CN113730599A - 一种功能丝素蛋白药物载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，包括：将家蚕蚕丝脱胶、溶解、透析、过滤、浓缩得到丝素蛋白溶解液；将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应，得到反应后的溶液；将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。本发明提出利用SF分子上含有的最多的官能团羟基来制备ROS响应的载药SF/TK纳米粒子。基于SF分子的化学结构特征，可以加载各种不同表面性质的药物，本发明开发了一类具备智能响应递送功能的SF药物载体，提升了药物在病变组织部位治疗的精确性和有效性。

Description

一种功能丝素蛋白药物载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种功能丝素蛋白药物载体及其制备方法。
背景技术
癌症是二十一世纪主要的死亡原因之一，目前，化学疗法是抗癌的主要手段。然而，诸如紫杉醇和阿霉素等化学治疗药物，对肿瘤细胞缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时无差别地会杀死正常细胞。近来，巧妙开发了药物递送系统，以定向释放药物有效减少毒副作用。其中，纳米颗粒由于其粒径小，比表面积大，载药量大，容易被细胞吞噬而得到广泛应用。
与其他天然和合成聚合物相比，SF是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的天然蛋白质，无毒无副作用，是一种具有广阔应用前景的生物材料。在作为药物载体的研究方面也受到了极大的关注。
但包括SF在内的药物载体面临的临床问题是缺乏精准的靶向性或定位性。因此，赋予SF药物载体的智能响应功能，提升药物载体在炎症和肿瘤治疗中的定向性和高效性，具有重要的研究价值。酮缩硫醇(TK)是一种ROS响应性化合物，能在ROS环境下被氧化断键。ROS环境存在于大多数炎症组织和肿瘤细胞中，因此TK多聚物被关注用于炎症组织和肿瘤细胞中的释放给药治疗。
在本发明之前，关于响应型SF材料主要公开了pH响应型、磁响应型、温度响应型和光响应型等。如一种表面接枝叶酸并载有阿霉素的多孔SF颗粒，体外药物释放显示pH依赖性释放(Journal of Materials Science,2019,54(4):3319)。一种载有阿霉素的磁性SF纳米粒子，可用于磁场指导下(磁性靶向)的多药耐药性癌症化学疗法中的药物递送系统(Advanced Materials,2014,26:7393)。一种结合SF反蛋白石支架和温度响应型聚(N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶的多功能药物递送微载体，通过外部温度刺激可以触发微载体的药物释放(Applied Materials Today,2020,19:UNSP 100540)。一种基于SF的光响应型一氧化碳释放纳米载药颗粒，表现出改善的一氧化碳释放(Dalton Transactions,2018,47:10434)。
关于ROS响应型的材料主要是含硫、硒、碲和不饱和脂质ROS响应载体等。一种二羟基烷基硒化物与二异氰酸酯缩合聚合、并终止于聚乙二醇单甲基醚的含单硒化物的两亲嵌段共聚物，在氧化环境中发生了结构分解和负载药物的受控释放(Polymer Chemistry,2010,1:1609)。一种碲聚合物，在超低浓度过氧化氢存在下，聚合物胶束可以迅速膨胀并演变成不规则的聚集体，可以作为化学和放射治疗相结合的潜在治疗手段(ChemicalCommunications,2015,51:7069)。一种封装光敏剂和河豚毒素的近红外光触发脂质体，可提供按需可调的局部麻醉(Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112:15719)。又如一种包覆光敏剂二氢卟酚e6和化疗药物阿霉素的TK/聚合物纳米载体，在660nm红光照射下可触发化疗药物阿霉素的快速释放(Chemistry of Materials,2018,30:517)。ROS响应型载药纳米材料的研发已有一些知识产权，如一种以乙烯基吡啶和聚乙二醇为单体进行自由基聚合得到的纳米级粒子可以作为光敏剂的传输载体(申请号：201611126310.3)；一种聚姜黄素前药型纳米粒子可以用于负载抗癌药物和花箐分子(申请号：201910191720.3)；一种表面修饰选择性拮抗剂AMD3100且以葡聚糖和硫辛酸为基材的ROS响应型两亲性材料，用于肝纤维化治疗药物的包载和特异性释药(申请号：202010087783.7)等。
