CN110354273B - Ros响应型纳米颗粒及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ROS响应型纳米颗粒及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的应用，利用ROS敏感分子TL连接抗肿瘤药物PTX及亲水片段NH2‑PEG1K‑NH2，得到两亲性ROS敏感片段PTX‑TL‑PEG1K‑NH2，随后利用超声乳化法得到负载敏化剂IR780的ROS响应型纳米颗粒；制备得到的纳米颗粒可以在外界超声的作用下产生ROS，不仅杀伤肿瘤细胞，而且可以使纳米颗粒释放PTX杀伤肿瘤细胞，从而在声动力治疗肿瘤中形成级联放大协同效应，实现肿瘤精准治疗。

Description

ROS响应型纳米颗粒及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的 应用
技术领域
本发明涉及具有声动力级联放大协同作用的肿瘤治疗药物制剂，具体涉及一种活性氧(ROS)响应型混合纳米颗粒的制备方法。
背景技术
目前癌症的治疗仍以化疗为主，提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用是提高化疗效果的关键。近年来，纳米技术为肿瘤治疗带来了崭新思路和观念性变革。纳米载体可为药物靶向递送并特异性作用于肿瘤细胞提供手段。由于纳米粒子的小尺寸效应、表面效应、体积效应和量子效应，为肿瘤的诊断和治疗提供基础。肿瘤组织不健全的微血管和淋巴回流系统导致的高通透高滞留效应(EPR)，使得一定粒径范围内的纳米材料通过被动靶向易于聚集在肿瘤区域。此外，纳米载体的尺寸和形状也在避免各种清除机制的影响中发挥作用。
纳米技术在癌症精确诊断和高效治疗方面的研究已成为热点。设计和构建"刺激-响应型"的多功能纳米药物可控释放体系，利用纳米载体将药物选择性地输送到病变部位，并在外部物理刺激或者肿瘤特有的微环境、标志物的化学刺激下，将药物可控地释放，以及借助纳米载体进行影像引导肿瘤部位的治疗，已成为提高癌症治疗效果的有效手段。
刺激-响应型药物递送由于具有特定环境响应的特性，可以实现在特定位点、特定时间、按需释放特定药量的药物。利用超声可以对药物释放实现有效的时空控制，从而减少对健康组织产生的毒副作用。例如，声动力疗法(SonodynamicTherapy，SDT)利用在肿瘤组织中特异性富集并长时间滞留的敏化剂，在超声刺激下产生过氧基、烷氧基等活性氧物质，并借助其具有的细胞杀伤效应杀伤肿瘤细胞，具有局部精准、微创/无创、对正常组织无损伤等优点。
目前纳米抗肿瘤药物主要是将药物负载在纳米载体内部，载药纳米颗粒进入肿瘤组织中聚集时，通过缓释作用在肿瘤组织内进行药物释放，但是这类载药纳米颗粒负载的药物往往具有一定毒性，而且其在其他正常组织中都会自发发生不同程度的药物释放行为，因此，在可控释药、降低毒性、提高治疗效果方面仍有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ROS响应型纳米颗粒及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种ROS响应型纳米颗粒，该纳米颗粒包括两亲性脂质材料(例如，DSPE-PEG-NH2)及ROS响应型两亲性片段，所述ROS响应型两亲性片段包括连接于ROS敏感基团一端的疏水性药物分子，以及连接于所述ROS敏感基团另外一端的亲水片段(该亲水片段可以是PEG，也可以是其他亲水片段)；所述两亲性脂质材料的疏水嵌段与ROS响应型两亲性片段中的疏水端(即连接疏水性药物分子的一端)自主装为纳米颗粒体的疏水内核，两亲性脂质材料的亲水嵌段与ROS响应型两亲性片段中的亲水端(即连接亲水片段的一端)构成纳米颗粒体的亲水外壳；所述纳米颗粒体的疏水内核中负载有用于在受到外部刺激下产生ROS的敏化剂。
优选的，所述ROS敏感基团选自对单线态氧、羟自由基、超氧阴离子等ROS敏感的(例如，可以在ROS存在的条件下发生断裂)化合物(例如，酮缩硫醇等)的残基。
优选的，所述敏化剂选自在超声刺激下可以产生ROS的脂溶性敏化剂，例如，IR780。
优选的，所述纳米颗粒的粒径为90～110nm。
优选的，所述ROS响应型两亲性片段的分子式为：
Figure BDA0002130674730000021
