CN110354311A - 细胞外基质复合透明质酸凝胶及其制备方法、应用和生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞外基质复合透明质酸凝胶及其制备方法、应用和生物材料，涉及生物材料领域。该细胞外基质复合透明质酸凝胶通过将细胞外基质和透明质酸交联获得，该细胞外基质复合透明质酸凝胶具有适合细胞生长的孔径和良好的生物相容性。相比于细胞外基质凝胶，该细胞外基质复合透明质酸凝胶能更好的促进细胞在框架中生长和增殖。主要由该细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料能够促进组织器官的修复和再生，可应用于心脏、脑、肝脏、肾脏、皮肤和骨等组织，在组织器官损伤修复中有着重要的应用价值。

Description

细胞外基质复合透明质酸凝胶及其制备方法、应用和生物 材料

技术领域

本发明涉及生物材料领域，尤其是涉及一种细胞外基质复合透明质酸凝胶及其制备方法、应用和生物材料。

背景技术

近年来，组织工程的发展为一些慢性疾病的患者带来了新的治疗方案。其中，具有适当空间的生物支架材料是组织工程心肌构建的基础，它一方面为细胞附着提供锚定位点，另一方面为组织再生提供三维空间结构及力学支持。人工化组织植入体内往往需要去除原有组织，对组织造成二次损伤。对于心脏、脑等组织来说，该局限大大限制了其临床应用。因此一种具有天然成分的生物材料对组织工程的发展是十分有益的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种细胞外基质复合透明质酸凝胶，该凝胶具有合适细胞生长的孔径结构和生物相容性，修复损伤组织效果较佳。

本发明的第二目的在于提供上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法。

本发明的第三目的在于提供一种上述细胞外基质复合透明质酸凝胶，或上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法在制备生物材料中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种主要由上述细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种细胞外基质复合透明质酸凝胶，将细胞外基质和透明质酸交联，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法，包括将细胞外基质和透明质酸交联，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶。

优选地，所述细胞外基质来源于脱细胞基质材料溶解得到的细胞外基质凝胶。

优选地，使用化学交联剂将细胞外基质和透明质酸交联。

优选地，所述化学交联剂包括用于给细胞外基质提供巯基的第一交联剂，和用于给透明质酸提供马来酰亚胺基团的第二交联剂；

优选地，所述第一交联剂包括2-亚氨基噻吩；

优选地，所述第二交联剂包括Sulfo-SMCC。

优选地，提供带有巯基的细胞外基质和带有马来酰亚胺基团的透明质酸，使带有巯基的细胞外基质与带有马来酰亚胺基团的透明质酸反应，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶；

所述带有巯基的细胞外基质中的巯基由2-亚氨基噻吩提供；所述带有马来酰亚胺基团的透明质酸中的马来酰亚胺基团由Sulfo-SMCC提供。

优选地，将细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物和透明质酸-Sulfo-SMCC 复合物混合反应0.5～2小时，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶；

优选地，将细胞外基质凝胶和2-亚氨基噻吩反应1.5～2.5小时，得到细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物；

优选地，将透明质酸和Sulfo-SMCC反应0.5～1.5小时，得到透明质酸 -Sulfo-SMCC复合物；

优选地，2-亚氨基噻吩、Sulfo-SMCC和透明质酸的摩尔比为(1～2)： (1～2)：(1～2)；透明质酸和细胞外基质凝胶的质量比为(1～2)：(1～2)。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述细胞外基质复合透明质酸凝胶，或上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法在制备生物材料中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了主要由上述细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料；

优选地，所述生物材料为注射剂；

优选地，所述生物材料还包括由所述细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的膜材料。

优选地，所述生物材料中还包括间充质干细胞；

优选地，所述间充质干细胞的含量为1×10⁶个～5×10⁶个；

优选地，所述生物材料用于治疗心肌缺血。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶，通过将细胞外基质和透明质酸交联，得到的细胞外基质复合透明质酸凝胶兼有细胞外基质和透明质酸的生理功能，并且由于细胞外基质为天然成分，透明质酸在体内也可以被降解吸收，因此该细胞外基质复合透明质酸凝胶具有良好的组织相容性，降低了对组织造成二次损伤。该细胞外基质复合透明质酸凝胶具有适合细胞生长的孔径，孔径约为100μm左右，适合细胞在其中生长和增殖，并且其形成的孔径的力学强度，相比只使用细胞外基质制备得到的凝胶得到了较大的提高；该细胞外基质复合透明质酸凝胶具有良好的生物相容性，相比于单独使用细胞外基质，更能够促进细胞在该凝胶构成的框架中增殖。