本发明人曾经公开了一种ROS响应型的SF载药递送系统的探索研究，并显示有一定的ROS响应性效果但不显著，因此，开发一种ROS高效响应的SF载药纳米颗粒是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，本发明提供的功能丝素蛋白药物载体提升了药物在病变组织部位治疗的精确性和有效性；同时具有显著的ROS响应性能。
本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，包括：
A)将家蚕蚕丝脱胶、溶解、透析、过滤、浓缩得到丝素蛋白溶解液；
B)将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应，得到反应后的溶液；
C)将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。
优选的，步骤A)所述脱胶为采用碳酸钠或碳酸氢钠进行脱胶；所述溶解为采用溴化锂进行溶解；所述透析的截留分子量为10～50kDa；所述丝素蛋白溶解液的浓度为10～200mg/mL。
优选的，步骤B)所述两端带有羧基的酮缩硫醇的制备方法具体为：
3-巯基丙酸和无水丙酮的混合物在酸性条件下反应，制备的晶体经洗涤、离心、冻干获得两端带有羧基的TK；
所述3-巯基丙酸和无水丙酮的摩尔比为1：1.5～2.5；所述酸性条件为盐酸；所述盐酸的浓度为7～8M；所述反应具体为20～30℃反应4～8小时；所述冻干具体为：-20～-80℃预冷冻2～6小时后冻干8～16小时。
优选的，步骤B)所述丝素蛋白和两端带有羧基的酮缩硫醇质量比为100:0.5～20；所述两端带有羧基的酮缩硫醇的溶解溶剂为水。
优选的，步骤B)所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶；所述交联剂的添加量为两端带有羧基的酮缩硫醇的2～2.5倍；
所述活化反应温度为4～6℃；
所述反应温度为20～30℃；所述反应时间为10～60min。
优选的，步骤C)所述无水乙醇的浓度为0.5～1.5M；所述聚乙烯醇的浓度为5～60mg/mL，聚乙烯醇的分子量为3～7万；
所述冷冻具体为：-20℃冷冻8～48h；所述解冻为20～30℃解冻；
所述离心为13000rpm离心；
所述沉淀物冷冻干燥具体为：将沉淀物-20～-80℃预冷冻2～6h后冻干8～16h。
本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
本发明提供了上述任意一项所述的制备方法制备得到的功能丝素蛋白药物载体在担载抗肿瘤/抗炎药物中的应用。
本发明提供了一种载药纳米粒子，包括药物和上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的功能丝素蛋白药物载体。
与现有技术相比，本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，包括：A)将家蚕蚕丝脱胶、溶解、透析、过滤、浓缩得到丝素蛋白溶解液；B)将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应，得到反应后的溶液；C)将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。本发明SF/TK纳米粒子中引入了较多的具有ROS响应的分子TK，TK以其端部的双活性官能团羧基分别与SF分子链上大量的羟基共价结合，桥接于SF分子之间。在肿瘤和炎症病变治疗中，经肿瘤或炎症细胞吞噬后因胞中高浓度氧的穿透作用，SF/TK纳米粒子中TK分子的C-S键断裂使SF分子间共价键断裂，纳米粒子内部分子间裂解，从而纳米粒子中的药物迅速释放出来，定向杀死肿瘤和炎症细胞，同时进入正常细胞中的纳米粒子其不裂解或裂解程度很小，仅依赖于渗透释放或降解后释放，被代谢前药物释放很少很慢，对正常细胞的杀伤极小。另外，选用的与人体组成相同的20种α-氨基酸组成的SF作为载药纳米粒子主体，进入人体后无毒副作用，是一种理想的药物递送载体。SF可通过制备技术调节纳米粒子的结晶结构，从而调控药物的渗透释放与降解释放，降低纳米粒子代谢排出前释放于正常细胞中的药物量，是一种符合定向治疗炎症和肿瘤的药物递送载体。
