CN117281766A - 电响应型丝素蛋白微针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电响应型丝素蛋白微针的制备方法，包括以下步骤：向活化后的丝素蛋白溶液中滴加半胱胺盐酸盐溶液，并使得最终溶液中的半胱胺盐酸盐浓度为20‑80mmol/L；将最终溶液pH值调节至5‑6；搅拌反应，取出后静置，获得巯基化丝素蛋白溶液；将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋中进行透析；透析完毕后，离心取上清液获得纯化后的巯基化丝素蛋白溶液；取纯化的巯基化丝素蛋白溶液，将其浇注在微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡；之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿环境下进行干燥，干燥脱模后即获得电响应型丝素蛋白微针。本发明的电响应型丝素蛋白微针，能够实现低电压刺激下溶胀度的变化，在通电条件下具备高溶胀特性，实现药物的可控释放。
Description
本申请是申请日为2022年3月16日、申请号为202210258571X、发明名称为“一种电响应型丝素蛋白材料及其制备方法和电响应型丝素蛋白微针”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及丝素蛋白微针贴以及医疗材料和医美材料技术领域，具体涉及一种通电后内部孔径增大的丝素蛋白微针的制备方法以及采用该制备方法制备得到的电响应型丝素蛋白微针。
背景技术
智能响应性给药领域是当前的材料学以及生物医学的研究热点，基于电场、电流、磁场、光照和机械外力的作用，pH值、温度的改变等刺激可以使得药物响应性递送至体内。然而如何控制给药方式以使得智能响应性给药便捷使用、有效递送以及精确控制给药量面临挑战。
微针透皮给药是一种通过长度小于1mm的微针阵列刺破皮肤表皮层并形成微孔以提高透皮给药效率的方法，可以轻松、无痛、安全且方便地实现药物递送，在智能药物递送领域正在发挥重要作用。同时，由于微针阵列在使用过程之中附着于皮肤之上，可有效接受外部刺激尤其是电流、电场以及磁场以达到药物的控制释放。
丝素蛋白是一种具备低免疫原性，生物相容性优异且力学性能出色的绿色天然生物基材料。随着现代科学技术的发展，蚕丝已经不仅仅局限于纺织领域，并且已经广泛用于药物递送领域。然而，负载药物的丝素蛋白微针并不具备智能响应性，这是由丝素蛋白的结构所决定的。由于丝素蛋白分子上缺乏相应的刺激响应性基团或响应性基团过少。整体上，纯丝素蛋白并不具备刺激响应性变化，从而无法用来进行智能药物递送。
为了解决上述问题，中国发明专利CN108047466A公开了一种蚕丝微针的制备方法，采用的化学交联剂为戊二醛，然后将化学交联后的丝素溶液制成微针；在制成微针后进行水蒸气处理得到高强度丝素微针，此微针能够较为容易的刺入皮肤，并可混入大量药物。但是这种微针经过水蒸气处理，内部结构以β-折叠为主，不易发生吸水溶胀行为，从而导致药物释放缓慢，释药率低，缺乏响应性；同时，戊二醛作为交联剂，对人体危害较大，对皮肤和消化系统均会产生刺激。又如中国发明专利CN102580232B公开了一种丝素微针系统和丝素纳米颗粒及其制备方法。此方法制备得到的丝素蛋白微针刺入皮肤后迅速溶解，从而释放纳米颗粒。但是这种微针系统将药物一次性释放至体内，无法控制药物的智能释放和释放量。
电辅助给药，价格便宜且易于执行，可帮助药物克服组织屏障进入体内，其释药机制主要是电穿孔以及离子电渗疗法等，然而这些方法均会使用到一些较大的电流或电场，会带来一定的安全隐患。如何在低电流或电场下在丝素蛋白微针中完成药物的智能响应性传递十分有意义，可以极大拓展智能给药在人体上精准、便捷及安全化应用。
Gu等人[Nature Biomedical Engineering,2020,4(7):1-8.]开发了一种具有葡萄糖响应性的N-乙烯基吡咯烷酮基微针贴片的方法，所述微针贴片包含经设计用于葡萄糖触发的胰岛素递送的共聚物。这种微针载药量大且具备智能响应效果，可用于胰岛素闭环递送。然而微针基材使用聚合物材料进行制备，其生物安全性及绿色可持续性较为不足，同时葡萄糖智能响应速度较慢，无法快速响应释放。Moonjeong等[DOI:10.1038/s41598-020-58822-w]开发了由透明质酸微针组成的多功能系统，作为用于快速局部药物的有效透皮递送。该微针在超声波作用下，声压振动将诱导透明质酸溶解，而交流电离子电渗疗法可改善静电力驱动的透明质酸离子和若丹明的扩散。这种方法药物释放速度快，可以进行快速局部药物递送。然而由于使用较高压电场直接作用于药物或是人体皮肤，这将会带来一定的药物变质风险及人体危害，具有一定的使用局限性。
如何开发一种可通过作用于微针的电响应材料，通过低压电刺激实现材料的快速智能响应性变化，进而控制药物的快速响应释放，完成电响应智能药物释放至关重要。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种电响应型丝素蛋白微针的制备方法，制备得到的丝素蛋白微针能够实现采用开关电的方式来控制材料中的孔径并达到控制药物释放速度的目的。
为达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：
一种电响应型丝素蛋白材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)丝素蛋白的活化：将丝素蛋白水溶液稀释至浓度为20-30mg/mL，之后将溶液放入冰浴，使温度稳定至0-4℃，使用缓冲溶液将丝素蛋白溶液的pH值调节至5-6；向上述丝素蛋白溶液中加入相对于丝素蛋白质量1-10wt％的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入相对于丝素蛋白质量2-20wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.4-1h，获得活化的丝素蛋白溶液；