其中，R1选自通过氨基或者羟基与酮缩硫醇缩合所形成的疏水性药物分子(例如，紫衫醇)的残基；R2选自通过氨基或者羧基与酮缩硫醇缩合所形成的亲水片段(例如，NH2-PEGx-NH2，其中x为1K～3K)的残基。所述ROS响应型两亲性片段不仅通过疏水性药物分子与酮缩硫醇的缩合，转变为前体药物，而且该ROS响应型两亲性片段与DSPE-PEG-NH2通过自组装，阻隔了纳米颗粒外部的ROS对内部ROS敏感基团的作用，使得纳米颗粒中药物的释放仅与疏水内核中敏化剂所产生的ROS有关，从而可以显著改善释药可控性、降低药物对正常组织的毒性，以及提高药物治疗效果。
优选的，所述DSPE-PEG-NH2具体选自DSPE-PEGx-NH2(x＝1K～3K)，当x＝2K时，可以更有效的增强纳米颗粒在体内的循环时间。
优选的，所述纳米颗粒中疏水性药物分子与敏化剂的等效摩尔比为(1～3):(1～5)。
上述ROS响应型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)将含有氨基或者羟基的疏水性药物分子(例如，紫衫醇)与对单线态氧、羟自由基、超氧阴离子等ROS敏感的(例如，可以在ROS存在的条件下发生断裂)化合物(例如，酮缩硫醇)，采用缩合反应制备得到与所述疏水性药物分子对应的前体药物；
2)将所述前体药物(具体利用上述与疏水性药物分子缩合的对ROS敏感的化合物，例如，酮缩硫醇)与含有氨基或者羧基的亲水片段(例如，NH2-PEGx-NH2，其中x为1K～3K)，采用缩合反应制备得到ROS响应型两亲性片段；
3)将ROS响应型两亲性片段与两亲性脂质材料(例如，DSPE-PEG-NH2)通过自组装(利用两亲性特性)共同形成纳米颗粒体，并在自组装过程中将可以在受到外部刺激下产生ROS的敏化剂(例如，IR780)负载在纳米颗粒体的疏水内核中，得到ROS响应型纳米颗粒，载药率按照疏水性药物分子(例如，紫衫醇)计算为22％～39％。
优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：
1.1)将酮缩硫醇(TL)与三乙胺(TEA)、2,4,6-三氯苯酰氯(TC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)于有机溶剂(例如，无水二甲基甲酰胺，即无水DMF)中混合后于20～25℃搅拌0.5～1h得到反应体系A；
1.2)将紫杉醇(PTX)等疏水性药物分子加入到反应体系A中后于20～25℃搅拌20～24h，然后依次经去离子水萃取、二氯甲烷提取、盐水洗涤、NaSO4干燥、硅胶层析纯化及冷冻干燥得到反应物(PTX-TL)。
优选的，所述TL:TEA:TC:DMAP:PTX的摩尔比为(0.5～1):(1～2):(1.5～6):(0.5～2):(0.5～1)，利用TL所含的羧基和PTX所含的羟基进行缩合反应，保证所述PTX可以绝大部分连接在TL，得到含有TL的紫杉醇前体药物，即PTX-TL。
优选的，所述步骤2)具体包括以下步骤：
2.1)将反应物(PTX-TL)与TEA、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)及羟基苯并三唑(HOBT)于有机溶剂(例如，无水DMF)中混合后于20～25℃搅拌0.5～1h，得到反应体系B；
2.2)将NH2-PEGx-NH2(x＝1K～3K)加入到反应体系B中后于20～25℃搅拌20～24h，得到溶液；将该溶液加入水中后于20～25℃搅拌6～8h，然后依次经透析、冷冻干燥得到ROS响应型两亲性片段(PTX-TL-PEG-NH2)。
优选的，所述PTX-TL:TEA:EDCI:HOBT:NH2-PEGx-NH2的摩尔比为(0.5～1.5):(1～4):(1.5～3):(0.5～2):(1～2)，利用PTX-TL所含的羧基和NH2-PEGx-NH2进行缩合反应，保证PTX-TL可以绝大部分连接在NH2-PEGx-NH2。
优选的，所述步骤3)具体包括以下步骤：将ROS响应型两亲性片段(PTX-TL-PEG-NH2)、DSPE-PEG-NH2及敏化剂(例如，IR780)于有机溶剂(例如，DMSO)中混合后加入水中，然后依次经超声乳化、离心得到溶液；将该溶液依次经透析、冷冻干燥，得到ROS响应型纳米颗粒。
优选的，所述ROS响应型两亲性片段(PTX-TL-PEG-NH2):DSPE-PEG-NH2:敏化剂(例如，IR780)的质量比为(1～10):(0.5～2):(1～3)。
优选的，所述超声乳化的条件为：超声功率为200～300W，超声处理时间为3～5min，处理温度为0～4℃(例如，冰浴)。
优选的，所述透析的条件为：透析袋采用的截留分子量为1～3.5kDa，透析时间为2～3天，透析液采用去离子水。