具体实施方式
本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，包括：
A)将家蚕蚕丝脱胶、溶解、透析、过滤、浓缩得到丝素蛋白溶解液；
B)将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应，得到反应后的溶液；
C)将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。
本发明提供的一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法首先将将家蚕蚕丝脱胶。
本发明所述脱胶优选为采用碳酸钠或碳酸氢钠进行脱胶；更优选具体为：
称取一定量的生丝，按浴比1:50(w:v)量取去离子水，往冷水中加入Na2CO3或碳酸氢钠搅拌均匀，待水煮沸后加入生丝脱胶，取出搓洗，放入锅中再次煮沸脱胶，重复2～3次。
将脱胶后的丝置于电热恒温干燥箱中，烘干，扯至蓬松，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。本发明对于所述烘干的具体温度不进行限定，可以为50～70℃。
脱胶后为溶解。本发明所述溶解优选为采用溴化锂进行溶解；更优选具体为：称取一定量的脱胶丝素纤维，剪碎放入溴化锂溶液中60～70℃加热搅拌1～2h小时得到家蚕SF溶解液。本发明对于所述溴化锂的浓度不进行限定，本领域技术人员熟知的即可，优选为9～10M。
溶解后为透析、过滤、浓缩得到丝素蛋白溶解液。
将家蚕SF溶解液灌注于透析袋中置于盛有去离子水的容器内透析；本发明所述透析的截留分子量为10～50kDa；更优选为25～50kDa。
透析后过滤、通风橱内旋转蒸发浓缩。
本发明所述丝素蛋白溶解液的浓度优选为10～200mg/mL；更优选为15～190mg/mL；最优选为20～80mg/mL。
将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应；本发明所述两端带有羧基的酮缩硫醇(两端带有羧基的TK)的制备方法具体为：
3-巯基丙酸和无水丙酮的混合物在酸性条件下反应，制备的晶体经洗涤、离心、冻干获得两端带有羧基的TK；
将3-巯基丙酸和无水丙酮混合，所述3-巯基丙酸和无水丙酮的摩尔比优选为1：1.5～2.5；更优选为1：2～2.5；并在盐酸条件下反应；所述盐酸的浓度为7～8M；反应具体为20～30℃反应4～8小时；更优选为22～28℃反应4～8小时；将反应沉析出来的晶体经洗涤、离心、冻干，获得两端带有羧基的TK。所述离心优选为13000rpm。所述冻干具体为：-20～-80℃预冷冻2～6小时后冻干8～16小时。
按照本发明所述丝素蛋白和两端带有羧基的酮缩硫醇质量比为优选100:0.5～20；更优选为100:1～10；最优选为100:1～8。
其中，所述两端带有羧基的酮缩硫醇的溶解溶剂为水，配置成0.1～0.5mg/mL，优选可以为：置于4℃水浴中搅拌20分钟。
本发明所述活化反应温度为4～6℃；
本发明所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶；所述交联剂的添加量为两端带有羧基的酮缩硫醇的2～2.5倍；
所述反应温度优选为20～30℃；更优选为22～28℃；所述反应时间优选为10～60min；更优选为15～55min。
本发明优选为：向TK溶液里慢慢滴加交联剂，随后在4℃～6℃水浴中反应10～15分钟，以活化羧基。而后将活化后的TK缓慢滴加于SF溶解液中，在磁力搅拌器上慢速搅拌，室温反应得到SF/TK复合溶液。