本发明还提供了上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法，以及上述细胞外基质复合透明质酸凝胶及其制备方法在制备生物材料中的应用。主要由该细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料，可以植入机体的大部分组织，以调节组织中的细胞形态、促进细胞增殖和生长、促进细胞中基因的转录和蛋白的表达，应用于包括修复心肌组织、脑组织、肝脏组织、肾脏组织、皮肤组织或骨组织中等的损伤修复或组织再生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶；

图2为实施例1提供的细胞外基质凝胶孔径结构的电镜照片；

图3为实施例2提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶孔径结构的电镜照片；

图4为实施例2提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶中培养人脐带间充质干细胞的电镜照片；

图5为实施例2提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶中培养人脐带间充质干细胞的电镜照片；

图6为实施例2提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶的生物相容性；

图7为人脐带间充质干细胞分别在实施例1的细胞外基质凝胶和实施例2的细胞外基质复合透明质酸凝胶中的生长曲线；

图8为人脐带间充质干细胞分别在实施例1的细胞外基质凝胶和实施例2的细胞外基质复合透明质酸凝胶中的细胞增殖的荧光染色结果；

图9为缺血心肌内部血管、心肌细胞和细胞凋亡的免疫荧光染色；

图10为缺血心肌内部血管密度的统计；

图11为缺血心肌内部心肌细胞密度的统计；

图12为缺血心肌内部细胞凋亡的统计。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种细胞外基质复合透明质酸凝胶，该凝胶通过将细胞外基质和透明质酸交联获得。

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是通过理化方法去除生物体原型组织中的细胞成分，由生物大分子构成的具有生物网络结构的天然生物衍生材料，主要成分有：胶原、蛋白多糖、糖蛋白和纤维粘连蛋白；以及部分天然组织中的生物活性因素，例如硫酸软骨素、纤维结合蛋白、 VEGF、bFGF、TGF-β、神经调节蛋白、EGF和BMP-4等。细胞外基质为细胞生长提供物理支持和适宜的场所，通过信号转导调控细胞的粘附、生长、增殖和分化，促进损伤组织器官的再生。

在一些可选的实施方式中，细胞外基质的来源包括同种来源、异种来源或者自体来源，细胞外基质来源的物种包括但不限于人类、哺乳类动物或者禽类等，在具体的实施例中，包括但不限于为人类、牛、羊、猪、马、鼠、鸡或鸭的组织或器官。在一些可选的实施方式中，细胞外基质来源的组织包括但不限于为心包、心脏瓣膜、小肠粘膜、跟腱、膀胱粘膜、尿道、中枢神经、输尿管、真皮、腹膜或软骨等组织或器官。

透明质酸(HA)是葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的直链高分子多糖，在体内可被降解为氨基葡萄糖被人体吸收，具有良好的生物相容性和生物可降解性。HA的分子网状结构与水形成氢键，可以结合大量的水，在体内构成基质，具有调节渗透压、调控大分子物质的转运、形成物理屏障以及调节细胞功能等多种生理功能。

本发明提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶，通过将细胞外基质和透明质酸交联，得到的凝胶兼有细胞外基质和透明质酸的生理功能，并且由于细胞外基质为天然成分，透明质酸在体内也可以被降解吸收，因此该细胞外基质复合透明质酸凝胶具有良好的组织相容性，降低了对组织造成二次损伤。该细胞外基质复合透明质酸凝胶具有适合细胞生长的孔径，孔径约为100μm左右，适合细胞在其中生长和增殖，并且其形成的孔径力学强度相比只使用细胞外基质制备得到的凝胶得到了较大的提高；相比于单独使用细胞外基质，更能够促进细胞在该凝胶构成的框架中增殖。

本发明还提供了上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法，包括将细胞外基质和透明质酸交联，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶。

本发明不限制细胞外基质的制备方法，可选地，细胞外基质来源于市售商品；可选地，细胞外基质可通过本领域常规的方法制备得到，本领域常规的方法包括但不限于为反复冻融法、化学去污剂法、渗透溶液法或者酶消化法中的一种或者多种的结合使用；其中化学去污剂包括但不限于为 SDS、LiDS、胆酸钠、EDTA、TritonX-100、TritonX-114、NP-40或新葡糖苷等。

