CN104189009B - 促血管化小肠粘膜下层温敏材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于小肠粘膜下层的促进血管化的温敏材料，它是将小肠粘膜下层基质、溶解液分别包装后制备得到，其中，小肠粘膜下层基质由如下方法得到：取小肠粘膜下层，经过酶解、酸溶，冷冻干燥后粉碎，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层基质材料；溶解液由含NaOH的磷酸盐缓冲液或生理盐水组成。本发明制备的生物材料，两种基材均可长期保存，使用前将二者按适当比例混合，具有良好的可注射性，37℃可形成稳定凝胶，不需交联聚合，该温敏材料体内外实验均证实具有促进血管化作用。

Description

促血管化小肠粘膜下层温敏材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及基于小肠粘膜下层的促进血管化的温敏材料及其制备方法。

背景技术

水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，具有接近正常组织的含水量及良好的生物相容性，理化性质可控，具有多孔结构，其立体多孔结构与细胞外基质很相似，有利于细胞生长增殖分化，也有利于生物活性因子活性的保持，可微创植入，在组织工程中具有广泛应用前景。温敏性水凝胶可在一定温度范围内从液态转变为凝胶态，不需其他催化剂及剧烈的反应条件，能良好地填充各种不规则形状的组织缺损，能将细胞或者活性物质均匀的分布在缺损部位，促进细胞生长、胞外基质的分泌和组织的自我修复，在组织工程及再生医学应用中具有突出的优势。水凝胶可由合成材料(如PCL、PEG、PVA和PNIPAAm等)及天然材料(如壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸和脱细胞胞外基质等)制备。与人工合成的凝胶材料相比，天然材料制备的水凝胶具有更好的生物相容性和生物可降解性。

猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)，是天然细胞外基质，厚约0.8mm，包含有复杂排列的胶原、蛋白聚糖、葡糖胺和糖蛋白等，可有效地传递分子和细胞信息。SIS具有以下特点：(1)SIS无免疫原性，用于移植不引起免疫排斥反应，SIS在超过1000种的跨种交叉移植实验中均表现为无免疫原性；(2)SIS具有抗微生物活性，可减少感染；(3)SIS有良好的生物力学性质，冻干的SIS抗拉强度减弱，将其复水5分钟，即可达到稳定力学状态，为肌腱强度的1/7～1/14；(4)SIS具有良好的生物相容性，可促进多种细胞在材料上的黏附、生长和分化，可在动物体内快速降解；(5)SIS主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有多种生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转移生长因子-β(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及硫酸蛋白多糖、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)等，即使经过制备过程处理的SIS仍然含有这些生长因子，具有促进血管再生、组织生长的能力；(6)SIS具有部位特异性的组织再生的能力，能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主细胞的长入和分化，产生的再生组织在结构和功能上均与原有组织相似；(7)SIS来源方便，易于制备，因此，SIS已用于组织修复研究，重建腹膜、尿道膀胱、肌腱、血管和硬脑膜，用于体表修复等，并已有临床应用。为进一步拓展SIS材料的临床应用，可将SIS制备为温敏凝胶。Kang等将SIS在体外酸溶、中和、冻干后，临用前与PBS混合成悬液，注入体内后可形成凝胶【In vivorelease of bovine serum albumin from an injectable small intestinal submucosagel.Kang,K.N.；Kim,D.Y.；Yoon,S.M.,et al.Int J Pharm,2011,32(16):3969-3976】，但在体外未能形成温敏凝胶。Hurst等制备SIS凝胶，其方法主要包括：酶解、酸溶、10mM HCl透析等，灭菌采用氯仿透析灭菌，再用无菌NaOH中和，而获得凝胶【Hurst,R.E.；Hauser,P.J.；Kyker,K.D.,et al.Suppression and Activation of the Malignant Phenotype byExtracellular Matrix in Xenograft Models of Bladder Cancer:A Model for TumorCell"Dormancy".PLoS One,2013,8(5):e6418】，该方法十分繁琐，使用前需无菌操作加入无菌NaOH以中合HCl；并且，其透析的目的在于使溶液中HCl达到10mM，耗时较长；另外该方法制备的凝胶不适于长期保存。