将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。
本发明所述无水乙醇的浓度优选为0.5～1.5M；所述聚乙烯醇的浓度优选为5～60mg/mL，更优选为10～50mg/mL，聚乙烯醇的分子量为3～7万；
本发明所述冷冻具体优选为：-20℃冷冻8～48h；更优选为-20℃冷冻10～48h；
所述解冻为20℃～30℃解冻；
所述离心为13000rpm离心；
所述沉淀物冷冻干燥具体为：将沉淀物-20～-80℃预冷冻2～6h后冻干8～16h。
本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
本发明对于上述制备方法已经有了清楚的描述，在此不再赘述。
本发明提供了上述任意一项所述的制备方法制备得到的功能丝素蛋白药物载体在担载抗肿瘤/抗炎药物中的应用。
其中，抗肿瘤/抗炎药物包括但不限于喜树碱。
本发明提供了一种载药纳米粒子，包括药物和上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的功能丝素蛋白药物载体。
当药物存在时，在制备载药纳米粒子时，最后步骤C)将变为：
在搅拌条件下向上述SF/TK复合溶液中加入抗肿瘤药物喜树碱，再加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌混合均匀，冷冻。室温下溶解、洗涤、离心，将离心管底端的沉淀物冷冻干燥，得到载药SF/TK纳米粒子。本发明所述无水乙醇的浓度优选为0.5～1.5M；所述聚乙烯醇的浓度优选为5～60mg/mL，更优选为10～50mg/mL，聚乙烯醇的分子量为3～7万；
本发明提供了一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，包括：A)将家蚕蚕丝脱胶、溶解、透析过滤凝缩得到丝素蛋白溶解液；B)将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应，得到反应后的溶液；C)将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。本发明SF/TK纳米粒子中引入了较多的具有ROS响应的分子TK，TK以其端部的双活性官能团羧基分别与SF分子链上大量的羟基共价结合，桥接于SF分子之间。在肿瘤和炎症病变治疗中，经肿瘤或炎症细胞吞噬后因胞中高浓度氧的穿透作用，SF/TK纳米粒子中TK分子的C-S键断裂使SF分子间共价键断裂，纳米粒子内部分子间裂解，从而纳米粒子中的药物迅速释放出来，定向杀死肿瘤和炎症细胞，同时进入正常细胞中的纳米粒子其不裂解或裂解程度很小，仅依赖于渗透释放或降解后释放，被代谢前药物释放很少很慢，对正常细胞的杀伤极小。另外，选用的与人体组成相同的20种α-氨基酸组成的SF作为载药纳米粒子主体，进入人体后无毒副作用，是一种理想的药物递送载体。SF可通过制备技术调节纳米粒子的结晶结构，从而调控药物的渗透释放与降解释放，降低纳米粒子代谢排出前释放于正常细胞中的药物量，是一种符合定向治疗炎症和肿瘤的药物递送载体。
再有，SF分子具有亲水和疏水的两性链段，不仅具有正电荷的氨基和负电荷的羧基，还具有大量的羟基用于改性，本发明提出利用SF分子上含有的最多的官能团羟基来制备ROS响应的载药SF/TK纳米粒子。基于SF分子的化学结构特征，可以加载各种不同表面性质的药物，所以本发明的SF智能ROS响应药物递送载体对于大多数炎症和肿瘤疾病的治疗具有很大的应用前景。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种功能丝素蛋白药物载体及其制备方法进行详细描述。
实施例1
(1)称取一定量的生丝，按浴比1:50(w:v)量取去离子水，往冷水中加入Na2CO3(wt0.06％)搅拌均匀，待水煮沸后加入生丝脱胶，30分钟后取出搓洗，放入锅中再次煮沸脱胶，重复3次。将脱胶后的丝置于电热恒温干燥箱中，60℃烘干，扯至蓬松，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
