CN102206351B - 一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents
一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶及其制备方法。所述水凝胶包括丝胶蛋白多肽链部分、无机纳米皂石粒子部分，以及烷基丙烯酰胺单体聚合后形成的聚合物。本发明主要采用半互穿网络技术，结合无机纳米皂石粒子的物理交联作用，将丝胶、无机纳米皂石粒子和烷基丙烯酰胺单体原位自由基聚合得到。本发明制备方法包括无机纳米皂石粒子的分散、反应预聚液的配制、凝胶的制备和凝胶的纯化四个步骤。本发明的原料来源丰富、制备方法简单，成本较低。本发明的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶具有高溶胀度和优良的细胞相容性，可由丝胶含量来调节，在人工皮肤、人工软骨、细胞培养支架和生物反应器等生物医用方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料和智能高分子材料领域，具体涉及一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶及其制备方法，可应用于生物医学、组织工程和药物释放等技术领域。
背景技术
蚕丝由丝素和丝胶组成，丝胶包裹于丝素外围约占茧层质量的25％，其主要是对丝素起到胶粘和保护作用，此外也含少量蜡质、色素、碳水化合物和无机成分。丝胶(SS)是一种球状蛋白，相对分子质量为1.4～31.4万，由18种氨基酸组成。极性侧链氨基酸在丝胶的氨基酸组成中占74.61％，因此丝胶具有良好的吸水性、水溶性、抗氧化、促进细胞增殖和生物降解性，是制造生物医学材料的理想原料。
将丝胶水溶液浇铸在有机玻璃板上，室温下干燥制备成的膜会龟裂，实用价值不大。因此通常与其它物质混合制成混合膜，膜的理化性质有所改善。丝胶的肽链中含有较多的氨基、羧基和羟基等官能团，可以引入其它基团来改性丝胶，以开发出以丝胶为主体的新型材料。
将丝胶和凝胶结合，可改善丝胶的龟裂性，同时赋予凝胶良好的生物相容性。凝胶是介于固体与液体之间的一种不溶解只溶胀的高分子三维网络。目前，丝素和凝胶结合的文献报道较多，刘羿君等(功能高分子学报，2009，22(1)：55)以丝素蛋白纤维为填充材料，采用自由基聚合的方法制备了复合聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)水凝胶，发现丝素蛋白纤维的加入改善了复合水凝胶的力学性能。此外，处在表面的丝素蛋白纤维与水凝胶之间存在间隙，在反复溶胀-收缩过程中可以作为输水通道，有利于水分子进出，提高了PNIPAAm水凝胶对温度的响应速率并使其溶胀-收缩重复性更好。中国专利CN 101502670A公开了一种丝素蛋白水凝胶的制备方法，将家蚕丝经脱胶、溶解、透析处理后得到的质量浓度为1-30％的丝素蛋白溶液，在0-60℃的温度条件下进行超声波振荡处理，超声波功率为10-2000瓦特，处理时间为30-600秒，再静置0-6小时，得到丝素蛋白水凝胶。采用超声波振荡处理的方法，不需要添加任何化学交联剂，能在短时间内将丝素蛋白溶液形成为水凝胶，可用于人工皮肤、人工软骨、细胞培养支架、生物反应器、酶固定化材料等生物医用方面。
就丝胶而言，吴雯等(高分子材料科学与工程，26(9)：92)采用同步-互穿方法制备了丝胶蛋白(SS)/聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)水凝胶，发现SS和PNIPAAm之间存在微相分离和蜂窝状结构。然而，该凝胶采用了化学交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)和有一定毒性的戊二醛(GA)，此类凝胶存在机械性能差、响应速率慢、透明性低、易碎和生物相容性差等缺点，不利于在组织工程等领域的应用。Haraguchi等从聚合物网络设计的角度出发，提出新的构思，即通过原位自由基聚合的方法，利用无机纳米粘土锂皂石(Hectorite)作为多功能交联剂制备了高力学性能和快速响应性能的PNIPAAm/Hectorite纳米复合水凝胶。其中，剥离的Hectorite片层以氢键、离子键或配位键与高分子链形成物理交联，高分子链的一端或两端被固定在粘土片层上。中国专利CN 101319019A和CN1931901A公开了一种以市售物理交联剂锂蒙土Laponite为交联剂，乙烯基吡咯烷酮或异丙基丙烯酰胺等为功能单体，制备得到具有良好透明性、吸水溶胀性和力学性能的温敏纳米复合水凝胶。
从上述专利或文献来看，目前尚无将丝胶蛋白、无机纳米材料、水凝胶材料相结合的报道。本发明综合考虑了丝胶蛋白的生物相容性、无机纳米材料的物理交联作用和水凝胶的智能性，采用半互穿网络技术，将丝胶大分子链引入纳米复合水凝胶网络中，制备得到丝胶基半互穿纳米复合水凝胶，提高传统纳米复合水凝胶的透明度、溶胀度、细胞相容性和温度响应性能等。
发明内容
本发明的发明目的在于设计一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，使该凝胶具有高透明度、高溶胀度、快速温度响应性和优良细胞相容性，尤其是克服目前纳米复合水凝胶存在的生物相容性不足的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的制备方法，包括下述步骤：
