CN104888274A - 一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质及其制备与应用。该制备方法包含如下步骤：对天然生物组织进行脱细胞处理，得到脱细胞基质；检测脱细胞基质中糖胺聚糖的丢失量；借助脱细胞基质中天然成分接入补充糖胺聚糖，得到具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质。通过本发明的方法，大量恢复了脱细胞基质中的糖胺聚糖成分，具有良好的生物相容性，恢复了天然生物结构，有利于细胞生长，对脱细胞基质补充糖胺聚糖，构建组织工程载体；本发明可快速制备满足细胞生长需求、力学强度要求及结构成分与天然细胞外基质相近的生物载体，是组织工程构建技术的重大突破，同时本发明原理可靠，工艺简单灵活，产品重现性好，极易实现产业化。
Description
技术领域
本发明属于组织工程领域，特别涉及一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质及其制备方法与应用。
背景技术
在组织工程领域，载体支架材料的制备是进行组织工程构建的关键环节。其中脱细胞基质载体具有天然超微三维结构、丰富的细胞外基质成分及低免疫源性等特点被广泛应用。良好的脱细胞基质载体应具有以下特征：①免疫活性物质被有效去除，生物相容性良好；②天然的结构和成分得到了有效的保护，细胞外基质成分保留程度高。就目前国内外脱细胞基质制备情况看：所得脱细胞基质大体结构保留完整；胶原纤维，层粘连蛋白基本完整保留；弹力蛋白保留率小于40％；糖胺聚糖丢失率大于50％。根据以上实验结果，我们可以发现：目前制备的脱细胞基质虽然能获得较好生物相容性，但其原有胶原网络与部分蛋白质(纤维连接蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白等)被破坏，糖胺聚糖等天然成分大量流失，导致其生物活性、热稳定性、力学强度和耐降解性能等生物学功能常不足以满足临床需要。因此，对脱细胞基质进行改性处理成为了一大关键问题。
现行的脱细胞基质改性方法着眼于脱细胞基质生物学功能的改良。主要分为两大类：表面刻蚀法和交联改性法。表面刻蚀法是指利用物理或化学方法(如光、酸、碱)改变基质表面的粗糙度，增加脱细胞基质的细胞粘附性。其缺点在于：损坏了脱细胞基质的表面天然结构，基质表面的信号结合位点丢失，影响了细胞生长的微环境。交联改性法是目前最常用的脱细胞基质改性方法，具体还可分为：氧化法、交联剂法、物理法和酶法。其中氧化法是指利用光或高能辐照使脱细胞基质中的氨基酸活化并重新结合，改善了脱细胞基质的热稳定性和生物相容性，并增强了机械强度。此外，这种方法不需使用添加剂、可控性高且毒性较小。但此法缺点在于：适用范围小并且照射过程可能会导致基质中的蛋白活性物质变性失活。交联剂法是指使用不同类型的交联剂与脱细胞基质交联，增强脱细胞基质的力学强度并改善其体内降解性能。其缺点在于：交联剂的残留对细胞生长造成影响，还会使脱细胞基质产生一定溶血性。物理法是指利用分子缠绕、盐键、氢键及疏水作用使物理型交联剂在脱细胞基质上形成交联网络，改善了脱细胞基质的力学强度及抗降解性能。这种方法安全隐患小，但物理型交联剂的选择难度较大，并且对于物理交联型水凝胶，分子间的缠绕、疏水相互作用或离子键合区域也会形成簇团结构，因此造成凝胶的不均匀性，同时自由链端和链环也会产生瞬时的网络缺陷。酶法是利用相关酶(转谷氨酰胺酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、赖氨酰氧化酶等)催化脱细胞基质发生交联反应，改善其生物相容性。这种方法优点在于：高效、高选择性、交联速率可控、反应条件温和等，但其高选择性也限制了在交联改性中的应用范围。