(2)称取一定量的脱胶丝素纤维，剪碎放入9.3M的溴化锂溶液中65±2℃加热搅拌1小时得到家蚕SF溶解液。将家蚕SF溶解液灌注于透析袋中置于盛有去离子水的容器内透析得到纯化后的家蚕SF水溶液，调整透析后的SF水溶液浓度为10～200mg/mL。
(3)称取一定量3-巯基丙酸和无水丙酮混合，加入浓盐酸，室温下密封搅拌6小时。将混合溶液置于冰浴中，急速冷却发生淬灭反应，直到全部变成白色晶体沉淀为止。将晶体过滤并洗涤三次。最后，离心洗涤，倒掉上清液，将沉淀物在-80℃冰箱冻4小时后，冷冻干燥机干燥12小时，获得ROS可裂解的两端带有羧基的TK。
(4)将制得的TK溶于去离子水配置成0.1～0.5mg/mL，向TK溶液里慢慢滴加摩尔比是TK的2～2.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，随后在4℃水浴中反应10分钟，以活化羧基。按SF：TK质量比为100:(1～5)将活化后的TK缓慢滴加于SF水溶液中，在磁力搅拌器上慢速搅拌，室温下反应1小时，得到SF/TK复合溶液。
(5)在搅拌条件下向上述SF/TK复合溶液中加入终浓度0.1～1mg/mL抗肿瘤药物喜树碱，再按体积比加入无水乙醇(VSF/TK:V乙醇＝5:1)，然后加入2％聚乙烯醇溶液，体积V聚乙烯醇＝2(VSF/TK+V乙醇)，搅拌混合均匀，放置于-20℃冰箱冷冻48小时后取出。室温下溶解、洗涤、离心，将离心管底端的沉淀物-80℃冷冻3小时，然后冷冻干燥12小时，得到载药SF/TK纳米粒子。
(6)将制备得到的包载喜树碱的纳米粒子漂洗后进行载药能力的测试，检测365nm处的喜树碱的吸光度值，经过计算SF/TK载药纳米粒子的载药率和包封率分别为1.5～7.5％和40～70％。
实施例2
(1)称取一定量的生丝，按浴比1:50(w:v)量取去离子水，往冷水中加入Na2CO3(wt0.06％)搅拌均匀，待水煮沸后加入生丝脱胶，30分钟后取出搓洗，放入锅中再次煮沸脱胶，重复3次。将脱胶后的丝置于电热恒温干燥箱中，60℃烘干，扯至蓬松，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
(2)称取一定量的脱胶丝素纤维，剪碎放入9.3M的溴化锂溶液中65±2℃加热搅拌1小时得到家蚕SF溶解液。将家蚕SF溶解液灌注于透析袋中置于盛有去离子水的容器内透析得到纯化后的家蚕SF水溶液，调整透析后的SF水溶液浓度为10～200mg/mL。
(3)称取一定量3-巯基丙酸和无水丙酮混合，加入浓盐酸，室温下密封搅拌6小时。将混合溶液置于冰浴中，急速冷却发生淬灭反应，直到全部变成白色晶体沉淀为止。将晶体过滤并洗涤三次。最后，离心洗涤，倒掉上清液，将沉淀物在-80℃冰箱冻4小时后，冷冻干燥机干燥12小时，获得ROS可裂解的两端带有羧基的TK。
(4)将制得的TK溶于去离子水配置成0.1～0.5mg/mL，向TK溶液里慢慢滴加摩尔比是TK的2～2.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，随后在4℃水浴中反应10分钟，以活化羧基。按SF：TK质量比为100:3将活化后的TK缓慢滴加于SF水溶液中，在磁力搅拌器上慢速搅拌，室温下反应1小时，得到SF/TK复合溶液。
(5)在搅拌条件下向上述SF/TK复合溶液中加入终浓度0.5mg/mL抗肿瘤药物喜树碱，再按体积比加入无水乙醇(VSF/TK:V乙醇＝5:1)，然后加入2％聚乙烯醇溶液，体积V聚乙烯醇＝2(VSF/TK+V乙醇)，搅拌混合均匀，放置于-20℃冰箱冷冻48小时后取出。室温下溶解、洗涤、离心，将离心管底端的沉淀物-80℃冷冻3小时，然后冷冻干燥12小时，得到载药SF/TK纳米粒子。
(6)将制备得到的包载喜树碱的SF/TK纳米粒子漂洗后进行氧裂解前后的粒径测试，SF/TK载药纳米粒子的粒径随着50mM的KO2溶液处理时间的增加呈递减趋势，处理16小时后，从最初的426nm减小到了257nm，即SF/TK纳米粒子中的TK遇到氧环境，化学键断裂释放，从内部破坏了纳米粒子，再次冻干后发生了严重收缩，及裂解导致纳米粒子破碎，说明该SF/TK载药纳米粒子可以在氧环境下发生裂解。
