CN106046135A - 具有不同降解速度的丝素蛋白及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有不同降解速度的丝素蛋白，将天然蚕丝纤维使用溴化锂或氯化钙或酸碱处理得到慢速、中速、快速降解的丝素蛋白。经冷冻干燥成型，醇处理得到具有不同降解速度的丝素蛋白支架。本发明通过不同的水解条件可以有效的控制丝素蛋白的降解速度，在神经损伤修复中使神经的再生长速度和支架材料的降解速度同步，研究表明快速、中速降解的丝素蛋白支架具有促进神经损伤修复的功能，以期对周围神经损伤的治疗有较好的疗效。

Description

具有不同降解速度的丝素蛋白及应用
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种具有生物相容性、可生物降解、基于生物大分子多孔的支架材料，可以用作神经损伤修复等组织工程材料、药物缓释载体、基因及高性能复合材料。
背景技术
由交通事故、暴力打击、工业生产事故或者生活中的意外伤害以及手术等导致周围神经系统损伤，在临床上极为常见。周围神经损伤后，相应的神经元胞体会发生一系列形态、生化、代谢及基因表达的改变，这是神经元胞体对轴突损伤的反应。根据轴突损伤的程度，神经元胞体的损伤反应轻重不一，严重者会造成神经元胞体的死亡。进而炎症细侵入，胶质细胞和结缔组织增生，从而造成运动功能障碍、感觉功能障碍、疼痛、皮肤营养性改变、血管功能障碍、骨质疏松等临床症状，给人们的生产生活带来了很大的影响。虽然很多学者和临床医生在这方面也做了许多的努力，但到目前为止，临床上的治疗方法多采用物理疗法比较多，无法达到完全修复的效果。丝素蛋白由于其较好的生物相容性，可降解性以及无毒性被广泛的应用到组织工程领域，特别作为神经损伤修复的支架材料，临床应用也具有较好的修复效果。由于不同的神经损伤部位，其修复的时间长短不一样，因此丝素蛋白的降解速度与神经再生长速度相匹配就显得尤为重要。通常情况下，物质的分子量越大其降解速度越慢，分子量越小，降解速度越慢。天然丝素蛋白的分子量在300KD-500KD之间，通过一定的处理方法得到不同降解速度的丝素蛋白，从而得到与神经再生长速度同步可控的降解速度的丝素蛋白支架成为可能。如果神经的再生长速度慢于丝素的降解速度，就会导致体内异物残留，进而会引起炎症反应，对人体产生一定的疾病连带症状；如果神经的再生长速度快于丝素的降解速度，就会导致后期神经生长无支架支撑，达不到完全修复的效果。由于人体内复杂的生理生化环境，丝素蛋白的降解速度也受材料的结构、形态以及体内的各种蛋白酶的影响，因此对降解过程、机理、影响因素进行完全充分的了解也是目前最主要的问题。
发明内容
本发明主要采用了不同的溶剂水解条件，并对丝素蛋白支架进行降解实验，最终得到具有不同降解速度的丝素蛋白。
本发明的目的在于，提供生物相容，力学性能良好，无毒性，可快速降解的控降解速度的，可以用作神经损伤修复，基于丝素蛋白多孔支架及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
具有不同降解速度的丝素蛋白，将天然蚕丝纤维脱丝胶后使用溴化锂或氯化钙或酸碱水解，得到具有不同降解速度的丝素蛋白，其特征在于①使用溴化锂或氯化钙水解，得到慢速降解的丝素蛋白；②将慢速降解的丝素蛋白进一步使用氯化钙水解得到中速降解的丝素蛋白；③将慢速降解的丝素蛋白进一步使用酸或碱水解得到快速降解的丝素蛋白。