在一些优选的实施方式中，所述细胞外基质来源于脱细胞基质材料溶解得到的细胞外基质凝胶。细胞外基质凝胶为将脱细胞后的细胞外基质溶解于液体中，得到的由细胞外基质中的天然蛋白等成分构成的高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。

在一些优选的实施方式中，使用化学交联剂将细胞外基质和透明质酸交联，相比于其他交联方法，化学交联后可提高凝胶材料的力学强度及孔径大小。

在一些优选的实施方式中，所述化学交联剂包括用于给细胞外基质提供巯基的第一交联剂，使细胞外基质带有巯基；和用于给透明质酸提供马来酰亚胺基团的第二交联剂，使透明质酸带有马来酰亚胺基团，然后再通过巯基和马来酰亚胺基团反应，将细胞外基质和透明质酸连接起来。其中第一交联剂优选使用2-亚氨基噻吩；第二交联剂优选使用Sulfo-SMCC。

2-亚氨基噻吩是一种环形的交联剂，可与细胞外基质中N末端的氨基 (-NH2)发生反应，将巯基(-SH)基团添加到细胞外基质的分子上。 Sulfo-SMCC为璜基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环乙烷，是一种双功能交联剂，分子两端分别含有羟基琥珀酰亚胺基(N-hydroxysuccinimide ester group，NHS)和马来酰亚胺基(maleimide group)。Sulfo-SMCC中的NHS 可与氨基(-NH2)反应，而Sulfo-SMCC中的马来酰亚胺基可与巯基(-SH) 反应。Sulfo-SMCC通过一端的NHS基团与透明质酸的氨基相连，而另一端的马来酰亚胺基团则可与含有巯基(-SH)基团的细胞外基质分子反应，从而将两者共价交联在一起。Traut’s和Sulfo-SMCC是蛋白交联的优选化学交联剂，可渗透到细胞膜的脂质双层中，且毒性相对较小，也更加适合动物活体内使用。

在一些优选的实施方式中，提供带有巯基的细胞外基质和带有马来酰亚胺基团的透明质酸，使带有巯基的细胞外基质与带有马来酰亚胺基团的透明质酸反应，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶；所述带有巯基的细胞外基质中的巯基由2-亚氨基噻吩提供；所述带有马来酰亚胺基团的透明质酸中的马来酰亚胺基团由Sulfo-SMCC提供。

在一些优选的实施方式中，将细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物和透明质酸-Sulfo-SMCC复合物混合反应0.5～2小时，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶。其中，细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物指的是细胞外基质和 2-亚氨基噻吩反应后带有巯基的细胞外基质；透明质酸-Sulfo-SMCC复合物指的是透明质酸和Sulfo-SMCC反应后带有马来酰亚胺基团的透明质酸。细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物优选通过将细胞外基质凝胶和2-亚氨基噻吩反应1.5～2.5小时得到；透明质酸-Sulfo-SMCC复合物优选通过将透明质酸和Sulfo-SMCC反应0.5～1.5小时得到。

在一些优选的实施方式中，2-亚氨基噻吩溶解于如下缓冲液：将8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄溶于1L蒸馏水，然后再将4mmol的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至7.2。

在一些优选的实施方式中，Sulfo-SMCC溶解于如下缓冲液：将8g NaCl、 0.2gKCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄溶于1L蒸馏水，然后再将4mmol 的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至8.0。

在一些优选的实施方式中，2-亚氨基噻吩、Sulfo-SMCC和透明质酸的摩尔比为(1～2)：(1～2)：(1～2)，优选为1:1:1；透明质酸和细胞外基质凝胶的质量比为(1～2)：(1～2)，优选为1:1。

在一些优选的实施方式中，细胞外基质按照如下方法制得的：取新鲜组织清洗干净，切成小块后采用SDS处理，再使用Triton X100处理，冻干后获得细胞外基质。在一些优选的实施方式中，先将细胞外基质制成细胞外基质凝胶，再与2-亚氨基噻吩反应，以将巯基添加到细胞外基质中。其中细胞外基质凝胶按照如下方式获得：将细胞外基质冷冻研磨机研磨成粉末状，与适量胃蛋白酶混合后溶解于酸溶液中，离心后取上清，在使用前使用碱中和上清的pH，并溶解于PBS缓冲液中。