上述方法的共同特征在于：通过物理、化学和酶的方法改变脱细胞基质中生物活性物质的结构，使其生物活性、热稳定性、力学强度和耐降解性能得到提升。但均存在着一个共同的问题：脱细胞过程中丢失的生物活性成分未得到补充。其中，天然细胞外基质主要成分之一：糖胺聚糖在脱细胞过程中大量流失，然而，糖胺聚糖对维持脱细胞基质结构的稳定性、对细胞的粘附和迁移具有重要意义。它具有良好的保水作用，能够保护细胞外基质中的胶原纤维不受损害，维持细胞外基质的功能活性，特别地，在角膜中，糖胺聚糖(主要为硫酸角质素)的存在可以稳固胶原紧密规则排列，这与维持其透光性密切相关。而在软骨细胞外基质中，糖胺聚糖(主要为硫酸软骨素)的亲水性可以使软骨增厚，并增加关节内的滑液量。并且糖胺聚糖对各种营养物质(如：生长因子等)、细胞因子等有固定和吸附的作用，可以根据周围细胞的需要对其进行调控。然而，糖胺聚糖的大量流失使脱细胞基质的超微结构发生变化，特别地，糖胺聚糖的存留量直接关系到脱细胞角膜体内移植后的透明时间。加之，脱细胞基质中细胞因子及各种生长因子所剩无几，种子细胞与细胞外基质无法建立有效的营养供求平衡，使细胞在体内恶劣的微环境下的活性无法维持。因此，对脱细胞基质中糖胺聚糖含量的检测是十分关键且必要的。就目前脱细胞产品的制备结果看，脱细胞产品糖胺聚糖剩余量不足50％。因此，我们不难发现，本领域相关产品均存在着一个不易克服的共同缺陷：改性后的脱细胞基质无法恢复脱细胞过程中大量流失的生物学活性成分：糖胺聚糖，直接影响了脱细胞产品的超微结构和细胞外基质成分，致使产品的生物学功能改变。
综上所述，满足临床应用要求的脱细胞基质不但需要足够的生物力学强度和良好的生物相容性，还需要要求其在结构和成分上与天然细胞外基质相似。如何通过改性脱细胞基质使其恢复天然细胞外基质生物活性成分是目前制约该类产品发展的关键问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质。
本发明的再一目的在于提供上述具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质的制备方法，包含如下步骤：
(1)对天然生物组织进行脱细胞处理，得到脱细胞基质；
(2)检测脱细胞基质中糖胺聚糖的丢失量；
(3)借助脱细胞基质中天然成分接入补充糖胺聚糖，得到具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质。
步骤(1)中所述的天然生物组织为异种、同种异体或自体的天然脂肪组织、软骨组织、血管组织、真皮组织、肝脏组织、肾脏、输尿管和生物膜中的至少一种；其中生物膜可为心包膜、角膜、腹膜、羊膜、膀胱粘膜、肠系膜和小肠粘膜中的至少一种；
步骤(1)中所述的脱细胞处理优选包括如下步骤：利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对天然生物组织进行脱细胞处理；
所述的制备脱细胞基质的方法优选包含如下方法：通过酶破坏细胞得到脱细胞基质的酶消化法；通过物理方式破坏细胞得到脱细胞基质的物理法；通过化学试剂裂解细胞得到脱细胞基质的化学法；
所述的酶优选包括蛋白酶、核酸酶和磷脂酶等中的至少一种；蛋白酶能水解细胞蛋白质成分，核酸酶能水解核酸，磷脂酶能破坏细胞结构；
所述的物理方式优选包括冷冻、高压、超声波、机械震荡、反复冻融和渗透压改变等中的至少一种；
所述的化学试剂优选包括酸、碱、螯合剂和表面活性剂等中的至少一种；
所述的脱细胞处理更优选包括如下步骤：对天然生物组织进行预处理，使其处于无菌状态；接着利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对天然生物组织进行脱细胞处理；
所述的预处理包括如下的步骤A，或步骤A和步骤B，或步骤A～C：
A、用含抗生素的生理缓冲液对天然生物组织进行清洗、消毒、分离，有利于保持无菌状态；
B、用低渗或等渗溶液浸泡用抗生素处理过的天然生物组织，有利于让下一步骤的脱细胞液更好地作用于天然生物组织，提高脱细胞效率；