(2)丝素蛋白的巯基化：向上述活化的丝素蛋白溶液中滴加浓度为40-60mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，并使得最终溶液中的半胱胺盐酸盐浓度为20-80mmol/L，然后使用缓冲溶液将最终溶液pH值调节至5-6；0-4℃下搅拌反应2-5h，取出后在2-8℃温度下静置反应8-10h，获得巯基化丝素蛋白溶液；
(3)巯基化丝素蛋白的纯化：将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋中进行透析；透析完毕后，离心取上清液获得纯化后的巯基化丝素蛋白溶液；
(4)电响应型丝素蛋白材料的制备：取上述步骤中纯化的巯基化丝素蛋白溶液，浇注在模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡；之后将脱泡后的模具置于恒温恒湿环境下进行干燥，干燥脱模后即获得电响应型丝素蛋白材料。至于将电响应型丝素蛋白材料具体做成什么形状，可以根据实际需求设计模具，进而制备得到对应形状的丝素蛋白材料，如制备成电响应型丝素蛋白微针贴片。
根据本发明的一些优选实施方面，所述电响应型丝素蛋白材料含有丝素蛋白以及接枝于所述丝素蛋白上的巯基；巯基的含量为20-100μmol/g。巯基含量太低，电响应性较小，溶胀度没有太大的变化。另一方面，丝素蛋白分子中的羧基含量是有限的，上述反应条件的控制也是尽量在能够反应的羧基上接入巯基以增加巯基的含量，达到更好的电响应效果和溶胀度的控制。
根据本发明的一些优选实施方面，所述丝素蛋白材料具有电流响应性，在未通电情况下1小时的溶胀率为50-120％，在电压0.6V下通电1小时后的溶胀率为120-250％。巯基与二硫键之间的氧化还原电位是0.6伏特左右。电压不能高于1伏特，防止水的电解。低于0.6伏特，二硫键不能被还原。在实际应用过程中，可以设定电压在0.6-0.9伏特之间。本发明的电流响应性指的是制备得到的丝素蛋白材料在通电前后的性能(溶胀率)有所改变，通电后材料的溶胀率比未通电情况下的溶胀率有明显的提升。
根据本发明的一些优选实施方面，所述N-羟基琥珀酰亚胺与丝素蛋白的质量比为1:100-1:10；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与丝素蛋白的质量比为1:50-1:5；半胱胺盐酸盐与丝素蛋白的质量比为1:100-1:2.5。
根据本发明的一些优选实施方面，所述透析时在透析用去离子水中加入硫代硫酸钠并通入惰性气体进行保护；每2-4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d和保持惰性气体保护；之后再换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水进行透析1d。惰性气体优选氮气N2。
根据本发明的一些优选实施方面，去离子水中硫代硫酸钠的浓度为0.001-0.0015mol/L。
根据本发明的一些优选实施方面，透析时采用的透析袋的截留分子量为8-14kDa。
根据本发明的一些优选实施方面，所述恒温恒湿的条件为温度20-30℃、相对湿度55-65％。
根据本发明的一些优选实施方面，所述缓冲溶液为选自2-(N-吗啉代)乙磺酸、甘氨酸-盐酸、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠、Tris-盐酸缓冲液中的一种。
根据本发明的一些优选实施方面，所述丝素蛋白水溶液以家蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析后获得。
本发明还提供了一种采用如上所述的制备方法制备得到的电响应型丝素蛋白材料。
本发明还提供了一种电响应型丝素蛋白微针，其采用如上所述的巯基化丝素蛋白，将其浇注在微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡；之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿环境下进行干燥，干燥脱模后即获得电响应型丝素蛋白微针贴片。
本发明的反应原理如下：丝素蛋白的巯基化改性是通过将丝素蛋白与半胱胺盐酸盐采用N-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐体系偶联反应所制备得到的。在反应起始阶段，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)通过与丝素蛋白分子结构中的天冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基进行反应形成一种促发剂——不稳定的脲衍生物，然后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，形成更稳定的酯从而增强碳二亚胺交联产物的水稳定性，同时此时羧基处于被活化状态。在羧基被活化后，半胱胺盐酸盐上的氨基会与此时被活化的羧基发生反应从而形成酰胺键，半胱胺被成功接枝于丝素蛋白分子之上。同时反应过程中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺转变成水溶性的脲衍生物，可以在后面的透析过程中取出，以保留丝素蛋白良好的生物相容性。