本发明还提供了上述细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法，或上述细胞外基质复合透明质酸凝胶在制备生物材料中的应用。生物材料指的是用于与生命系统接触和发生相互作用的，并能对其细胞、组织和器官进行诊断治疗、替换修复或诱导再生的一类天然或人工合成的特殊功能材料。

本发明提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶兼有细胞外基质和透明质酸的生理功能，能够提供适合细胞生长的孔径和生物相容性，并且形成的框架力学性能较佳。可以理解的是，细胞外基质遍及全身，因此本发明提供的生物材料可以植入机体的大部分组织，以调节组织中的细胞形态、促进细胞增殖和生长、促进细胞中基因的转录和蛋白的表达。在一些可选的实施例中，本发明提供的生物材料可用于例如可以为但不限于为心肌组织、脑组织、肝脏组织、肾脏组织、皮肤组织、神经阻滞或骨组织中的损伤修复或组织再生。

基于上述发明构思，本发明还提供了主要由上述细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料。

在一些优选的实施方式中，除了细胞外基质本身含有的天然活性成分外，生物材料还可以添加具有治疗、辅助治疗或具有其他作用的组分，这些组分包括但不限于为外源细胞、用于维持细胞生长的营养物质、细胞生长因子、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、趋化因子、激素、抗生素、核酸、脂质体、糖蛋白或其他具有治疗作用的活性物质等。

在一些优选的实施方式中，所述主要由上述细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料，也可以包括将所述细胞外基质复合透明质酸凝胶通过本领域常规的加工方法加工得到的产物，例如凝胶材料经冷冻干燥后可制成片状的膜材料。

可以理解的是，虽然细胞外基质具有较低的免疫原性，但是在一些优选的实施方式中，选取实施对象相同的或同源性较高的组织部位的细胞外基质作为细胞外基质复合透明质酸中的成分时，例如以心包组织中的细胞外基质为原料制备得到的细胞外基质复合透明质酸凝胶以修复心脏损伤；或以皮肤组织中细胞外基质为原料制备得到的细胞外基质复合透明质酸凝胶以促进皮肤再生时，效果更佳。

在一些优选的实施方式中，上述生物材料为注射剂，可注射的凝胶可以直接将生长因子、干细胞等促进组织再生修复的活性物质注射入组织器官损伤原位，具有无创性，适合细胞以及细胞因子因子递送，将大幅提高人工化组织的临床应用潜力。

在一些优选的实施方式中，所述生物材料还包括间充质干细胞。间充质干细胞属于多能干细胞，具有分化、造血、促进肝细胞植入、自我复制和免疫调控的作用。间充质肝细胞可以分化成为多种组织细胞，例如可以为但不限于为内皮、骨骼、软骨、神经和脂肪等，可以用于预防和治疗细胞衰老，修复组织器官损伤。间充质肝细胞可以在本发明提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶中良好的生长，间充质干细胞在细胞外基质复合透明质酸凝胶中的生长状态优于在细胞外基质凝胶中的生长状态。在一些优选的实施方式中，每毫升细胞外基质复合透明质酸凝胶含有间充质肝细胞 1×10⁶个～5×10⁶个，例如可以为但不限于为1×10⁶个、2×10⁶个、3×10⁶个、 4×10⁶个或5×10⁶个。

在一些优选的实施方式中，所述生物材料为细胞外基质复合透明质酸凝胶和脐带间充质肝细胞的组合物，该组合物种，间充质肝细胞生长于细胞外基质复合透明质酸凝胶的孔中。在一些优选的实施方式中，细胞外基质复合透明质酸凝胶中的细胞外基质选自心脏胞外基质，该组合物可以有效的促进心脏血管再生。将细胞外基质复合透明质酸凝胶和脐带间充质肝细胞的组合物植入心肌缺血大鼠体外，移植30天后可促进缺血区的血管再生并减少心肌细胞的死亡，取得了良好的修复的效果。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1制备细胞外基质凝胶

以猪心脏细胞外基质为原料制备细胞外基质凝胶，包括如下步骤：

(1)制备猪心脏细胞外基质：取新鲜猪心，PBS缓冲液清洗3次，取心肌部分切成2cm×2cm×0.5cm小块，2％SDS于室温摇床孵育72小时，间隔12小时换液一次；1％Triton X100于室温摇床孵育72小时，间隔12 小时换液一次；PBS缓冲液于室温摇床清洗96小时，间隔6小时换液一次，冻干机冻干12小时，得白色块状心肌脱细胞基质材料。