上述天然的蚕丝纤维，是一种大分子的蛋白纤维，所述的大分子蛋白纤维由生物相容的丝素蛋白和丝胶蛋白组成，所述的丝素蛋白与丝胶蛋白的成分比例为17:3～4:1。其中丝素蛋白是蚕丝纤维的只要构成成分和有效成分，丝素蛋白主要有18种氨基酸组成，其中侧基较为简单的甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)约占总组成的85％，三者的摩尔比4:3:1。
天然蚕丝纤维脱丝胶的制备方法为本领域熟知的技术手段，一个优选的方案如下：称取40-50g蚕丝纤维到一定容积的容器中，加入10.18g无水碳酸钠。然后，再向容器中加入2000ml的三蒸水(约0.5％碳酸钠碱性溶液)，用玻璃棒充分搅拌，使无水碳酸钠完全溶解，蚕丝纤维大部分浸没到水中。然后将容器转移到电磁炉上加热，直至煮沸，从煮沸时开始计时，大约蒸煮30min，蒸煮期间用玻璃棒适当搅拌。蒸煮完毕后，用三蒸水洗涤两次，此时丝素蛋白裸露，白度增加。然后再向容器中加入10.18g无水碳酸钠，2000ml三蒸水，蒸煮30min，洗涤一次。然后再按上述步骤重复一次，一共煮沸三次。蒸煮完毕后，用三蒸水洗涤，直至溶液达到中性(PH＝7.4左右)，最后脱水，至于通风橱晾干，待用。
本发明所述慢速降解的丝素蛋白，优选使用溴化锂浓度为8.0～10.0M，水解温度为25～70℃，水解时间为10min-360min；优选使用氯化钙水解使用无水氯化钙、水和无水乙醇的三元溶液，其中无水氯化钙：水：无水乙醇的摩尔比为1:8:2，水解温度为75-80℃，水解时间为10-60min。
本发明所述中速降解丝素蛋白，优选氯化钙水解使用无水氯化钙、水和无水乙醇的三元溶液，其中无水氯化钙：水：无水乙醇的摩尔比为1:8:2，水解温度为75-80℃，水解时间为10-150min。
本发明所述快速降解丝素蛋白，酸或碱水解使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、盐酸、硫酸中的一种或几种。优选使用碱或酸浓度为0.1～1.0M，水解温度为70-80℃，水解时间为10min-120min。
本发明的另一目的是提供具有不同降解速度的丝素蛋白支架，将本发明所述的具有不同降解速度的丝素蛋白的水溶液通过浓缩的得到1～30％丝素蛋白的溶液，经冷冻干燥、静电纺丝技术或盐析法得到具有不同降解速度的丝素蛋白支架。有机溶剂为甲醇，乙醇，丙醇中的一种或多种。
本发明的一个慢速降解丝素蛋白及支架的优选技术方案，将天然蚕丝纤维脱丝胶后，使用溴化锂进行水解，溴化锂浓度为8.0～10.0M，水解温度为25-70℃，水解时间为10min-360min；或者，使用所述的氯化钙水解使用三元溶液，其中无水氯化钙：水：无水乙醇的摩尔比为1:8:2，水解温度为75-80℃，水解时间为10-60min，得到慢速降解的丝素蛋白。通过透析(截留分子量12000-14000)除去盐分子得到具有快速降解速度的丝素蛋白溶液。上述丝素蛋白溶液经浓缩，冷冻干燥成型，乙醇或甲醇处理得到具有慢速降解速度的丝素蛋白支架。
本发明的一个具体的技术方案，将天然蚕丝纤维脱丝胶后，溶解在8.9M溴化锂盐溶液中，25℃条件下搅拌4h。然后，通过透析(截留分子量：12000-14000)除去盐分子得到具有慢速降解速度的丝素蛋白。通过透析(截留分子量12000-14000)除去盐分子得到具有慢速降解速度的丝素蛋白溶液。上述丝素蛋白溶液经浓缩，冷冻干燥成型，乙醇或甲醇处理得到具有慢速降解速度的丝素蛋白支架。