(7)将制备得到的包载喜树碱的SF/TK纳米粒子在氧处理环境中观察其药物释放行为，在氧环境中，SF/TK载药纳米粒子释药较快，尤其是前12小时，随后释放有所平缓。氧处理8小时，SF/TK载药纳米粒子的累计释药率达到47％左右，48小时后，SF/TK载药纳米粒子的累积释药率约为72％，显著高于对比例的释药率。SF/TK载药纳米粒子在非氧环境中48小时药物释放量远小于其在氧环境中的释放量。即SF/TK纳米粒子在氧环境中因TK响应断裂，使得SF/TK纳米粒子能快速释放药物，具有显著的ROS响应性能。
实施例3
(1)称取一定量的生丝，按浴比1:50(w:v)量取去离子水，往冷水中加入Na2CO3(wt0.06％)搅拌均匀，待水煮沸后加入生丝脱胶，30分钟后取出搓洗，放入锅中再次煮沸脱胶，重复3次。将脱胶后的丝置于电热恒温干燥箱中，60℃烘干，扯至蓬松，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
(2)称取一定量的脱胶丝素纤维，剪碎放入9.3M的溴化锂溶液中65±2℃加热搅拌1小时得到家蚕SF溶解液。将家蚕SF溶解液灌注于透析袋中置于盛有去离子水的容器内透析得到纯化后的家蚕SF水溶液，调整透析后的SF水溶液浓度为10～200mg/mL。
(3)称取一定量3-巯基丙酸和无水丙酮混合，加入浓盐酸，室温下密封搅拌6小时。将混合溶液置于冰浴中，急速冷却发生淬灭反应，直到全部变成白色晶体沉淀为止。将晶体过滤并洗涤三次。最后，离心洗涤，倒掉上清液，将沉淀物在-80℃冰箱冻4小时后，冷冻干燥机干燥12小时，获得ROS可裂解的两端带有羧基的TK。
(4)将制得的TK溶于去离子水配置成0.1～0.5mg/mL，向TK溶液里慢慢滴加摩尔比是TK的2～2.5倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，随后在4℃水浴中反应10分钟，以活化羧基。按SF：TK质量比为100:5将活化后的TK缓慢滴加于SF水溶液中，在磁力搅拌器上慢速搅拌，室温下反应1小时，得到SF/TK复合溶液。
(5)在搅拌条件下向上述SF/TK复合溶液中加入终浓度0.5mg/mL抗肿瘤药物喜树碱，再按体积比加入无水乙醇(VSF/TK:V乙醇＝5:1)，然后加入2％聚乙烯醇溶液，体积V聚乙烯醇＝2(VSF/TK+V乙醇)，搅拌混合均匀，放置于-20℃冰箱冷冻48小时后取出。室温下溶解、洗涤、离心，将离心管底端的沉淀物-80℃冷冻3小时，然后冷冻干燥12小时，得到载药SF/TK纳米粒子。
(6)将制备得到的包载喜树碱的SF/TK纳米粒子漂洗后进行氧裂解前后的粒径测试，SF/TK载药纳米粒子的粒径随着50mM的KO2溶液处理时间的增加呈递减趋势，处理16小时后，从最初的532nm减小到了315nm，即SF/TK纳米粒子中的TK遇到氧环境，化学键断裂释放，从内部破坏了纳米粒子，再次冻干后发生了严重收缩，及裂解导致纳米粒子破碎，说明该SF/TK载药纳米粒子可以在氧环境下发生裂解。
(7)将制备得到的包载喜树碱的SF/TK纳米粒子在氧处理环境中观察其药物释放行为，在氧环境中，SF/TK载药纳米粒子释药较快，尤其是前12小时，随后释放有所平缓。氧处理8小时，SF/TK载药纳米粒子的累计释药率达到59％左右，48小时后，SF/TK载药纳米粒子的累积释药率约为81％，显著高于对比例的释药率。SF/TK载药纳米粒子在非氧环境中48小时药物释放量远小于其在氧环境中的释放量。即SF/TK纳米粒子在氧环境中因TK响应断裂，使得SF/TK纳米粒子能快速释放药物，具有显著的ROS响应性能。
对比例1
(1)称取一定量的生丝，按浴比1:50(w:v)量取去离子水，往冷水中加入Na2CO3(wt0.06％)搅拌均匀，待水煮沸后加入生丝脱胶，30分钟后取出搓洗，放入锅中再次煮沸脱胶，重复3次。将脱胶后的丝置于电热恒温干燥箱中，60℃烘干，扯至蓬松，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
(2)称取一定量的脱胶丝素纤维，剪碎放入9.3M的溴化锂溶液中65±2℃加热搅拌1小时得到家蚕SF溶解液。将家蚕SF溶解液灌注于透析袋中置于盛有去离子水的容器内透析得到纯化后的家蚕SF水溶液，调整透析后的SF水溶液浓度为10～200mg/mL。