(2)心脏细胞外基质凝胶的制备：将(1)所得心肌脱细胞基质材料使用冷冻研磨机研磨成粉末状，1g脱细胞基质粉末与100mg胃蛋白酶混合溶解于0.01M盐酸溶液，室温持续搅拌48小时，4℃、3000转离心15分钟，取上清，0.22μm滤器过滤。使用前，加入1/10体积的0.01N的氢氧化钠和1/9体积的10×PBS缓冲液。

实施例2制备细胞外基质复合透明质酸凝胶

(a)取2-亚氨基噻吩与细胞外基质凝胶于室温反应2小时，生成细胞外基质-2-亚氨基噻吩化合物，细胞外基质凝胶按照实施例1提供的方法制备得到。

(b)同时取Sulfo-SMCC试剂与透明质酸孵育1小时，生成透明质酸 -Sulfo-SMCC化合物。

(c)然后将上述步骤得到的细胞外基质-2-亚氨基噻吩化合物和透明质酸-Sulfo-SMCC化合物混合于室温孵育1小时，将透明质酸共价交联到细胞外基质材料上，细胞外基质复合透明质酸凝胶，如图1所示。

上述共价交联的步骤中各物质的用量和浓度优选为：2-亚氨基噻吩、 Sulfo-SMCC和透明质酸如下：2-亚氨基噻吩、Sulfo-SMCC和透明质酸的摩尔质量比为1：1：1；心脏细胞外基质凝胶、透明质酸的质量比为1:1；其中，上述(1)中2-亚氨基噻吩的浓度为2.5mg/ml，心脏细胞外基质溶液浓度为：9mg/ml；Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml；透明质酸浓度为：10mg/ml。

其中，2-亚氨基噻吩为购自Sigma公司的Traut’s Reagent；Sulfo-SMCC，购自Sigma公司；透明质酸购自索莱宝公司，货号S7020。

试剂配置如下：

①2-亚氨基噻吩：采用pH 8.0，含4mM EDTA的PBS缓冲液(配置方法如下：将8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄溶于1L 蒸馏水，然后再将4mmol的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至8.0) 溶解，取2.5mg的Traut’s Reagent试剂分别溶于1ml pH8.0，EDTA 4mM PBS 缓冲液中，得到2.5mg/ml的2-亚氨基噻吩试剂。

②Sulfo-SMCC：采用pH 7.2，含4mM EDTA的PBS缓冲液溶解，取 2mg的Sulfo-SMCC溶于4ml pH 7.2，EDTA 4mM PBS缓冲液，得到0.5mg/ml 的Sulfo-SMCC试剂。

③透明质酸：100mg溶于10ml PBS缓冲液(配置方法如下：将8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄溶于1L蒸馏水，调pH至7.0) 使其终浓度为10mg/ml。

效果例1细胞外基质复合透明质酸凝胶的超微结构观察

将实施例2制备得到的细胞外基质复合透明质酸凝胶，2％戊二醛 (0～4℃)处理2～4h，0.1mol/L pH7.2 PBS清洗3次，每次20min；乙醇梯度脱水：30％-50％-70％-80％-85％-90％-95％-100％，共3次，每个20min，4℃； 1:3乙酸异戊酯：乙醇，20min，4℃；1:1乙酸异戊酯：乙醇，20min，4℃ (晃动)；3:1乙酸异戊酯：乙醇，20min，2次，4℃(晃动)；100％乙酸异戊酯30min，4℃过夜后进行临界点干燥。喷金处理后，置于扫描电子显微镜下观察其内部孔径结构，如图2和图3所示。

效果例2

培养人脐带间充质干细胞(赛业生物技术公司，huxuc-01001)，将100μl 细胞外基质复合透明质酸凝胶与20μl浓度为1×10⁶个/毫升的人脐带间充质干细胞混合，共同放入96孔板，于旋转培养器上进行三维培养，培养5天后，按效果例1的步骤进行人脐带间充质干细胞在凝胶上生长情况的扫描电子显微镜观察，结果如图4、图5和图6所示，可注射细胞外基质复合透明质酸凝胶的孔径约100μm左右，适合细胞长入，其力学强度相比细胞外基质凝胶得到了较大的提高；而人脐带间充质干细胞在该凝胶材料上围绕其孔径生长良好。