1)无机纳米皂石粒子的分散：20～25℃下，将无机纳米皂石粒子加入去离子水中，配制成质量百分比浓度为1-4％的水溶液，搅拌10～30min，直至完全分散形成透明溶液；
2)反应预聚液的配制：氮气保护下，将丝胶和烷基丙烯酰胺类单体依次加入上述透明溶液中，丝胶和烷基丙烯酰胺类单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为1～3％和9～7％，20～25℃下搅拌20～40min，形成略呈淡黄色的反应预聚液；
3)凝胶的制备：将上述反应预聚液用冰块降温至0～5℃，在氮气保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.05～0.5％的引发剂水溶液，搅拌5～25min后，注射质量百分比浓度为0.1～2％的催化剂水溶液60～120μL，将溶液缓慢倒入厚度为2mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20～25℃，20～50h后停止反应；
4)凝胶的纯化：将反应后的产物切成大约直径10mm的薄片，浸泡于去离子水中1-2周，每间隔5-8小时更换去离子水，以除去未反应的单体、交联剂和各种杂质，得到所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶。
所述的无机纳米皂石粒子为硅酸镁锂、锂皂石、镁皂石或锂镁皂石中的任意一种，均含有硅氧基团和镁、锂等金属离子，外观为白色固体粉末，在水中经搅拌后可均匀分散，呈澄清透明溶液，具体如：
硅酸镁锂(Mg，Li)3Si4O10(OH)2·4H2O，
镁皂石Na033Mg3[Si3.67Al033O10](OH)2·nH2O，
锂皂石Na066(Mg534Li066)[Si8O20](OH)2·nH2O，
锂镁皂石Na033(Mg267Li0.33)[Si4O10](OH)2·nH2O。
所述的丝胶外观为淡黄色粉末，具有水溶性，易溶于热水、酸、碱溶液中，总体分子构象主要为无规卷曲，分子空间结构松散、无序，其分子链上有许多侧链较长的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸等，以及许多极性亲水基团(如-OH、-COOH、-NH2、＞NH等)处于多肽链表面。
所述的烷基丙烯酰胺类单体具有温度敏感性，为N-异丙基丙烯酰胺或异丙基甲基丙烯酰胺的一种，由于其单体结构中既含有亲水的酰胺基团，又含有疏水的异丙基或甲基基团，因而具有体积相转变温度(VPTT)，当低于此温度时，亲水作用力起主要作用，分子链完全伸展，而当高于此温度时，氢键被破坏，疏水作用力增加，分子链收缩。
所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的催化剂为N，N，N’N’-四甲基乙二胺或亚硫酸钠；
所述的凝胶纯化是将反应产物浸泡于去离子水中1-2周，每间隔5-8小时更换去离子水。
本发明还提供了一种根据上述方法制备的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，该纳米复合水凝胶包括丝胶蛋白多肽链部分、无机纳米皂石粒子部分，以及烷基丙烯酰胺单体聚合后形成的聚合物。
根据上述丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，该无机纳米皂石粒子部分在去离子水中可被剥离成厚度为1-2nm、直径为15-50nm圆盘状片层结构，并作为物理交联剂，起到交联和增韧作用。
根据上述丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，溶胀后的外观为透明状，当外界温度升至31～34℃后，凝胶立刻由透明变为乳白色。
根据上述丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，37℃下在其凝胶表面种植鼠成纤细胞(L929)，随时间和丝胶含量增加细胞数量越多。
本发明的原理是：无机纳米皂石粒子在水溶液被剥离成纳米片层，可作为物理交联剂，分子链通过氢键等作用与片层连接，并在片层间进行链增长，交联方式的变化使得该水凝胶透明度、溶胀性能和力学性能得到提高；而在聚合过程中加入丝胶蛋白后，由于丝胶蛋白为水溶性的多肽分子链，没有双键，并不发生聚合，反应完成后只是穿插在烷基丙烯酰胺形成的高分子三维网络中，即形成了半互穿结构，又由于丝胶多肽链表面含有极性亲水基团(如-OH、-COOH、-NH2、＞NH等)，可与酰胺基团形成氢键，因而不易从凝胶网络中渗出，从而对凝胶起到增强、提高亲水性和生物相容性的作用。
与其它传统水凝胶及其制备方法相比，本发明具有如下有益效果：
1.由于本发明采用了无毒无害的无机纳米皂石粒子和丝胶作为原料，其来源丰富，制备方法简单，无需高压、高温和高真空等条件，因此本发明涉及的水凝胶制备成本较低；
2.本发明所制备的水凝胶具有高溶胀度和优良的细胞相容性，可应用于人工皮肤、人工软骨、细胞培养支架、生物反应器、酶固定化材料等方面；
3.本发明所制备的水凝胶的溶胀度和细胞相容性可通过调节丝胶含量来实现。
附图说明
图1为丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的扫描电子显微镜照片。