二硫键的氧化还原电位比较低，表观还原电位在0.6伏特左右，容易发生可逆的氧化还原反应。丝素蛋白接枝上巯基以后，在空气中氧气的存在下，巯基被氧化从而在丝素蛋白分子链间形成二硫键交联点。这种二硫键形成的交联点是可逆的，在还原性条件下会被断开变回巯基，分子链间交联点会断开。在未通电情况下，丝素蛋白分子链间交联程度较高，从而使丝素微针溶胀率较小；而在通电状态下，电流提供了还原性环境，二硫键得到电子发生电化学还原反应，二硫键断开形成巯基，丝素蛋白分子链间共价交联点减少，丝素微针溶胀率增大。这种溶胀度的变化可以通过开关电源的方式来控制。因此获得电响应性丝素蛋白材料，通过对电流的响应，达到控制溶胀度变化的目的，进而可以控制微针中药物的释放速度。
由于采用了以上的技术方案，本发明与现有技术相比具有如下的有益之处：本发明的电响应型丝素蛋白微针的制备方法，制备得到的电响应型丝素蛋白微针能够实现低电压刺激下溶胀度的变化，在通电条件下具备高溶胀特性，在不通电的情况下具备低溶胀特性，实现药物的可控释放。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明优选实施例2中制备得到的微针贴片的显微镜照片；
图2为本发明实施例2-7所制备的电流响应型丝素蛋白微针贴片在通电与不通电的情况下溶胀度变化图；
结合图2和实施例2-7可以看出：N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的过多加入会降低丝素蛋白微针贴片的电流响应性及溶胀性能，半胱胺盐酸盐添加量的增加可以提高微针贴片的溶胀度；
图3为本发明实施例2所制备的电流响应型丝素蛋白微针贴片在通电与不通电的情况下内部孔径的扫描电镜图；其中图3(a-b)是通电前微针的内部孔径电镜图，图3(c-d)是通电后微针的内部孔径电镜图，可以看到通电后，微针内部的孔径加大，有利于药物的通过；
图4为本发明实施例中电流响应型丝素蛋白微针通电前后的材料内巯基和二硫键转化的原理图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1丝素蛋白水溶液的制备
称取3g NaHCO3和1g Na2CO3溶于4000mL去离子水中，加热至沸腾，放入80g蚕丝，保持98℃微沸30min，取出后用去离子水清洗。重复上述步骤三次后放置于60℃烘箱中干燥得到脱胶的丝素纤维。
配制9.3mol/L的LiBr溶液，取100mL的LiBr溶液水浴加热至65℃，分多次放入脱胶丝素15g搅拌溶解后，继续加热并搅拌40min。液体装入透析袋中放置于去离子水中透析72h，每隔2h更换去离子水。透析后溶液经过过滤获得丝素蛋白水溶液。
实施例2
本实施例中电响应型丝素蛋白微针的制备方法具体包括以下步骤：
1)巯基化丝素蛋白溶液的制备
将丝素蛋白水溶液浓度稀释至30mg/mL，之后将溶液烧杯在冰浴中稳定至2℃，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将丝素蛋白溶液pH值调至5.5。先分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢加入5wt％(相对于丝素蛋白质量)的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入10wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.5h以活化丝素蛋白上的羧基基团。
分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢滴加50mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，使得最终溶液的半胱胺盐酸盐浓度为60mmol/L，丝素蛋白的浓度为20mg/mL，后使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将最终溶液pH值调节稳定至5.5。冰浴中搅拌反应4h，取出后在4℃低温冰箱静置反应过夜。
2)巯基化丝素蛋白溶液的透析
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量为8-14kDa)中进行透析，透析环境为在去离子水中加入少量硫代硫酸钠(0.001mol/L)并通入惰性气体N2保护。每4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d后换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水透析1d。透析完毕后，离心取上清液获得接枝改性后的巯基化丝素溶液。然后测量丝素蛋白溶液的质量浓度(wt％)，置于4℃冰箱保存备用。改性后丝素蛋白溶液中的巯基含量为92.9±5.7μmol/g。
3)丝素蛋白微针的制备
取1mL巯基化丝素蛋白溶液，浇注在单块PDMS(二甲基硅氧烷)微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡，重复三次。之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿间(25℃、55％RH)，空气流通处下干燥8h，脱模后即获得丝素蛋白微针。微针在未通电情况下1小时的溶胀率为72±3.63％，在电压0.6V下通电1小时的溶胀率为227±13.86％。
实施例3
本实施例中电响应型丝素蛋白微针的制备方法具体包括以下步骤：
1)巯基化丝素蛋白溶液的制备
将丝素蛋白水溶液浓度稀释至20mg/mL，之后将溶液烧杯在冰浴中稳定至3℃，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将丝素蛋白溶液pH值调至5。先分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢加入5wt％(相对于丝素蛋白质量)的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入8wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.6h以活化丝素蛋白上的羧基基团。