本发明的一个中速降解丝素蛋白及支架的优选技术方案，将本发明所述的慢速降解的丝素蛋白进一步使用氯化钙三元溶液水解，其中无水氯化钙：水：无水乙醇的摩尔比为1:8:2，水解温度为75-80℃，水解时间为10-150min，通过透析(截留分子量12000-14000)除去盐分子得到具有中速降解速度的丝素蛋白溶液。上述丝素蛋白溶液经浓缩，冷冻干燥成型，乙醇或甲醇处理得到具有中速降解速度的丝素蛋白支架。
本发明的一个快速降解丝素蛋白及支架的具体的技术方案，将本发明所述的慢速降解的丝素蛋白进一步使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、盐酸、硫酸中的一种或几种水解，使用碱或酸浓度为0.1～1.0M，水解温度为70-80℃，水解时间为10min-120min。通过透析(截留分子量12000-14000)除去盐分子得到具有快速降解速度的丝素蛋白溶液。上述丝素蛋白溶液经浓缩，冷冻干燥成型，乙醇或甲醇处理得到具有快速降解速度的丝素蛋白支架。
本发明所述的丝素蛋白与水解溶剂的质量体积比为1:100～1:2；本发明所述的丝素蛋白透析时间为1～10d。
本发明的另一目的在于提供本发明所述丝素蛋白在制备神经损伤修复等组织工程材料、药物缓释载体和高性能复合材料中的应用。优选的，本发明所述丝素蛋白作为组织工程的支架材料用于治疗周围神经损伤。
本发明的另一目的在于提供一种组织工程的支架材料，包括本发明所述具有不同降解速度的丝素蛋白。
本发明优点：
1.天然丝素蛋白的分子量在300KD-500KD之间，通过一定的处理方法得到不同降解速度的丝素蛋白。然而本发明研究发现，使用单一成分的盐水解丝素蛋白，其水解能力有限，无法通过控制水解温度和时间来获得一系列不同降解速度的丝素蛋白。本发明将溴化锂水解和酸碱水解进行搭配组合，可以有目的性的获得一系列不同降解速度的丝素蛋白，其作为支架材料具有不同降解周期，可根据不同的降解要求用于临床。本发明用溴化锂或氯化钙水解，在特定温度和时间条件下得到慢速降解的丝素蛋白，体内降解时间为1年～2年(兔子皮下埋植实验)]；将慢速降解的丝素蛋白在特定温度和时间条件下进一步使用氯化钙水解，得到中速降解的丝素蛋白，体内降解时间为6个月～1年(兔子皮下埋植实验)；将慢速降解的丝素蛋白在特定温度和时间条件下进一步使用酸或碱水解得到快速降解的丝素蛋白，体内降解时间为6个月以内(兔子皮下埋植实验)。
2.本发明所述丝素蛋白生物相容性好，生物降解速度可控，力学性能良好且无毒性，可以有效的控制丝素蛋白支架的降解速度，使神经再生长速度与支架降解速度同步，使周围神经损伤修复达到良好的治疗效果。
3.本发明所述的中速、快速降解的丝素蛋白支架材料材料不仅具有体内可控降解的速度，而且具有促进神经损伤修复的效果。由于中速、快速降解的丝素蛋白支架在体内降解速度更快，丝素蛋白支架本身的部分降解的氨基酸片段有促进神经损伤修复的功能，因此中速和快速降解的丝素蛋白具有促进轴突生长、神经损伤修复的效果。然而，慢速降解的丝素蛋白支架没有发现具有促进神经损伤修复的功能。
4.本发明制备的不同降解速度的丝素蛋白可以用作神经损伤修复的支架材料，还可以用作皮肤，肝脏，骨，软骨等组织工程领域，实现丝素蛋白在体内的可调控降解。
附图说明
图1为本发明所述具有不同降解速度的丝素蛋白支架。
图2为丝素蛋白的SDS-PAGE电泳谱图。
图3为本发明所述具有不同降解速度的丝素蛋白支架的外降解图谱。
图4为本发明所述具有不同降解速度的丝素蛋白支架与雪旺细胞共培养。
图5为本发明所述具有不同降解速度的丝素蛋白支架与RSC96雪旺细胞共培养荧光染色图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：脱丝胶的天然蚕丝纤维的制备