图2为鼠成纤细胞(L929)在丝胶基纳米复合水凝胶表面生长5天后的扫描电子显微镜图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)无机纳米皂石粒子的分散：20℃下，将锂皂石加入去离子水中，配制成质量百分比浓度为1％的水溶液，搅拌25min，直至完全分散形成透明溶液；
2)反应预聚液的配制：氮气保护下，将丝胶和异丙基丙烯酰胺依次加入上述透明溶液中，丝胶和烷基丙烯酰胺类单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为1％和9％，20℃下搅拌25min，形成略呈淡黄色的反应预聚液；
3)凝胶的制备：将上述反应预聚液用冰块降温至2℃，在氮气保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.1％的引发剂水溶液，搅拌15min后，注射质量百分比浓度为0.1％的催化剂水溶液100μL，将溶液缓慢倒入厚度为2mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20℃，36h后停止反应；
4)凝胶的纯化：将反应后的产物切成大约直径10mm的薄片，浸泡于去离子水中2周，每间隔8小时更换去离子水，以除去未反应的单体、交联剂和各种杂质，得到所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶。
采用(Zhang等Applied Clay Science，2009，46：346)文献公开方法进行溶胀度测试，所得水凝胶的溶胀度为2800％；采用(Wang等J.Mater.Sci.Mater.Med.2009，20：583)文献公开方法进行细胞相容性测试，37℃下鼠成纤细胞(L929)在所得水凝胶表面吸附4h后，吸附率为82％，当温度从37℃降至15℃时，可实现自动脱附，脱附率超过80％。
实施例2
1)无机纳米皂石粒子的分散：22℃下，将硅酸镁锂加入去离子水中，配制成质量百分比浓度为1.5％的水溶液，搅拌25min，直至完全分散形成透明溶液；
2)反应预聚液的配制：氮气保护下，将丝胶和异丙基丙烯酰胺依次加入上述透明溶液中，丝胶和烷基丙烯酰胺类单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为2％和8％，22℃下搅拌30min，形成略呈淡黄色的反应预聚液；
3)凝胶的制备：将上述反应预聚液用冰块降温至1℃，在氮气保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.15％的引发剂水溶液，搅拌20min后，注射质量百分比浓度为0.15％的催化剂水溶液80μL，将溶液缓慢倒入厚度为2mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在22℃，30h后停止反应；
4)凝胶的纯化：将反应后的产物切成大约直径10mm的薄片，浸泡于去离子水中2周，每间隔8小时更换去离子水，以除去未反应的单体、交联剂和各种杂质，得到所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶。
采用(Zhang等Applied Clay Science，2009，46：346)文献公开方法进行溶胀度测试，所得水凝胶的溶胀度为3260％；采用(Wang等J.Mater.Sci.Mater.Med.2009，20：583)文献公开方法进行细胞相容性测试，37℃下鼠成纤细胞(L929)在所得水凝胶表面吸附4h后，吸附率为86％，当温度从37℃降至15℃时，可实现自动脱附，脱附率超过85％。
实施例3
1)无机纳米皂石粒子的分散：25℃下，将锂镁皂石加入去离子水中，配制成质量百分比浓度为3％的水溶液，搅拌30min，直至完全分散形成透明溶液；
2)反应预聚液的配制：氮气保护下，将丝胶和异丙基丙烯酰胺依次加入上述透明溶液中，丝胶和烷基丙烯酰胺类单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为3％和7％，25℃下搅拌35min，形成略呈淡黄色的反应预聚液；
3)凝胶的制备：将上述反应预聚液用冰块降温至1℃，在氮气保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.1％的引发剂水溶液，搅拌15min后，注射质量百分比浓度为0.2％的催化剂水溶液60μL，将溶液缓慢倒入厚度为2mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在25℃，24h后停止反应；
4)凝胶的纯化：将反应后的产物切成大约直径10mm的薄片，浸泡于去离子水中2周，每间隔5小时更换去离子水，以除去未反应的单体、交联剂和各种杂质，得到所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶。
采用(Zhang等Applied Clay Science，2009，46：346)文献公开方法进行溶胀度测试，所得水凝胶的溶胀度为3920％；采用(Wang等J.Mater.Sci.Mater.Med.2009，20：583)文献公开方法进行细胞相容性测试，37℃下鼠成纤细胞(L929)在所得水凝胶表面吸附4h后，吸附率为91％，当温度从37℃降至15℃时，可实现自动脱附，脱附率超过90％。