(3)与上述实施例同比例向SF水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，随后在4℃水浴中反应10分钟，再在室温下搅拌反应1小时。向上述SF反应液中加入终浓度0.5mg/mL抗肿瘤药物喜树碱，再按体积比加入无水乙醇(VSF:V乙醇＝5:1)，然后加入2％聚乙烯醇溶液，体积V聚乙烯醇＝2(VSF+V乙醇)，搅拌混合均匀，放置于-20℃冰箱冷冻48小时后取出。室温下溶解、洗涤、离心，将离心管底端的沉淀物-80℃冷冻3小时，然后冷冻干燥12小时，得到载药SF纳米粒子。
(4)制备得到的包载喜树碱的纯SF纳米粒子的载药能力与SF/TK纳米粒子相当。将制备得到的包载喜树碱的SF纳米粒子漂洗后进行氧裂解前后的粒径测试，SF载药纳米粒子的粒径随着50mM的KO2溶液处理时间的增加呈先增加后稍有减小的趋势，SF载药纳米粒子的初始平均粒径为325nm，随着氧处理的时间增加到2小时，SF载药纳米粒子的粒径因吸水溶胀增加到400nm，氧处理16小时后减小到370nm，仍然大于原始颗粒的粒径，说明SF载药纳米粒子没有发生明显的裂解。
(5)将制备得到的包载喜树碱的SF纳米粒子在氧处理环境中观察其药物释放行为，在氧环境中，SF载药纳米粒子释药较缓慢，48小时后，SF载药纳米粒子的累积释药率小于40％。SF载药纳米粒子在非氧环境中48小时药物释放量接近于其在氧环境中的释放量，说明纯SF载药纳米粒子没有明显的ROS响应性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种功能丝素蛋白药物载体的制备方法，其特征在于，包括：
A)将家蚕蚕丝脱胶、溶解、透析、过滤、浓缩得到丝素蛋白溶解液；
B)将两端带有羧基的酮缩硫醇用交联剂活化，再与SF溶解液混合反应，得到反应后的溶液；
C)将反应后的溶液加入无水乙醇和聚乙烯醇的混合体系搅拌、冷冻、解冻、离心，最后将沉淀物冷冻干燥即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述脱胶为采用碳酸钠或碳酸氢钠进行脱胶；所述溶解为采用溴化锂进行溶解；所述透析的截留分子量为10～50kDa；所述丝素蛋白溶解液的浓度为10～200mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述两端带有羧基的酮缩硫醇的制备方法具体为：
3-巯基丙酸和无水丙酮的混合物在酸性条件下反应，制备的晶体经洗涤、离心、冻干获得两端带有羧基的TK；
所述3-巯基丙酸和无水丙酮的摩尔比为1：1.5～2.5；所述酸性条件为盐酸；所述盐酸的浓度为7～8M；所述反应具体为20～30℃反应4～8小时；所述冻干具体为：-20～-80℃预冷冻2～6小时后冻干8～16小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述丝素蛋白和两端带有羧基的酮缩硫醇质量比为100:0.5～20；所述两端带有羧基的酮缩硫醇的溶解溶剂为水。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶；所述交联剂的添加量为两端带有羧基的酮缩硫醇的2～2.5倍；
所述活化反应温度为4～6℃；
所述反应温度为20～30℃，所述反应时间为10～60min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C)所述无水乙醇的浓度为0.5～1.5M；所述聚乙烯醇的浓度为5～60mg/mL，聚乙烯醇的分子量为3～7万；
所述冷冻具体为：-20℃冷冻8～48h；所述解冻为20～30℃解冻；
所述离心为13000rpm离心；
所述沉淀物冷冻干燥具体为：将沉淀物-20～-80℃预冷冻2～6h后冻干8～16h。
7.一种功能丝素蛋白药物载体，其特征在于，由权利要求1～6任意一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求1～6任意一项所述的制备方法制备得到的功能丝素蛋白药物载体在担载抗肿瘤/抗炎药物中的应用。
9.一种载药纳米粒子，包括药物和权利要求1～6任意一项所述的制备方法制备得到的功能丝素蛋白药物载体。
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