电子天平称取包有丝胶的天然蚕丝纤维40-50g，放入到大约5L的不锈钢容器中。然后，称取无水碳酸钠10.18g倒入容器中，倒入2000ml的三蒸水(大约0.5％碳酸钠碱性溶液)，用玻璃棒充分搅拌使其完全溶解，用玻璃棒按压漂浮的蚕丝纤维使其大部分浸没到碳酸钠溶液中。然后，将其放到电磁炉上加热，直至煮沸，用玻璃棒搅拌蚕丝，从煮沸开始计时，大约蒸煮30min，期间要用玻璃棒适当搅拌一下，使蚕丝纤维蒸煮均匀。蒸煮完毕后，倒去碳酸钠溶液，用三蒸水洗涤两次，丝素蛋白裸露，白度增加。为了充分脱掉丝胶，进行第二次脱丝胶处理。同样是分别加入10.18g无水碳酸钠和2000ml三蒸水，充分溶解后放到电磁炉上加热煮沸，从煮沸时开始计时，大约30min后结束。然后，倒掉碳酸钠溶液，用三蒸水洗涤一遍。然后，进行第三次处理，也是同样加入10.18g无水碳酸钠和2000ml三蒸水，充分溶解后放到电磁炉上加热至煮沸，从煮沸时开始计时，大约30min后结束。然后倒掉碳酸钠溶液，用三蒸水洗涤数遍，直至丝素水溶液呈中性(PH＝7.4，用PH试纸测定)，然后，拧掉丝素蛋白上的水，放入通风橱晾干，待用。
实施例2：慢速降解丝素蛋白的制备
称取40.45g溴化锂倒入50ml离心管中，加三蒸水定容到50ml，充分溶解后，在搅拌条件下加入到100ml烧杯中，按质量体积比1:20加入2.5g实施例1制得的丝素蛋白(分多次加入)，完全加入后在表1条件水解搅拌，室温下静止30min。然后，进行透析(截留分子量：12000-14000)3天。
表1
组 水解温度 水解时间
1 25℃ 360min
2 70℃ 10min
3 50℃ 185min
4 70℃ 500min
对组1-4的丝素蛋白使用SDS-PAGE凝胶电泳测试其分子量。采用12％的SDS-PAGE分离胶(Milli-Q水，2ml；30％Acr-Bis(29:1),4ml；1M Tris(PH8.8),3.8ml；10％SDS,0.1ml；10％过硫酸铵，0.1ml；TEMED,0.01ml)和5％的SDS-PAGE浓缩胶(Milli-Q水，2.1ml；30％Acr-Bis(29:1),0.5ml；1M Tris(PH6.8)，0.38ml；10％SDS,0.03ml；10％过硫酸铵，0.03ml；TEMED,0.003ml)作为载体的区带电泳，将丝素蛋白样品加入到载体上(蛋白样品：5Xloading＝4:1),最后将丝素蛋白样品加入到电泳缓冲液(Tris碱，30g；甘氨酸，144g；SDS,10g；Milli-Q水，1L)进行电泳实验，并与标准蛋白进行对比，最后经剥胶、染色(考马斯亮蓝R250)、脱色，使蛋白区带清楚显示。测试结果显示，使用溴化锂对丝素蛋白进行水解，其分子量约为101000Da，说明使用溴化锂进行水解，仅得到慢速降解丝素蛋白，且无法通过延长水解时间获得更快降解速度的丝素蛋白。
以组1的丝素蛋白为例，经过浓缩得到浓度为15％的丝素蛋白溶解，加入到1cm的模具中。经过冷冻干燥，乙醇处理10h，得到慢速降解的丝素蛋白支架(见图1)。
实施例3：慢速降解丝素蛋白的制备
称取无水氯化钙37g，放入250ml烧杯中，加入三蒸水48ml使氯化钙全部溶解，水浴锅加热至75-80℃。然后，加入无水乙醇38.78ml，按质量体积比1:20加入实施例1制得的丝素蛋白(分多次加入)，完全加入后继续在此温度下搅拌10-60min(表2)，然后室温下放凉，进行透析(截留分子量：12000-14000)3天。
表2
组 水解温度 水解时间
1 80℃ 10min
2 78℃ 30min
3 75℃ 60min