分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢滴加60mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，使得最终溶液的半胱胺盐酸盐浓度为40mmol/L，丝素蛋白的浓度为20mg/mL，后使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将最终溶液pH值调节稳定至5。冰浴中搅拌反应4h，取出后在4℃低温冰箱静置反应过夜。
2)巯基化丝素蛋白溶液的透析
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量为8-14kDa)中进行透析，透析环境为在去离子水中加入少量硫代硫酸钠(0.0015mol/L)并通入惰性气体N2保护。每4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d后换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水透析1d。透析完毕后，离心取上清液获得接枝改性后的巯基化丝素溶液。然后测量丝素蛋白溶液的质量浓度(wt％)，置于4℃冰箱保存备用。改性后丝素蛋白溶液中的巯基含量为23.3±2.2μmol/g。
3)丝素蛋白微针的制备
取1mL的(2)中制备的巯基化丝素蛋白溶液，浇注在单块PDMS微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡，重复三次。之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿间(25℃、55％RH)，空气流通处下干燥6h，脱模后即得丝素蛋白微针。微针在未通电情况下1小时的溶胀率为84±5.76％，在电压0.6V通电下1小时的溶胀率为163±7.81％。
实施例4
本实施例中电响应型丝素蛋白微针的制备方法具体包括以下步骤：
1)巯基化丝素蛋白溶液的制备
将丝素蛋白水溶液浓度稀释至20mg/mL，之后将溶液烧杯在冰浴中稳定至2℃，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将丝素蛋白溶液pH值调至5.5。先分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢加入2.5wt％(相对于丝素蛋白质量)的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入4wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.8h以活化丝素蛋白上的羧基基团。
分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢滴加55mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，使得最终溶液的半胱胺盐酸盐浓度为80mmol/L，丝素蛋白的浓度为20mg/mL，后使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将最终溶液pH值调节稳定至5.5。冰浴中搅拌反应4h，取出后在4℃低温冰箱静置反应过夜。
2)巯基化丝素蛋白溶液的透析
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量为8-14kDa)中进行透析，透析环境为在去离子水中加入少量硫代硫酸钠(0.0015mol/L)并通入惰性气体N2保护。每4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d后换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水透析1d。透析完毕后，离心取上清液获得接枝改性后的巯基化丝素溶液。然后测量丝素蛋白溶液的质量浓度(wt％)，置于4℃冰箱保存备用。改性后丝素蛋白溶液中的巯基含量为48.3±2.9μmol/g。
3)丝素蛋白微针的制备
取1mL的(2)中制备的巯基化丝素蛋白溶液，浇注在单块PDMS微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡，重复三次。之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿间(25℃、55％RH)，空气流通处下干燥6h，脱模后即得丝素蛋白微针。微针在未通电情况下1小时的溶胀率为105±5.53％，在电压0.6V通电下1小时的溶胀率为182±8.32％。
实施例5
本实施例中电响应型丝素蛋白微针的制备方法具体包括以下步骤：
1)巯基化丝素蛋白溶液的制备
将丝素蛋白水溶液浓度稀释至25mg/mL，之后将溶液烧杯在冰浴中稳定至2℃，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将丝素蛋白溶液pH值调至6。先分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢加入5wt％(相对于丝素蛋白质量)的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入7.5wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.5h以活化丝素蛋白上的羧基基团。