上述ROS响应型纳米颗粒在制备声动力抗肿瘤药物中的应用，该ROS响应型纳米颗粒利用所负载的敏化剂(在外部刺激下可在纳米颗粒的疏水内核产生ROS)及ROS响应型两亲性片段(在上述ROS作用下实现前体药物到药物的转换并释放药物)的级联放大协同作用，实现对肿瘤的精准治疗。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用ROS敏感基团(例如，TL残基)连接抗肿瘤药物(例如，PTX)和亲水片段(例如，NH2-PEGX-NH2)得到含有前体药物的两亲性ROS敏感片段(例如，PTX-TL-PEG-NH2)，随后利用超声乳化法得到负载敏化剂(例如，IR780)的ROS响应型纳米颗粒；制备得到的纳米颗粒可以在外界刺激下(例如，超声的作用下)产生ROS，产生的ROS不仅可以靶向杀伤肿瘤细胞，而且可以破坏前体药物中的ROS敏感基团，并释放药物(例如，PTX)杀伤肿瘤细胞；在声动力治疗肿瘤中具有级联放大协同效应，实现肿瘤精准治疗。同时，本发明制备得到的纳米颗粒在水溶液中性质稳定，便于保存。
进一步的，本发明采用化学合成方法，将抗肿瘤药物连接在ROS敏感基团上，制备出紫杉醇前体药物PTX-TL，该前体药物具有较强的稳定性，在体内循环中处于失活状态，避免药物提前释放(主要由颗粒内产生的ROS的作用下释放药物)，对正常组织无毒副作用。
进一步的，本发明制备得到的纳米颗粒，粒径为90～110nm，能够更大程度通过肿瘤EPR效应达到肿瘤部位，实现药物在肿瘤部位的最大化富集。
本发明制备得到的纳米颗粒，能够在ROS存在的条件下，快速切割ROS敏感基团(例如，TL残基)，使得药物在特定窗口按需释放，达到最大化治疗肿瘤效应。在超声作用下敏化剂(例如，IR780)产生的ROS不仅可以靶向杀伤肿瘤细胞，而且可以破坏ROS敏感基团，释放药物(例如，PTX)杀伤肿瘤细胞；在声动力治疗肿瘤(比如，脑胶质瘤、乳腺癌、淋巴瘤、大肠癌、肺癌等)中具有级联放大协同效应，提高治疗效果。
附图说明
图1为PTX-TL-PEG1K-NH2的核磁氢谱图。
图2为制备得到的ROS响应型纳米颗粒的透射电镜图。
图3为制备得到的ROS响应型纳米颗粒的粒径分布图。
图4为制备得到的ROS响应型纳米颗粒稳定性检测图。
图5为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用下的药物释放检测图。
图6为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用下的ROS产生情况检测图
图7为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用下的硫基降解率检测图。
图8为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用后的透射电镜图。
图9为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用下的细胞毒性图。
图10为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用下对肿瘤生长抑制作用的曲线图。
图11为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在超声作用下对肿瘤生长抑制作用的解剖图。
图12为制备得到的ROS响应型纳米颗粒在体内组织(心：Heart，肝：Liver，脾：Spleen，肺：Lung，肾：Kidney)的毒理图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例用于帮助理解本发明，不应视为对本发明保护范围的限制。
(一)制备PTX-TL-PEG1K-NH2
将1.0mmol TL溶解在4mL无水DMF中，随后将2mmol TEA、6mmol TC及2mmol DMAP溶解在5mL无水DMF中，随后将TL溶液与TEA-TC-DMAP溶液混合，室温搅拌30min，得到反应体系A；将0.5mmoL PTX溶解在2mL无水DMF中后滴加到反应体系A中，室温搅拌24h，随后经去离子水萃取将反应得到的化合物转移到去离子水中、二氯甲烷提取、饱和生理盐水洗涤、NaSO4干燥、硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇，V:V，20:1～10:1)，及冻干，得到反应物PTX-TL。