综上，目前方法制备的SIS凝胶，在体内可成胶，但难于在体外稳定形成凝胶，若将其直接用于体表创面，将不能使SIS在创面有效停留，不利于对体表创面的修复；并且，常用灭菌方法采用的是75％乙醇、氯仿等浸泡，产品形式为液体，不适合于大量生产【UniltedStates Patent(10)Patent N0.:US 8,361,503 B2】；如中合后保存，产品即使在常温下随时间延长也会形成胶态，失去其流动性，不适于长期保存；如保存未中合的溶液，虽可延长保存时间，但需无菌操作加入无菌NaOH，并测定其pH值，操作繁琐，不利于应用。

发明内容

本发明的目的在于提供可以在体外形成凝胶、且具有促血管生成的基于小肠粘膜下层的温敏材料及其制备方法。

试验研究表明，将SIS消化液直接中和冻干后，再加入PBS溶液溶解，均不能在体外有效形成凝胶，然而，将SIS基质材料和碱液分开包装，使用时再混合确能够在体外成胶，由此推论，中和反应的顺序可能是影响其体外成胶的重要因素。

基于上述推论，本发明提供了基于小肠粘膜下层的温敏材料，它是将小肠粘膜下层凝胶基质材料、溶解液分别包装后制备得到，其中，小肠粘膜下层凝胶基质材料由如下方法得到：

取小肠粘膜下层，经过酶解、酸溶，冷冻干燥，干燥后打粉或剪碎成絮状，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层凝胶基质材料；

溶解液：由含有NaOH的磷酸盐缓冲液或生理盐水构成。

在预实验过程中发现，采用分开包装的方式的确可以促进产品体外成胶，但是，并非是任意条件均能达到这样的效果：凝胶浓度低于2％，不能有效形成凝胶，高于4％，未成胶时即非常粘稠，无可注射性。因此，本发明将小肠粘膜下层凝胶基质材料与溶解液的质量体积比限定为2～4:100(g/ml)。

其中，所述溶解液中NaOH的含量以调节小肠粘膜下层凝胶基质材料pH＝7为准。

进一步地，制备小肠粘膜下层凝胶基质材料的具体操作如下：

(1)取干燥的小肠粘膜下层，粉碎，所得SIS粉备用；

(2)向HCl溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；

(3)取SIS粉与消化液，混匀后，置于摇床上摇晃，待消化液变澄清后，取出进行冷冻干燥，干燥后打粉或剪碎成絮状，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层凝胶基质材料。

更进一步地，步骤(1)中，粉碎后取过80目筛的粉末，即为SIS粉。该粒径下有利于后续的溶解及消化。

更进一步地，步骤(2)中，HCl溶液pH＝2～4；消化液中，胃蛋白酶浓度为1mg/ml。

更进一步地，步骤(3)中，SIS粉与消化液的质量体积比为1:100～2:100。(g/ml)。

本发明中，小肠粘膜下层凝胶基质材料采用辐照或环氧乙烷进行灭菌，溶解液采用过滤灭菌。

本发明还提供了小肠黏膜下层凝胶的制备方法，它包括如下操作步骤：

(1)制备小肠粘膜下层凝胶基质材料：

A、取干燥的小肠粘膜下层，粉碎，所得SIS粉备用；

B、向HCl溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；

C、取SIS粉与消化液，混匀后，置于摇床上摇晃，待消化液变澄清后，取出进行冷冻干燥，干燥后打粉或剪碎成絮状，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层凝胶基质材料；

(2)取小肠粘膜下层凝胶基质材料、溶解液分别包装后，即得小肠黏膜下层温敏材料。

本发明制备的温敏材料，两种基材均可长期保存，使用前将二者按适当比例混合后，具有良好的可注射性，37℃可形成稳定凝胶，不需交联聚合，该温敏材料体内外实验均证实具有促进血管化作用。

与现有技术的温敏材料相比：

(1)现有技术不能在体外稳定构建凝胶，且现有技术未能证实保留了生长因子活性；而本发明材料能够在体外混合后成胶，并且可以缓释生长因子，体内外均能有效促进血管化，特别是可延长SIS在体表创面的有效作用时间，有利于对体表创面的修复；同时，在某些前期试验中，可以直接采用体外模型进行验证，避免了体内试验带来的不便。