分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢滴加60mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，使得最终溶液的半胱胺盐酸盐浓度为20mmol/L，丝素蛋白的浓度为20mg/mL，后使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将最终溶液pH值调节稳定至6。冰浴中搅拌反应4h，取出后在4℃低温冰箱静置反应过夜。
2)巯基化丝素蛋白溶液的透析
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量为8-14kDa)中进行透析，透析环境为在去离子水中加入少量硫代硫酸钠(0.001mol/L)并通入惰性气体N2保护。每4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d后换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水透析1d。透析完毕后，离心取上清液获得接枝改性后的巯基化丝素溶液。然后测量丝素蛋白溶液的质量浓度(wt％)，置于4℃冰箱保存备用。改性后丝素蛋白溶液中的巯基含量为41.2±3.1μmol/g。
3)丝素蛋白微针的制备
取1mL的(2)中制备的巯基化丝素蛋白溶液，浇注在单块PDMS微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡，重复三次。之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿间(25℃、55％RH)，空气流通处下干燥6h，脱模后即得丝素蛋白微针。微针在未通电情况下1小时的溶胀率为97±3.87％，在电压0.6V通电下1小时的溶胀率为132±6.21％。
实施例6
本实施例中电响应型丝素蛋白微针的制备方法具体包括以下步骤：
1)巯基化丝素蛋白溶液的制备
将丝素蛋白水溶液浓度稀释至30mg/mL，之后将溶液烧杯在冰浴中稳定至2℃，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将丝素蛋白溶液pH值调至5。先分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢加入10wt％(相对于丝素蛋白质量)的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入2.5wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.5h以活化丝素蛋白上的羧基基团。
分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢滴加40mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，使得最终溶液的半胱胺盐酸盐浓度为60mmol/L，丝素蛋白的浓度为30mg/mL，后使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将最终溶液pH值调节稳定至5。冰浴中搅拌反应4h，取出后在4℃低温冰箱静置反应过夜。
2)巯基化丝素蛋白溶液的透析
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量为8-14kDa)中进行透析，透析环境为在去离子水中加入少量硫代硫酸钠(0.0015mol/L)并通入惰性气体N2保护。每4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d后换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水透析1d。透析完毕后，离心取上清液获得接枝改性后的巯基化丝素溶液。然后测量丝素蛋白溶液的质量浓度(wt％)，置于4℃冰箱保存备用。改性后丝素蛋白溶液中的巯基含量为53.3±2.6μmol/g。
3)丝素蛋白微针的制备
取1mL的(2)中制备的巯基化丝素蛋白溶液，浇注在单块PDMS微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡，重复三次。之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿间(25℃、55％RH)，空气流通处下干燥6h，脱模后即得丝素蛋白微针。微针在未通电情况下1小时的溶胀率为115±6.27％，在电压0.6V通电下1小时的溶胀率为176±7.53％。
实施例7
本实施例中电响应型丝素蛋白微针的制备方法具体包括以下步骤：
1)巯基化丝素蛋白溶液的制备
将丝素蛋白水溶液浓度稀释至20mg/mL，之后将溶液烧杯在冰浴中稳定至2℃，使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将丝素蛋白溶液pH值调至5.5。先分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢加入8wt％(相对于丝素蛋白质量)的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入20wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.5h以活化丝素蛋白上的羧基基团。
分别向上述丝素蛋白溶液中缓慢滴加50mg/mL的半胱胺盐酸盐溶液，使得最终溶液的半胱胺盐酸盐浓度为60mmol/L，丝素蛋白的浓度为20mg/mL，后使用2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液将最终溶液pH值调节稳定至5.5。冰浴中搅拌反应4h，取出后在4℃低温冰箱静置反应过夜。