将0.5mmoL的PTX-TL溶解在4mL无水DMF中，随后将2mmoL TEA、1mmoL EDCI及1mmoLHOBT溶解在5mL无水DMF中；将PTX-TL溶液与TEA-EDCI-HOBT溶液混合，室温搅拌30min，得到反应体系B；将0.5mmoL的NH2-PEG1K-NH2溶解在2mL无水DMF中后滴加到反应体系B中，室温搅拌24h，搅拌完后，将所得溶液滴加到50mL去离子水中，室温搅拌6h，去离子水中透析(MWCO＝3.5kDa)2天，冻干，得到产物PTX-TL-PEG1K-NH2。利用核磁氢谱进行合成鉴定(参见图1)，结果显示，在1.51ppm和1.57ppm出现TL的特征峰，3.40ppm和3.57ppm处出现PEG1K的特征峰，5.64ppm和4.11ppm处出现PTX的特征峰，以上结果表明成功合成PTX-TL-PEG1K-NH2。
(二)制备ROS响应型纳米颗粒(IR780/PTL-NPs)
将10mg PTX-TL-PEG1K-NH2溶解在0.8mL DMSO中，将2mg DSPE-PEG1K-NH2溶解在0.4mL DMSO，将2mg IR780溶解在0.8mL DMSO中，将PTX-TL-PEG1K-NH2溶液、DSPE-PEG1K-NH2溶液、IR780溶液三者混合均匀后滴加到10mL去离子水中，利用超声乳化法(200W，3min)冰浴处理，离心取上清，将上清用去离子水透析(MWCO＝3.5kDa)3天，得到ROS响应型纳米颗粒分散液。采用透射电镜和激光粒度仪测定纳米颗粒的形貌和粒径，结果显示所制备的纳米颗呈圆球状，分散均一，电镜显示其粒径大约为100nm左右，激光粒度仪测定纳米颗粒的粒径约为110nm左右，与电镜结果相符合，证明成功合成纳米颗粒(参见图2和图3)。
(三)评价ROS响应型纳米颗粒的稳定性
将制备得到的ROS响应型纳米颗粒，分别放置在4℃和37℃，每隔一天取样，采用激光粒度仪测定纳米颗粒的粒径，通过粒径的改变来反映纳米颗粒的稳定性，结果显示在不同储存条件下纳米颗粒在2周内粒径没有明显变化，说明所制备得到的ROS响应型纳米颗粒具有良好的稳定性(参见图4)。
(四)评价ROS响应型纳米颗粒在超声作用下的药物释放行为取新鲜制备得到的ROS响应型纳米颗粒，放置在聚焦超声焦点位置，实验中所采用的超声装置主要参数为：频率1.0MHz，占空比5％。采用不同的超声强度(US0-0W/cm2，US1-0.2W/cm2，US2-0.3W/cm2，US3-0.4W/cm2)，超声处理3min，随后采用透析法测定药物释放率，结果显示在超声作用下，IR780/PTL-NPs中药物PTX能够快速释放，且随着超声强度的增加，药物释放明显加快(参见图5)，而在没有IR780负载的情况下(PTL-NPs)结合超声处理，药物释放速率明显降低，表明超声刺激IR780产生的ROS能够快速切割ROS敏感基团(TL残基)，导致ROS响应型纳米颗粒快速释放药物PTX。其中PTL-NPs指没有负载IR780的纳米颗粒，其制备方法可参考(除了不使用IR780)制备IR780/PTL-NPs纳米颗粒的方法。
(五)评价ROS响应型纳米颗粒在超声作用下ROS的产生量
取新鲜制备得到的ROS响应型纳米颗粒，加入ROS探针DCFH-DA后放置在聚焦超声焦点处进行超声处理，超声装置与(四)相同，选用US3为超声强度，随后采用荧光光度法在525nm处测定DCF荧光强度，结果显示，在超声作用下，ROS响应型纳米颗粒能够产生大量的活性氧簇，在有自由基抑制剂NaN3存在的条件下，产生的ROS明显降低(参见图6，其中FreeIR780指的游离IR780)，表明ROS确实来自于颗粒内部的IR780。
(六)评价ROS响应型纳米颗粒在超声作用硫基的降解率
取新鲜制备得到的ROS响应型纳米颗粒，采用Ellman's法测定其在超声作用下的硫基降解率，结果显示，在US3处理3min的条件下，硫基的降解率增加，进一步说明，在SDT作用下，ROS响应型纳米颗粒中的酮缩硫醇残基发生断链(参见图7)。
(七)评价ROS响应型纳米颗粒在超声作用后的形貌分布
取新鲜制备得到的ROS响应型纳米颗粒，经过US3超声处理3min之后，静置避光，随后利用透射电镜观察超声处理后的纳米颗粒的形貌，结果显示经过超声处理之后，ROS响应型纳米颗粒呈现弥散分布，且粒径较未处理之前有明显增加(参见图8)，表明ROS作用能够导致纳米颗粒发生崩解，释放药物。
(八)考察ROS响应型纳米颗粒在声动力精准治疗肿瘤中的级联放大协同作用
将U87肿瘤细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，待细胞完全伸展，用含有药物的纳米颗粒(PTL-NPs和IR780/PTL-NPs)和游离IR780孵育细胞2h(PTX:0.8μg/mL，IR780:3.04μg/mL)，随后更换培养基，超声处理(参数和装置同(四)一致)，之后孵育细胞22h，孵育完毕后，用CCK-8检测细胞毒性，结果显示在没有超声作用之前，ROS响应型纳米颗粒没有明显的细胞毒性，而超声作用之后，ROS响应型纳米颗粒具有明显的细胞毒性，且细胞毒性随超声强度的增加而增强(参见图9，具有显著性差异)。