(2)现有技术中需要进行透析，才能使溶液中HCl达到10mM，从而保证成胶稳定性，其耗时较长。本方法中不使用透析技术，同样可以形成稳定的凝胶，操作更为便捷。

(3)现有技术灭菌方法采用的是75％乙醇、氯仿等浸泡，制备过程需无菌环境，不适合于大量生产；本发明中，采用辐照或环氧乙烷对凝胶基质材料进行灭菌，缓冲液采用过滤灭菌，更适合大量生产。

(4)现有技术制备的产品为液态溶液或悬浮液，产品即使在常温下随时间延长亦可形成胶态，失去其流动性，不能长期保存；而本发明灭菌后分开包装，可长期保存，使用时再混合成胶，保证了产品的稳定性和后期使用的便利性。

附图说明

图1 SIS温敏凝胶成胶图，其中A、B分别为浓度2％、3％SIS温敏凝胶

图2 SIS温敏凝胶的扫描电镜观察图

图3 温敏凝胶水解率检测结果

图4 SIS凝胶生长因子缓释结果

图5 SIS温敏凝胶促进细胞增殖实验结果

图6 LIVE/DEAD细胞荧光染色结果

图7 皮下注射凝胶后的染色结果

图8 炎性细胞数目检测结果

图9 凝胶表面接种HUVEC后的显微镜观察结果

图10 SIS温敏凝胶促进大鼠主动脉环萌芽结果

图11 微血管检测结果

图12 SIS温敏凝胶体内注射后促微血管生成的显微镜观察结果

图13 SIS温敏凝胶体内注射后促微血管生成的影响

具体实施方式

实施例1 SIS温敏材料制备

冻干的SIS膜剪碎，经球磨仪在25Hz下球磨5min成粉末，过80目筛。配制0.01N HCl(pH＝2)溶液，向其中加入胃蛋白酶，该胃蛋白酶消化液中胃蛋白酶浓度为1mg/ml，摇床上放置，摇晃至胃蛋白酶完全溶解。向消化液中加入SIS粉末，浓度为1％(g/ml)，搅拌均匀后放置摇床室温摇晃，观察SIS消化液变澄清粘稠后，将其倒入培养皿，放置到-40℃冰箱预冻2h以上。将预冻好的SIS消化液放入冻干机，冷冻干燥24h呈海绵状。将海绵状SIS消化物剪碎成细小絮状小肠粘膜下层(SIS)凝胶基质材料。

本发明中，采用辐照或环氧乙烷对凝胶基质材料进行灭菌，溶解液采用过滤灭菌。将SIS凝胶基质材料与含有NaOH的磷酸盐缓冲液(即溶解液)分开包装，即得本发明温敏材料。

配制不同浓度的SIS凝胶配方如下(以1ml凝胶为例，每批次SIS消化物以每次试验所得配方为准，以下提供参考数据)：

表1

使用时，用含有NaOH的磷酸盐缓冲液与SIS凝胶基质材料混合，至pH约7左右，则配制成预凝胶悬液。配制好后，搅拌使得固体充分溶解，放置37℃孵箱，20-30分钟即可成胶(见图1)。

本发明研究发现，凝胶浓度低于2％，不能有效形成凝胶，高于4％，未成胶时即非常粘稠，无可注射性。

试验中验证发现：将SIS消化液直接中和冻干后，加入PBS溶液溶解，均不能在体外形成凝胶。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1

1、理化检测

1.1扫描电子显微镜检测

制备浓度为2％、3％、4％的凝胶样品，凝胶厚度为0.5cm。凝胶在-40℃冰箱中预冻2h以上后，放入冷冻干燥机中冻干24h。将冻干的三个浓度的凝胶样品纵向切割，选取任一切割面喷金后用扫描电镜观察凝胶表面的形态结构。

1.2 SIS温敏凝胶体外降解

制备1mL的3％的凝胶样品，放入EP管，加入1mLPBS或0.05％I型胶原酶溶液，放置于37℃摇床上，于0天，1天，5天，10天,20天将EP管取出，离心后取出上清。所有EP管冻干后称重，与0天时取出的比较降解率。

