚合快速固化，得到力学性能良好的丝素/透明质酸水凝胶。
通过控制巯基化改性的丝素蛋白的含量可以调控水凝胶的力学性能。
所述的丝素/透明质酸水凝胶压缩强度达490kpa且能经受40％的形变压缩循环数十次。
所述的水凝胶具有良好的生物相容性，可生物降解，可以支持细胞粘附及生长。并且原料天然、简单易得、价格低廉。
本发明制备了力学性能良好的丝素/透明质酸水凝胶，对制备的水凝胶进行了流变试验和压缩试验。结果表明，水凝胶经紫外光引发后可迅速固化，压缩强度达490kpa且能经受40％的形变压缩循环数十次。通过控制巯基化改性的丝素蛋白的含量可以调控水凝胶的力学性能。此外，该水凝胶具有良好的生物相容性，可以很好地支持细胞粘附及生长。该水凝胶原料为蚕茧和透明质酸，均为天然高分子，原料易得、价格低廉。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1.该水凝胶原料天然无毒，可生物降解、生物相容性好、原料易得、成本低。
2.该水凝胶可以经紫外光快速固化成型、引发速度快。
3.该水凝胶可以通过调节巯基化改性丝素蛋白及双键化改性透明质酸两者之间的比例来调控交联度，获得高交联密度的互穿网络水凝胶，降解性能可调。
4.该水凝胶可以支持细胞的粘附及生长。
附图说明
图1是制备流程图。(a:丝素蛋白的巯基化改性(SF-GSH)的反应；b：透明质酸的双键化改性(HAMA)的反应；c：具有互穿网络的丝素/透明质酸水凝胶的制备)。
图2是不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶的扫描电镜SEM图(a：SF-5-H-10；b:SF-10-H-10；c:SF-15-H-10；d:SF-20-H-10)。
图3是不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶的流变性能表征图。
图4是不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶的压缩强度表征图。
图5是不同交联度水凝胶的在40％形变下的压缩循环性能图。
图6是不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶的体外降解图。
图7是不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶的细胞粘附情况图。
图8:不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶的细胞生长和分化图(a：SF-5-H-10；b:SF-10-H-10)。
图9：对比例的压缩强度表征图。
图10：对比例的细胞粘附情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：一种力学性能良好且降解性能可调的快速光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的Cacl2-C2H60-H2O(物质的量摩尔比为1:2:8)溶液中70℃加热搅拌4h。溶解后取出反应瓶冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将溶解的丝素盐溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。透析后的纯丝素水溶液连同透析袋浸没于2升PH值为6的MES缓冲液(即0.1M的2-吗啉乙磺酸水溶液，其中包含0.05M氯化钠)中，调节透析袋内的丝素溶液的PH值24h直至PH值稳定为6。待PH值稳定后，将透析袋中的调节完PH值的丝素水溶液倒入烧杯中并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.3mol/L)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.5mol/L)在室温下活化反应30min，再加入还原型的谷胱甘肽(0.18mol/L)室温反应18～24h，将与谷胱甘肽反应的丝素蛋白溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析2～3天，冷冻干燥得白色绵密固体，即巯基化改性的丝素蛋白(SF-GSH)。
(2)将分子量为10万的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.05g巯基化改性的丝素蛋白溶于0.5ml含有0.0015g还原剂三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的水溶液中15min；将步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于0.5ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中；将两者溶液混合均匀后，在紫外光(365nm)下固化4min，得到交联度为第一组的丝素/透明质酸水凝胶(第一组名称：S-5-H-5)。
实施例2：一种力学性能良好且降解性能可调的快速光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的Cacl2-C2H60-H2O(物质的量摩尔比为1:2:8)溶液中70℃加热搅拌4h。溶解后取出反应瓶冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将溶解的丝素盐溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。透析后的纯丝素水溶液连同透析袋浸没于2升PH值为6的MES缓冲液(即0.1M的2-吗啉乙磺酸水溶液，其中包含0.05M氯化钠)中，调节透析袋内的丝素溶液的PH值24h直至PH值稳定为6。待PH值稳定后，将透析袋中的调节完PH值的丝素水溶液倒入烧杯中并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.3mol/L)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.5mol/L)在室温下活化反应30min，再加入还原型的谷胱甘肽(0.18mol/L)室温反应18～24h，将与谷胱甘肽反应的丝素蛋白溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析2～3天，冷冻干燥得白色绵密固体，即巯基化改性的丝素蛋白(SF-GSH)。