(九)考察ROS响应型纳米颗粒的肿瘤治疗效果以及安全性评价
取体重为18-20g的BABL/c磁性裸鼠30只，皮下接种U87肿瘤细胞，待肿瘤长到50mm3左右，随机分为5组(1#：PBS+US3；2#：PTL-NPs；3#：PTL-NPs+US3；4#：IR780/PTL-NPs；5#：IR780/PTL-NPs+US3)，尾静脉注射ROS响应型纳米颗粒(PTX：1mg/kg，IR780：3.8mg/kg)，注射24h后进行超声处理(US3，3min)，每隔2天对肿瘤体积用游标卡尺进行测量，治疗17天后，处死小鼠，解剖出肿瘤以及主要脏器，对肿瘤组织进行拍照。结果如图10及图11所示，结果表明ROS响应型纳米颗粒能够高效的抑制肿瘤生长。此外，对主要脏器进行H&E染色，并进行安全性初步评估，结果如图12所示，H&E染色结果显示，ROS响应型纳米颗粒对机体不同组织均没有明显的毒副作用，生物安全性良好。

Claims (7)

1.一种ROS响应型纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒包括两亲性脂质材料及ROS响应型两亲性片段，所述两亲性脂质材料为DSPE-PEG-NH2，所述ROS响应型两亲性片段的分子式为：
Figure 714993DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1为通过羟基与酮缩硫醇缩合所形成的疏水性药物紫衫醇分子的残基；R2为通过氨基与酮缩硫醇缩合所形成的亲水片段NH2-PEGx-NH2的残基，其中x为1K~3K；所述两亲性脂质材料与ROS响应型两亲性片段自主装为纳米颗粒体；所述纳米颗粒体中负载有用于在受到外部刺激下产生ROS的敏化剂；
所述敏化剂为在超声刺激下产生ROS的脂溶性敏化剂IR780。
2.根据权利要求1所述一种ROS响应型纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒的粒径为90~110 nm。
3.一种如权利要求1所述的ROS响应型纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将含有羟基的疏水性药物紫衫醇分子与对ROS敏感的化合物酮缩硫醇，采用缩合反应制备得到与所述疏水性药物紫衫醇分子对应的前体药物；
2）将所述前体药物利用上述对ROS敏感的化合物，与含有氨基的亲水片段，采用缩合反应制备得到ROS响应型两亲性片段；
3）将ROS响应型两亲性片段与两亲性脂质材料通过自组装共同形成纳米颗粒体，并在自组装过程中将在受到超声刺激下产生ROS的敏化剂IR780负载在纳米颗粒体中，得到ROS响应型纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的ROS响应型纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤1）具体包括以下步骤：将所述酮缩硫醇与三乙胺、2, 4, 6-三氯苯酰氯及4-二甲氨基吡啶于有机溶剂中混合后于20~25℃搅拌0.5~1 h得到反应体系A；将含有羟基的疏水性药物分子加入到反应体系A中后于20~25℃搅拌20~24 h，然后分离得到前体药物。
5.根据权利要求3所述的ROS响应型纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤2）具体包括以下步骤：将所述前体药物与三乙胺、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及羟基苯并三唑于有机溶剂中混合后于20~25℃搅拌0.5~1 h，得到反应体系B；将NH2-PEGx-NH2加入到反应体系B中后于20~25℃搅拌20~24 h，得到溶液，其中，x为1K~3K；将该溶液加入水中后于20~25℃搅拌6~8 h，然后分离得到ROS响应型两亲性片段。
6.根据权利要求3所述的ROS响应型纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤3）具体包括以下步骤：将所述ROS响应型两亲性片段、DSPE-PEG-NH2及在超声刺激下产生ROS的脂溶性敏化剂IR780于有机溶剂中混合后加入水中，然后进行超声乳化，然后分离得到ROS响应型纳米颗粒。
7.一种如权利要求1所述的ROS响应型纳米颗粒在制备声动力抗肿瘤药物中的应用。
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