效果例3

人脐带间充质干细胞分别培养于实施例2提供的细胞外基质复合透明质酸凝胶和实施例1提供的细胞外基质凝胶，培养2、4、6、8天后进行 MTT染色，绘制细胞增殖曲线，结果如图7所示；此外培养4天后，按 Cell-Light^TM EdU荧光显微镜检测试剂盒(广州锐博生物技术有限工作， C10310)说明书进行细胞增殖的荧光染色，结果如图8所示。结果显示，相比细胞外基质凝胶，细胞外基质复合透明质酸凝胶可更显著促进人脐带间充质干细胞的增殖。

效果例4

SD大鼠麻醉后，进行开胸手术。待心脏暴露后，用5-0丝线结扎其左冠状动脉前降支30min，松开丝线后沿心肌缺血区分别注射PBS、人脐带间充质干细胞(MSCs)、细胞外基质凝胶+人脐带间充质干细胞(cECM gel+MSCs)，细胞外基质复合透明质酸凝胶+人脐带间充质干细胞(Biohybid gel+MSCs)。手术后90天取材进行病理学切片分析，手术后90天进行超声心动功能分析。结果显示，细胞外基质复合透明质酸凝胶+人脐带间充质干细胞组能够更好促进缺血区的血管再生，保持心肌细胞存活并抑制缺血区心肌细胞的凋亡，结果如图9、图10、图11和图12所示，图9中α-SMA 为血管的特异性标志物、cTnT为心肌细胞的特异性物、Tunel为细胞凋亡检测。

综上，细胞外基质复合透明质酸凝胶具有适合细胞生长的孔径大小，并具有良好的生物相容性，可促进人脐带间充质干细胞的增殖，当该功能性胶原材料移植入受损心肌部位，手术90天后可观察到明显的血管再生且伴随着心肌功能的恢复。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.细胞外基质复合透明质酸凝胶，其特征在于，将细胞外基质和透明质酸交联，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶。

2.权利要求1所述的细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，包括将细胞外基质和透明质酸交联，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述细胞外基质来源于脱细胞基质材料溶解得到的细胞外基质凝胶。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，使用化学交联剂将细胞外基质和透明质酸交联。

5.根据权利要求4所述的备方法，其特征在于，所述化学交联剂包括用于给细胞外基质提供巯基的第一交联剂，和用于给透明质酸提供马来酰亚胺基团的第二交联剂；

优选地，所述第一交联剂包括2-亚氨基噻吩；

优选地，所述第二交联剂包括Sulfo-SMCC。

6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，提供带有巯基的细胞外基质和带有马来酰亚胺基团的透明质酸，使带有巯基的细胞外基质与带有马来酰亚胺基团的透明质酸反应，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶；

所述带有巯基的细胞外基质中的巯基由2-亚氨基噻吩提供；所述带有马来酰亚胺基团的透明质酸中的马来酰亚胺基团由Sulfo-SMCC提供。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物和透明质酸-Sulfo-SMCC复合物混合反应0.5～2小时，得到所述细胞外基质复合透明质酸凝胶；

优选地，将细胞外基质凝胶和2-亚氨基噻吩反应1.5～2.5小时，得到细胞外基质-2-亚氨基噻吩复合物；

优选地，将透明质酸和Sulfo-SMCC反应0.5～1.5小时，得到透明质酸-Sulfo-SMCC复合物；

优选地，2-亚氨基噻吩、Sulfo-SMCC和透明质酸的摩尔比为(1～2)：(1～2)：(1～2)；透明质酸和细胞外基质凝胶的质量比为(1～2)：(1～2)。

8.权利要求1所述的细胞外基质复合透明质酸凝胶，或权利要求2-7任一项所述的细胞外基质复合透明质酸凝胶的制备方法在制备生物材料中的应用。

9.一种主要由权利要求1所述的细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的生物材料；

优选地，所述生物材料为注射剂；

优选地，所述生物材料还包括由所述细胞外基质复合透明质酸凝胶制备得到的膜材料。

10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料中还包括间充质干细胞；

优选地，所述间充质干细胞的含量为1×10⁶个～5×10⁶个；

优选地，所述生物材料用于治疗心肌缺血。