(2)将分子量为10万的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.1g巯基化改性的丝素蛋白溶于0.5ml含有0.0015g还原剂三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的水溶液中15min；将步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于0.5ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中；将两者溶液混合均匀后，在紫外光(365nm)下固化4min，得到交联度为第二组的丝素/透明质酸水凝胶(第二组名称：S-10-H-5)。
实施例3：一种力学性能良好且降解性能可调的快速光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的Cacl2-C2H60-H2O(物质的量摩尔比为1:2:8)溶液中70℃加热搅拌4h。溶解后取出反应瓶冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将溶解的丝素盐溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。透析后的纯丝素水溶液连同透析袋浸没于2升PH值为6的MES缓冲液(即0.1M的2-吗啉乙磺酸水溶液，其中包含0.05M氯化钠)中，调节透析袋内的丝素溶液的PH值24h直至PH值稳定为6。待PH值稳定后，将透析袋中的调节完PH值的丝素水溶液倒入烧杯中并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.3mol/L)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.5mol/L)在室温下活化反应30min，再加入还原型的谷胱甘肽(0.18mol/L)室温反应18～24h，将与谷胱甘肽反应的丝素蛋白溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析2～3天，冷冻干燥得白色绵密固体，即巯基化改性的丝素蛋白(SF-GSH)。
(2)将分子量为10万的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.15g巯基化改性的丝素蛋白溶于0.5ml含有0.0015g还原剂三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的水溶液中15min；将步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于0.5ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中；将两者溶液混合均匀后，在紫外光(365nm)下固化4min，得到交联度为第三组的丝素/透明质酸水凝胶(第三组名称：S-15-H-5)。
实施例4：一种力学性能良好且降解性能可调的快速光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的Cacl2-C2H60-H2O(物质的量摩尔比为1:2:8)溶液中70℃加热搅拌4h。溶解后取出反应瓶冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将溶解的丝素盐溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。透析后的纯丝素水溶液连同透析袋浸没于2升PH值为6的MES缓冲液(即0.1M的2-吗啉乙磺酸水溶液，其中包含0.05M氯化钠)中，调节透析袋内的丝素溶液的PH值24h直至PH值稳定为6。待PH值稳定后，将透析袋中的调节完PH值的丝素水溶液倒入烧杯中并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.3mol/L)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.5mol/L)在室温下活化反应30min，再加入还原型的谷胱甘肽(0.18mol/L)室温反应18～24h，将与谷胱甘肽反应的丝素蛋白溶液于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析2～3天，冷冻干燥得白色绵密固体，即巯基化改性的丝素蛋白(SF-GSH)。
(2)将分子量为10万的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.2g巯基化改性的丝素蛋白溶于0.5ml含有0.0015g还原剂三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的水溶液中15min；将步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于0.5ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中；将两者溶液混合均匀后，在紫外光(365nm)下固化4min，得到交联度为第四组的丝素/透明质酸水凝胶(第四组名称：S-20-H-5)。
实施例5：应用实施例1.2.3.4进行细胞粘附实验