实施例4
1)无机纳米皂石粒子的分散：22℃下，将镁皂石加入去离子水中，配制成质量百分比浓度为2％的水溶液，搅拌28min，直至完全分散形成透明溶液；
2)反应预聚液的配制：氮气保护下，将丝胶和异丙基丙烯酰胺依次加入上述透明溶液中，丝胶和烷基丙烯酰胺类单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为2％和8％，22℃下搅拌30min，形成略呈淡黄色的反应预聚液；
3)凝胶的制备：将上述反应预聚液用冰块降温至2℃，在氮气保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.15％的引发剂水溶液，搅拌20min后，注射质量百分比浓度为0.2％的催化剂水溶液60μL，将溶液缓慢倒入厚度为2mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在22℃，30h后停止反应；
4)凝胶的纯化：将反应后的产物切成大约直径10mm的薄片，浸泡于去离子水中2周，每间隔8小时更换去离子水，以除去未反应的单体、交联剂和各种杂质，得到所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶。
采用(Zhang等Applied Clay Science，2009，46：346)文献公开方法进行溶胀度测试，所得水凝胶的溶胀度为3108％；采用(Wang等J.Mater.Sci.Mater.Med.2009，20：583)文献公开方法进行细胞相容性测试，37℃下鼠成纤细胞(L929)在所得水凝胶表面吸附4h后，吸附率为83％，当温度从37℃降至15℃时，可实现自动脱附，脱附率超过83％。
Claims (8)
1.一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
1)无机纳米皂石粒子的分散：20～25℃下，将无机纳米皂石粒子加入去离子水中，配制成质量百分比浓度为1-4％的水溶液，搅拌10～30min，直至完全分散形成透明溶液；
2)反应预聚液的配制：氮气保护下，将丝胶和烷基丙烯酰胺类单体依次加入上述透明溶液中，丝胶和烷基丙烯酰胺类单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为1～3％和9～7％，20～25℃下搅拌20～40min，形成略呈淡黄色的反应预聚液；
3)凝胶的制备：将上述反应预聚液用冰块降温至0～5℃，在氮气保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.05～0.5％的引发剂水溶液，搅拌5～25min后，注射质量百分比浓度为0.1～2％的催化剂水溶液60～120μL，将溶液缓慢倒入厚度为2mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20～25℃，20～50h后停止反应；
4)凝胶的纯化：将反应后的产物切成直径10mm的薄片，浸泡于去离子水中1-2周，每间隔5-8小时更换去离子水，以除去未反应的单体、交联剂和各种杂质，得到所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的无机纳米皂石粒子为硅酸镁锂、锂皂石、镁皂石或锂镁皂石中的任意一种，均含有硅氧基团和镁、锂金属离子，外观为白色固体粉末，在水中经搅拌后可均匀分散，呈澄清透明溶液。
3.根据权利要求1所述的一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的丝胶外观为淡黄色粉末，具有水溶性，易溶于热水、酸、碱溶液中，总体分子构象主要为无规卷曲，分子空间结构松散、无序。
4.根据权利要求1所述的一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的烷基丙烯酰胺类单体具有温度敏感性，为N-异丙基丙烯酰胺或异丙基甲基丙烯酰胺的一种，由于其单体结构中既含有亲水的酰胺基团，又含有疏水的异丙基或甲基基团，因而具有体积相转变温度，当低于此温度时，亲水作用力起主要作用，分子链完全伸展，而当高于此温度时，氢键被破坏，疏水作用力增加，分子链收缩。
5.根据权利要求1所述的一种丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的催化剂为N，N，N’N’-四甲基乙二胺或亚硫酸钠。
6.根据权利要求1所述的方法制备的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，其特征在于：该纳米复合水凝胶包括丝胶蛋白多肽链部分、无机纳米皂石粒子部分，以及烷基丙烯酰胺单体聚合后形成的聚合物。
7.根据权利要求1所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，其特征在于：该无机纳米皂石粒子部分在去离子水中可被剥离成厚度为1-2nm、直径为15-50nm圆盘状片层结构，并作为物理交联剂，起到交联和增韧作用。
8.根据权利要求1所述的丝胶基半互穿温敏纳米复合水凝胶，其特征在于：溶胀后的外观为透明状，当外界温度升至31～34℃后，凝胶立刻由透明变为乳白色。
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