1.3生长因子体外缓释：收集SIS凝胶体外降解后溶液，ELISA检测其中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)累计释放量。

2.SIS温敏凝胶体外细胞相容性(以市售Ⅰ型胶原为对照)

2.1 SIS温敏凝胶促进细胞增殖实验

96孔板中吸取3％SIS温敏凝胶和对照组Ⅰ型胶原(COL)50μL平铺于每个孔中，放入37℃培养箱使其成胶。将NIH 3T3细胞和HUVEC细胞消化成细胞悬液后，调节细胞浓度，以每孔8000的细胞数目将细胞接种于96孔板中的两种凝胶表面。在第1天、3天、5天、7天用CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒检测细胞增殖情况。

2.2 LIVE/DEAD细胞荧光染色

SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原表面以10⁵/cm²的密度接种HUVEC，培育五天后，加入钙黄绿素(AMCalcein-AM)和碘化丙啶(PI)荧光染液，染色20min后，倒置荧光显微镜下观察。

3.SIS温敏凝胶体内植入(炎性反应评价)(以市售Ⅰ型胶原为对照)

将SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原1mL注入SD大鼠背部皮下，于3天，一周，两周，四周后连同背部皮肤一起取材，多聚甲醛固定后石蜡包埋切片，进行HE染色。

4.SIS温敏凝胶促血管生成(以市售Ⅰ型胶原为对照)

4.1 SIS温敏凝胶促进HUVEC形成血管腔样结构实验

24孔板中吸取3％SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原各90μL平铺于孔中将HUVEC以1.5×10⁵/cm²的密度接种，于3天后观察HUVEC是否形成了血管腔样结构。

4.2 SIS温敏凝胶促进大鼠主动脉环萌芽实验

将一周的SD大鼠胸主动脉切成约1mm厚的环状，在48孔板中先铺50μLSIS凝胶，待成胶后在胶面上平行放置一个主动脉环，再铺一层50μL的SIS凝胶将环包裹。加入EBM-2培养基，培养10天后，观察血管环萌芽状态。对照组Ⅰ型胶原同理。

4.3 SIS温敏凝胶体内注射后促微血管生成实验

将SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原1mL皮下注射到大鼠背部，3天和7天后连同背部皮肤一起取材，多聚甲醛固定后石蜡包埋切片，用免疫组化染色的方式标记微血管(CD31)，观察材料诱导下新生的微血管。

5检测结果：

5.1扫描电子显微镜检测

将小肠粘膜下层基质与溶解液混合后，37℃即形成温度凝胶(图1)。图2从左至右依次为2％、3％、4％的SIS温敏凝胶的扫描电镜观察图，放大倍数为500×。凝胶的孔径随着凝胶浓度升高而降低。

5.2 SIS温敏凝胶水解率检测

结果见图3。由图3可知，3％SIS温敏凝胶水解率基本在10天以后趋于稳定，最后在PBS中降解40％左右。10天后酶解接近70％。

5.3 SIS凝胶生长因子缓释

结果见图4，无生长因子初期爆发释放现象，随降解时间延长，生长因子释放量增加。

5.3 SIS温敏凝胶促进细胞增殖实验

结果见图5.由图5可知，用CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒检测到HUVEC和NIH3T3两种细胞均可以在SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原(COL)表面增殖，表明两种凝胶均无细胞毒性。

5.4 LIVE/DEAD细胞荧光染色

结果见图6。由图6可知，接种HUVEC1、3、5、7天后做LIVE/DEAD细胞荧光染色，SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原(COL)表面未见大量红色死细胞，细胞相容性良好。

5.5 SIS温敏凝胶体内植入(炎性反应评价)

结果见图7、8。图7中分别为皮下注射SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原(COL)后3天，7天，2周，4周后取材，做HE染色结果。图8为炎性细胞数目检测结果。可见注射SIS温敏凝胶后在3天和7天时有轻微的炎性反应，但到2周时炎性反应基本消退。整个过程中未见明显的纤维囊形成。2周以后材料大量降解，4周时仅见少量残余。通过炎性细胞计数证实了炎性反应较轻，消退很快。综上所述，SIS温敏凝胶具有低免疫原性，生物相容性良好。