对组1-3的丝素蛋白使用SDS-PAGE凝胶电泳测试其分子量，测试结果显示，使用氯化钙对丝素蛋白进行水解，水解产物分子量约为101000Da，与使用溴化锂进行水解的产物分子量相当，为慢速降解的丝素蛋白。
以组2的丝素蛋白为例，经过浓缩得到浓度为15％的丝素蛋白溶解，加入到1cm的模具中。经过冷冻干燥，乙醇处理10h，得到慢速降解的丝素蛋白支架(见图1)。
实施例4：中速降解的丝素蛋白
称取无水氯化钙37g，放入250ml烧杯中，加入三蒸水48ml使氯化钙全部溶解，水浴锅加热至75-80℃。然后，加入无水乙醇38.78ml，按质量体积比1:20加入实施例3制得的丝素蛋白(分多次加入)，完全加入后继续在此温度下搅拌10-150min(表3)，然后取出室温下放凉，进行透析(截留分子量：12000-14000)3天。
表3
对组1-4的丝素蛋白使用SDS-PAGE凝胶电泳测试其分子量，测试结果显示，使用氯化钙对慢速降解的丝素蛋白进行进一步水解，水解产物分子量约为69000Da，说明使用氯化钙进行水解，可得到中速降解丝素蛋白，并且无法通过延长水解时间获得更低分子量(更快降解速度)的丝素蛋白。
以组2的丝素蛋白为例，将丝素蛋白溶液经过浓缩得到浓度为18％的丝素蛋白溶解，加入到1cm的模具中。经过冷冻干燥，乙醇处理12h，得到中速降解的丝素蛋白支架(见图1)。
实施例5：快速降解的丝素蛋白
将10g实施例2或实施例3制得的丝素蛋白(分多次加入)，加入到50ml三蒸水中，70-80℃溶解温度下搅拌30min后，按与搅拌溶液1:5的体积比加入10ml 0.6M氢氧化钠碱性溶液，加入后继续在70-80℃溶解温度下继续搅拌10-120min后(表4)，取出室温下放凉，进行透析(截留分子量：100-500)3天。
表4
组 水解温度 水解时间
1 80℃ 10min
2 75℃ 60min
3 70℃ 120min
对组1-3的丝素蛋白使用SDS-PAGE凝胶电泳测试其分子量，测试结果显示，使用酸或碱对慢速降解的丝素蛋白进行进一步水解，水解产物分子量约为36000Da，说明使用酸或碱对慢速降解的丝素蛋白进行水解，可得获得更低分子量(快速降解速度)的丝素蛋白。
以组2的丝素蛋白为例，将丝素蛋白经过浓缩得到浓度为20％的丝素蛋白溶解，加入到1cm的模具中。经过冷冻干燥，乙醇处理24h，得到快速降解的丝素蛋白支架(见图1)。
实施例6：SDS-PAGE凝胶电泳测试
本发明采用12％的SDS-PAGE分离胶(Milli-Q水，2ml；30％Acr-Bis(29:1),4ml；1MTris(PH8.8),3.8ml；10％SDS,0.1ml；10％过硫酸铵，0.1ml；TEMED,0.01ml)和5％的SDS-PAGE浓缩胶(Milli-Q水，2.1ml；30％Acr-Bis(29:1),0.5ml；1M Tris(PH6.8)，0.38ml；10％SDS,0.03ml；10％过硫酸铵，0.03ml；TEMED,0.003ml)作为载体的区带电泳，将实施例2-5制备的丝素蛋白样品加入到载体上(蛋白样品：5Xloading＝4:1),最后将丝素蛋白样品加入到电泳缓冲液(Tris碱，30g；甘氨酸，144g；SDS,10g；Milli-Q水，1L)进行电泳实验，并与标准蛋白进行对比，最后经剥胶、染色(考马斯亮蓝R250)、脱色，使蛋白区带清楚显示(见图2)慢速降解丝素蛋白(实施例2和3)的分子量约为101000Da，中速降解丝素蛋白(实施例4)的分子量约为69000Da，快速降解丝素蛋白(实施例5)的分子量约为36000Da。
实施例7：不同降解速度的丝素蛋白体外降解