2)巯基化丝素蛋白溶液的透析
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量为8-14kDa)中进行透析，透析环境为在去离子水中加入少量硫代硫酸钠(0.001mol/L)并通入惰性气体N2保护。每4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序2d后换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水透析1d。透析完毕后，离心取上清液获得接枝改性后的巯基化丝素溶液。然后测量丝素蛋白溶液的质量浓度(wt％)，置于4℃冰箱保存备用。改性后丝素蛋白溶液中的巯基含量为63.3±4.5μmol/g。
3)丝素蛋白微针的制备
取1mL的(2)中制备的巯基化丝素蛋白溶液，浇注在单块PDMS微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡，重复三次。之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿间(25℃、55％RH)，空气流通处下干燥6h，脱模后即得丝素蛋白微针。微针在未通电情况下1小时的溶胀率为55±6.49％，在电压0.6V通电下1小时的溶胀率为123±7.18％。
表1是本发明实施例2-7所制备的丝素蛋白微针中的巯基含量以及对应的通电前后的溶胀率。溶胀率的测试方法如下，采用1小时去离子水(37℃)浸泡的方法，比较浸泡前后的质量增加率，溶胀率＝(浸泡后的质量-浸泡前的质量)/浸泡前的质量。
表1实施例中制备的丝素蛋白微针中的巯基含量
结合表1和图2的结果可以看出，实施例中制备得到的电响应型丝素蛋白微针在通电后的溶胀率有明显的增长，且巯基含量越高，溶胀效果越好。
以上为了便于叙述和方便理解，特将步骤进行了区分和编号，实际制备时，以上步骤可以同时进行或无先后顺序的进行。且实施例中未有特别说明的原料均通过商购获得。没有特别提及温度的操作在室温下进行。未有特别说明的操作方法与条件可采用本领域的公知或常规的手段与条件。
本发明通过丝素蛋白分子巯基化获得一种巯基化丝素蛋白，然后浇注形成微针。这种含有巯基的丝素蛋白在电流通过时会发生巯基的氧化还原反应，造成二硫键交联度的变化，从而响应电流，形成丝素蛋白不同溶胀的状态。该方法制备的微针透皮贴片具有良好的力学性能、生物相容性以及优良的电流响应性溶胀变化，可实现电流开关下的药物控制释放。可以应用在医疗或医美中需要控制给药量的场景下。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种电响应型丝素蛋白微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
向活化后的丝素蛋白溶液中滴加半胱胺盐酸盐溶液，并使得最终溶液中的半胱胺盐酸盐浓度为20-80mmol/L；将最终溶液pH值调节至5-6；搅拌反应，取出后静置，获得巯基化丝素蛋白溶液；
将反应完成的丝素蛋白溶液装入透析袋中进行透析；透析完毕后，离心取上清液获得纯化后的巯基化丝素蛋白溶液；
取纯化的巯基化丝素蛋白溶液，将其浇注在微针模具中，在真空干燥箱中抽真空去除气泡；之后将脱泡后的模具系统置于恒温恒湿环境下进行干燥，干燥脱模后即获得电响应型丝素蛋白微针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电响应型丝素蛋白微针含有丝素蛋白以及接枝于所述丝素蛋白上的巯基；巯基的含量为20-100μmol/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电响应型丝素蛋白微针具有电流响应性，所述电流响应性为所述丝素蛋白微针在通电后材料的溶胀率大于未通电情况下的溶胀率。
4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，所述电响应型丝素蛋白微针在未通电情况下1小时的溶胀率为50-120％，在电压0.6V下通电1小时后的溶胀率为120-250％。
5.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，所述电响应型丝素蛋白微针的电流响应性的施加电压为0.6-0.9V。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析时在透析用去离子水中加入硫代硫酸钠并通入惰性气体进行保护；每2-4h更换一次添加硫代硫酸钠的去离子水，并重复透析程序和保持惰性气体保护；之后再换用未添加有硫代硫酸钠的去离子水进行透析。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述去离子水中硫代硫酸钠的浓度为0.001-0.0015mol/L。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述透析时采用的透析袋的截留分子量为8-14kDa。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的活化按如下步骤进行：
向丝素蛋白溶液中加入相对于丝素蛋白质量1-10wt％的N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入相对于丝素蛋白质量2-20wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀后反应0.4-1h，获得活化的丝素蛋白溶液。
10.一种采用如权利要求1-9任意一项所述的制备方法制备得到的电响应型丝素蛋白微针。
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