将制备的不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶进行细胞粘附试验。小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH 3T3)细胞以5×104/ml种植于12孔板，并在每个孔中加入含1.5g/L的碳酸氢钠、100U/ml的青霉素、10％的胎牛血清和100μg/ml的链霉素的DMEM细胞培养基，选用4组(每组三个胶)不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶置于12孔板中。在37℃，5％CO2培养条件下，在含有DMEM细胞培养基的12孔板中培养小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH 3T3)细胞，培养24h后对培养液中的细胞漂浮数进行计数，记录结果并统计。
实施例6：应用实施例1.2进行细胞生长和分化实验
将制备的不同交联度的丝素/透明质酸水凝胶用于切片细胞生长分化试验。选用交联度为第一组和第二组的水凝胶，用酒精浸泡12h，再用PBS清洗两次后，紫外照射1h后于96孔板中，在材料上铺人脐静脉内皮细胞。在37℃，5％CO2条件下培养。用多聚甲醛对细胞进行固定后用0.1％Triton:X100通透15min。PBS清洗，再对细胞进行免疫荧光染色。细胞固定并免疫荧光染色后的样品用于倒置共聚焦显微镜的观察。
对比例1：一种紫外光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的9.3M LiBr溶液中60℃加热搅拌3h。缓慢加入4.13ml甲基丙烯酸缩水甘油酯反应4h后冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将其于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。冷冻干燥得白色绵密固体，即甲基丙烯酸化丝素蛋白(Sil-MA)。
(2)将分子量为10万的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.2g甲基丙烯酸化丝素蛋白和步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于1ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中，在紫外光(365nm)下固化5min，得到丝素/透明质酸水凝胶。
对比例2：一种紫外光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的9.3M LiBr溶液中60℃加热搅拌3h。缓慢加入4.13ml甲基丙烯酸缩水甘油酯反应4h后冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将其于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。冷冻干燥得白色绵密固体，即甲基丙烯酸化丝素蛋白(Sil-MA)。
(2)将分子量为5000的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.2g甲基丙烯酸化丝素蛋白和步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于1ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中，在紫外光(365nm)下固化5min，得到丝素/透明质酸水凝胶。
对比例3：一种紫外光固化丝素/透明质酸水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的9.3M LiBr溶液中60℃加热搅拌3h。冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将其于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。冷冻干燥得白色绵密固体，即纯丝素蛋白。
(2)将分子量为10万的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(3)将步骤(1)所得的0.2g纯丝素蛋白和步骤(2)所得的0.05g双键化改性的透明质酸溶于1ml含有过硫酸钠(5mM)和三(2,2'-联吡啶)二氯化钌(0.5mM)的水溶液中，在紫外光(365nm)下固化15min，得到丝素/透明质酸水凝胶。
对比例4：一种紫外光固化丝素水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取10克剪碎的蚕茧片于4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，捞出置于重新配置的4升0.05M的碳酸钠水溶液中煮沸30min，前后一共煮3次。将煮完的蚕茧用去离子水清洗4遍，置于60℃的鼓风烘箱中过夜烘干得到脱胶蚕丝。为了得到丝素溶液，将5.2克脱胶蚕丝浸入体积约75ml的9.3M LiBr溶液中60℃加热搅拌3h。缓慢加入4.13ml甲基丙烯酸缩水甘油酯反应4h后冷却至室温，在8000rpm(6min,室温)下离心除去不溶性杂质，将其于MWCO3500的透析袋中，4℃下于去离子水中透析3天。冷冻干燥得白色绵密固体，即甲基丙烯酸化丝素蛋白(Sil-MA)。
(2)去季戊四醇10mmol溶于50ml去离子水中，加入过量的N-乙酰-L-半胱氨酸50mmol和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10mmol常温下过夜反应，冷冻干燥得小分子巯基交联剂。