5.6 SIS温敏凝胶促进HUVEC形成血管腔样结构实验

以SIS温敏水凝胶和Ⅰ型胶原(COL)温敏凝胶表面接种HUVEC 1天，3天，5天后用激光共聚焦显微镜(40X)观察，结果见图8。由图8可知，接种后第1天即可见HUVEC排列成网状结构，但微血管结构不明显。到第3天时，HUVEC进一步排列成网状，并且有微血管腔样结构出现。到第5天时，血管腔样结构明显，保持稳定(图9N)。而接种于Ⅰ型胶原表面的细胞只进行增殖，未见形成血管网状结构(图9M)。SIS温敏凝胶可以促进HUVEC形成微血管腔样结构，促血管发生。

5.7 SIS温敏凝胶促进大鼠主动脉环萌芽实验

结果见图10。由图10可知，将大鼠主动脉环培养至第10天时，可见主动脉环周围有微血管萌芽发生，而Ⅰ型胶原(COLL)孵育的血管环未见明显变化,两组微血管面积具有显著性差异(图11)。可见，SIS温敏凝胶可以促进大鼠主动脉环萌芽发生。

5.8 SIS温敏凝胶体内注射后促微血管生成实验

结果见图12，图12为大鼠背部注射SIS温敏凝胶和Ⅰ型胶原温敏凝胶(COL)3天和7天后取材包埋切片，进行免疫组化染色，标记物为CD31，标记血管内皮细胞。上图中棕黄色圆环状的即为材料中新生的微血管，两种凝胶注射3天和7天后即可诱导新生血管的产生。但SIS温敏凝胶诱导生成的微血管数目和血管管径都明显大于Ⅰ型胶原温敏凝胶(图13)，可见其促进血管生成的能力强于Ⅰ型胶原。

Claims (8)

1.基于小肠粘膜下层的促进血管化的温敏材料，其特征在于：它是将小肠粘膜下层凝胶基质材料、溶解液分别包装后制备得到，其中，小肠粘膜下层凝胶基质材料由如下方法得到：

取小肠粘膜下层，经过酶解、酸溶，冷冻干燥，干燥后打粉或剪碎成絮状，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层凝胶基质材料；

溶解液为含有NaOH的磷酸盐缓冲液或生理盐水；

其中，所述溶解液中NaOH的含量以调节小肠粘膜下层凝胶基质材料pH＝6.5～7.2为准。

2.根据权利要求1所述的温敏材料，其特征在于：小肠粘膜下层凝胶基质材料与溶解液的质量体积比为2～4:100。

3.根据权利要求1所述的温敏材料，其特征在于：制备小肠粘膜下层凝胶基质材料的具体操作如下：

(1)取干燥的小肠粘膜下层，粉碎，所得SIS粉备用；

(2)向HCl溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；

(3)取SIS粉与消化液，混匀后，置于摇床上摇晃，待消化液变澄清后，取出进行冷冻干燥，干燥后打粉或剪碎成絮状，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层凝胶基质材料。

4.根据权利要求3所述的温敏材料，其特征在于：步骤(1)中，低温粉碎后取过80目筛的粉末，即为SIS粉。

5.根据权利要求3所述的温敏凝胶，其特征在于：步骤(2)中，HCl溶液pH＝2～4；消化液中，胃蛋白酶浓度为1mg/ml。

6.根据权利要求3所述的温敏材料，其特征在于：步骤(3)中，SIS粉与消化液的质量体积比为1:100～2:100。

7.根据权利要求1或3所述的温敏材料，其特征在于：小肠粘膜下层凝胶基质材料采用辐照或环氧乙烷进行灭菌，溶解液采用过滤灭菌。

8.权利要求1所述基于小肠粘膜下层的促进血管化的温敏材料的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)制备小肠粘膜下层凝胶基质材料：

A、取干燥的小肠粘膜下层，粉碎，所得SIS粉备用；

B、向HCl溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；

C、取SIS粉与消化液，混匀后，置于摇床上摇晃，待消化液变澄清后，取出进行冷冻干燥，干燥后打粉或剪碎成絮状，灭菌，得到无菌粉状或絮状的小肠粘膜下层凝胶基质材料；

(2)取小肠粘膜下层凝胶基质材料、溶解液分别包装后，即得温敏材料。