将实施例2-5制得的经过冻干构象转变处理后的不同降解速度的丝素蛋白支架称重后分别放入5ml由磷酸盐缓冲液配置的0.5mg/ml XIV胶原酶溶液，每一个的丝素蛋白设置5个平行的阳性对照，每一个的丝素蛋白设置5个平行样，分别在不同天数取出晾干称重，测定每一次降解后丝素蛋白质量，可以有效地控制丝素蛋白的降解速度与神经再生长速度同步，对神经损伤修复达到良好的治疗疗效果。结果如图3所示，结果显示，慢速降解丝素蛋白(实施例2和3)的降解期为90-100天，中速降解丝素蛋白(实施例4)的降解期为60-72天，快速降解丝素蛋白(实施例5)的降解期为42-48天(见图3)。
实施例8：不同降解速度的丝素蛋白体内降解
将实施例2-5制得的经过冻干构象转变处理后的不同降解速度的丝素蛋白支架称重后，经过70％乙醇消毒备用。选择健康的成年大耳白兔(约2.5kg/只)用作动物实验。将兔子用3％戊巴比妥钠溶液麻醉(1.2mL/kg)，背部剃毛并用酒精和碘伏灭菌。在每只兔子的脊柱两侧各选择三个植入部位，每侧相邻两个植入部位间隔为4厘米，然后在每个植入部位用钝性分离法制成1厘米大小的切口，样品皮下植入后切口用手术缝合线缝合，缝合线处用碘伏消毒。在预定的时间，将兔子无痛处死，取出植入材料观察其降解情况。研究结果实施例2和实施例3慢速降解丝素蛋白支架在体内降解时间分别约为1.2-1.5年；实施例4中速降解丝素蛋白支架在体内的降解时间为6-9月；实施例5快速降解丝素蛋白支架在体内降解时间为2-4月。该研究结果表明，通过本发明制备的丝素蛋白支架可以实现有效调控其在体内的降解速度。
实施例9：不同降解速度的丝素蛋白细胞增殖及促进轴突生长能力评价
将实施例2-5制得的经过冻干构象转变处理后的不同降解速度的丝素蛋白支架与雪旺细胞、神经元共培养评价其促进细胞增殖能力和促进轴突生长能力。将培养的原代雪旺细胞用胰蛋白酶溶液消化，将消化的细胞放入离心管在1200转/min的条件下离心。将细胞重悬于DMEM(含有10％胎牛血清)溶液中，经细胞计数后置于含有丝素蛋白支架的24孔板中。实验设置不同的组别，空白DMEM培养基(含有10％胎牛血清)作为对照组。将细胞与材料共培养一定的时间。将悬浮液(200微升/孔)加入到96孔板中用酶标仪测定450nm处的吸光度。结果如图4所示，结果表明对照组和慢速降解的丝素蛋白细胞增殖能力很弱，然而中速降解和快速降解的丝素蛋白具有显著的促进雪旺细胞增殖的能力。通过细胞增殖实验表明雪旺细胞在中速降解和快速降解的丝素蛋白支架中培养具有更好的促进细胞增殖的能力，然而慢速降解的丝素蛋白支架促进雪旺细胞增殖的能力很弱。同时，当支架与神经元共培养一定时间后，研究表明中速降解和快速降解的丝素蛋白支架材料也具有促进神经元轴突生长的能力，然而慢速降解的丝素蛋白支架不具备促进神经元轴突生长的能力。
实施例10：不同降解速度的丝素蛋白与原代雪旺细胞共培养进行形态观察
将实施例2-5制得的不同降解速度的丝素蛋白支架，经过无水乙醇处理后，放入带有盖玻片的24孔板内，尺寸为10mm×10mm，每种的丝素蛋白设置5个平行样，无丝素蛋白的盖玻片孔作为空白对照。每孔加入1ml 75％酒精消毒20-30min后用等量的0.01M PBS洗涤三次，吹干后留待接种细胞。细胞选用雪旺细胞，接种的细胞密度为1×105cells/ml，每孔加入0.5ml的细胞悬液，共培养2天后取出。取出后材料用0.01M PBS轻轻洗涤两遍，每次5min，再用4％多聚甲醛固定30min，然后用0.0l M PBS轻轻洗涤两遍，每次5min。