(3)将分子量为5000的透明质酸1.8克溶于90ml去离子水中，搅拌溶解至无色透明的溶液，再加入57.6mlN,N-二甲基甲酰胺，搅拌混合后，将其置于4℃的冷凝循环系统中搅拌降温30min，待温度稳定后，缓慢滴加2.88ml的甲基丙烯酸酐，反应30min。用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节PH值至8～9，反应24h后，加入0.9克氯化钠固体反应1h。以400ml的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出固体物，用去离子水重新溶解后，将甲基丙烯酸化的透明质酸溶液室温下于去离子水中透析3天，冷冻干燥得白色海绵状固体，即双键化改性的透明质酸(HAMA)。
(4)将步骤(1)(3)所得的0.2g甲基丙烯酸化丝素蛋白及005g双键化改性的丝素蛋白和步骤(2)所得的0.05g小分子巯基交联剂溶于1ml含有0.005g光引发剂Irgacure 2959的水溶液中，在紫外光(365nm)下固化5min，得到丝素/透明质酸水凝胶。
对比例说明：对比例1中丝素蛋白和透明质酸均采取双键化改性，在紫外光条件下所得水凝胶固化速度略慢且其力学性能强度不够，交联度难调；对比例2中丝素蛋白和透明质酸均采取双键化改性，但选用分子量更小的透明质酸，在紫外光条件下所得水凝胶固化快但力学强度极差；对比例3中丝素蛋白采用金属钌合物为催化剂，过硫酸钠为电子受体，通过络氨酸之间的共价相互作用形成凝胶，固化速度略慢且金属钌合物毒性较大，生物相容性差，细胞粘附实验中细胞粘附差，细胞漂浮数目多；对比例4中透明质酸和透明质酸均采取双键化改性，丝素蛋白巯基交联剂换为小分子巯基交联剂，固化速度快，但小分子巯基交联剂毒性大且制得的水凝胶力学性能差，体现在压缩强度低，细胞粘附实验中培养液中细胞漂浮数目多。
Claims (8)
1.一种光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于所述光固化丝素/透明质酸水凝胶按如下方法制备：
将巯基化改性的丝素蛋白、水溶性强还原剂、双键化改性的透明质酸、水溶性的光引发剂放入水中混合均匀，得到水凝胶前驱体溶液，紫外光下固化，得到所述光固化丝素/透明质酸水凝胶；
在所述水凝胶前驱体溶液中，所述巯基化改性的丝素蛋白的浓度为3-30wt％，所述水溶性强还原剂的浓度为0.1-0.3wt％，所述双键化改性的透明质酸2-6wt％，所述水溶性的光引发剂的浓度为0.1-0.5wt％；
所述巯基化改性的丝素蛋白按如下方法制备：
以含0.05M氯化钠的pH6～6.5，0.1～0.2M的MES缓冲液为透析液调节丝素水溶液的pH,待pH稳定后，向所得含丝素的缓冲溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合溶液A，在室温下活化反应15～30min，加入还原型的谷胱甘肽，得到混合溶液B，室温下进行巯基化反应18～24h，所得反应液经后处理A，得到所述巯基化改性的丝素蛋白；
所述混合溶液A中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.2～0.4mol/L,所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.4～0.6mol/L；所述混合溶液B中，所述还原型的谷胱甘肽的浓度为0.18～0.2mol/L；
所述双键化改性的透明质酸按如下方法制备：
将分子量为5000～150000的透明质酸溶于去离子水中，得到2～3wt％的透明质酸水溶液；加入N,N-二甲基甲酰胺，均匀分散后降温至3～4℃，滴加甲基丙烯酸酐，滴毕，反应20～30min，调节pH至8～9,反应20～24h,加入氯化钠进行破乳反应0.5～1h，所得反应液B经后处理B，得到所述双键化改性的透明质酸；
所述去离子水与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:0.6～0.8，所述透明质酸、甲基丙烯酸酐与氯化钠的质量比为1:0.5～2：0.3～0.8。
2.如权利要求1所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于：所述水溶性强还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、氯化亚锡、硼氢化钾、硼氢化钠中的一种或两种以上的混合物。
3.如权利要求2所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于：所述水溶性强还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
4.如权利要求1所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于：所述水溶性的光引发剂为Irgacure 2959、光引发剂ITX、Omnirad水性引发剂、2-羟基-2,2’-二甲基苯乙酮中的一种或两种以上的混合物。
5.如权利要求1所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于：所述水溶性的光引发剂为Irgacure 2959。
6.如权利要求1所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于：所述丝素水溶液的浓度为1～4wt％。
7.如权利要求1所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于所述后处理A为：将所述反应液在纯水中3～4℃透析2～3天，冷冻干燥，即得所述巯基化改性的丝素蛋白。
8.如权利要求1所述的光固化丝素/透明质酸水凝胶，其特征在于所述后处理B为：向所述反应液B中加入2.5～3倍所述反应液B体积的无水乙醇，得到白色絮状沉淀，离心，所得固体物用去离子水溶解后，于去离子水中透析2～3天，冷冻干燥，得所述双键化改性的透明质酸。
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