此时加入DAPI(浓度1：1000，60μL/孔)室温条件下避光孵育30min，然后用0.01M PBS轻轻洗涤三遍，每次5min，此时再加入鬼笔环肽(浓度1：20，20μL/孔)室温条件下避光孵育30min，最后用0.01MPBS轻轻洗涤三遍，每次5min(注意：整个染色过程均在避光条件下进行)，荧光显微镜下观察染色情况如图5所示，(左栏为细胞骨架染色，中栏为DAPI核染色(中栏)，右栏为两种染色的雪旺细胞重组图。a为实施例2的慢速降解的丝素蛋白支架；b为实施例3的慢速降解的丝素蛋白支架；c为实施例4的中速降解的丝素蛋白支架；d为实施例5的快速降解的丝素蛋白支架)。结果说明，慢速降解(实施例2和3)，中速降解(实施例4)和快速降解(实施例5)的丝素蛋白支架都具有很好的生物相容性，利于细胞粘附和生长。
综上所述，虽然本发明以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。在所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (10)

1.具有不同降解速度的丝素蛋白，将天然蚕丝纤维脱丝胶后，使用溴化锂或氯化钙或酸碱水解，除去溶剂和盐分子后得到具有不同降解速度的丝素蛋白，其特征在于使用溴化锂或氯化钙水解，得到慢速降解的丝素蛋白；将慢速降解的丝素蛋白进一步使用氯化钙水解得到中速降解的丝素蛋白；将慢速降解的丝素蛋白进一步使用酸或碱水解得到快速降解的丝素蛋白。
2.如权利要求1所述的丝素蛋白，其特征在于所述慢速降解的丝素蛋白，使用溴化锂浓度为8.0~10.0 M，水解温度为25~70℃，水解时间为10 min-360 min；氯化钙水解使用无水氯化钙、水和无水乙醇的三元溶液，其中无水氯化钙：水：无水乙醇的摩尔比为1:8:2，水解温度为75-80℃，水解时间为10-60min。
3.如权利要求1所述的丝素蛋白，其特征在于所述的中速降解丝素蛋白，氯化钙水解使用无水氯化钙、水和无水乙醇的三元溶液，其中无水氯化钙：水：无水乙醇的摩尔比为1:8:2，水解温度为75-80℃，水解时间为10-150min。
4.如权利要求1所述的所述的丝素蛋白，其特征在于所述的快速降解丝素蛋白，酸或碱水解使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、盐酸、硫酸中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的丝素蛋白，其特征在于所述的快速降解丝素蛋白，酸或碱水解使用碱或酸浓度为0.1~1.0 M，水解温度为70-80℃，水解时间为10 min-120min。
6.具有不同降解速度的丝素蛋白支架，其特征在于将权利要求1-5任一项所述的具有不同降解速度的丝素蛋白的水溶液通过浓缩的得到1~30 %丝素蛋白的溶液，经冷冻干燥、静电纺丝技术或盐析法得到具有不同降解速度的丝素蛋白支架。
7.如权利要求7所述的具有不同降解速度的丝素蛋白支架，其特征在于有机溶剂为甲醇，乙醇，丙醇中的一种或多种。
8.如权利要求1-5任一项所述的丝素蛋白在制备神经组织工程生物医学材料、药物缓释载体和高性能复合材料中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述丝素蛋白作为组织工程的支架材料用于治疗周围神经损伤。
10.一种组织工程的支架材料，其特征在于包括如权利要求1-5任一项所述不同降解速度的丝素蛋白。
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