C、震荡和调节洗涤温度，超声波处理，作用同步骤B；
步骤(3)中所述的接入方法优选为物理共混、化学交联、离子键合和化学接枝中的一种或一种以上；
所述的物理共混是利用高分子试剂的分子缠绕、盐键、氢键及疏水作用使糖胺聚糖分布于脱细胞基质的表面以及内部；
所述的高分子试剂优选包含水凝胶、聚电解质中的一种或两种；
所述的化学交联是在交联剂的作用下，脱细胞基质中大分子与糖胺聚糖链间通过化学键联结起来，形成网状或体形结构；
所述的交联剂优选包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1,1-羰基二咪唑、京尼平、氧化海藻酸钠、戊二醛、多醛基葡聚糖和辣根过氧化物酶中的至少一种；
所述的离子键合是在脱细胞基质上接入高分子，通过高分子与糖胺聚糖间的离子键反应，将糖胺聚糖接入脱细胞基质中；
所述的高分子优选包括盐酸十六烷基胺和聚氨酯中的至少一种；
所述的化学接枝是利用高分子试剂，使脱细胞基质表面的反应基团(如：氨基)与糖胺聚糖直接或间接发生化学反应，实现表面接枝。
所述的高分子试剂优选包含氨基酸，1,4-丁二醇缩水甘油醚，β-硫酸酯乙砜基苯胺和溴化氰中的至少一种。
步骤(2)和步骤(3)中所述的糖胺聚糖优选包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素等中的至少一种；
步骤(2)中所述的糖胺聚糖的检测方法优选包含定性检测法和定量检测法。定性检测法优选包含：组织化学染色法和免疫组化染色法中的至少一种，定量检测法优选包括：Dubious法、Carbazole法、Elson-Morgan法、ELISA法和电泳法中的至少一种；
所述的组织化学方法是利用染色剂对组织中的糖胺聚糖进行染色，再测定组织的吸光度来对糖胺聚糖进行定性和定量分析；
所述的染色剂优选包含阿利新蓝、1,9-二甲基亚甲蓝和天青A中的至少一种；
所述的免疫组化染色法是利用荧光标记抗体标记组织中的成分，从而对成分进行定性分析；
所述的荧光标记抗体优选为5-氨基荧光素；
所述的电泳法是指对糖胺聚糖进行电泳，并将泳动位置与标准品对比来对糖胺聚糖进行定性分析。
一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质，通过上述制备方法制备得到。
所述的具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质在组织工程领域中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)大量恢复脱细胞基质中的糖胺聚糖成分：糖胺聚糖是天然细胞外基质的主要成分之一，与细胞外基质中的核心蛋白质结合形成的蛋白聚糖，对维持细胞外基质的稳定结构、调节营养物质和细胞因子的释放起重要作用。现行的脱细胞基质制备方法破坏了糖胺聚糖与细胞外基质的共价连接，造成糖胺聚糖的大量流失，损坏了细胞外基质的天然成分。脱细胞基质接入糖胺聚糖后，补充了主要的流失成分，糖胺聚糖的含量基本恢复至天然水平。
(2)具有良好的生物相容性：得到了与天然细胞外基质化学组成更加相似的脱细胞基质。在体内移植过程中，不产生免疫排斥反应，且脱细胞基质能与缝合部位较好融合。
(3)恢复天然生物结构：某些移植部位对脱细胞基质的结构有较高要求，如力学强度、透光性、亲水性等。脱细胞基质交联糖胺聚糖后，超微结构得到改善，脱细胞基质的生物学功能提高，更有利于临床应用。
(4)有利于细胞生长：脱细胞基质交联糖胺聚糖后，亲水性增强，且能够吸附各类营养物质，为细胞提供了生长支持微环境，有利于细胞的增殖、粘附、迁移、分化和功能表达。
(5)对脱细胞基质补充糖胺聚糖，构建组织工程载体。根据不同的对脱细胞基质载体的需要，按照对生物组织脱细胞处理→接入糖胺聚糖的基本方法，选用不同脱细胞方法和糖胺聚糖接入方式制备交联糖胺聚糖的脱细胞基质载体。同时，本发明最独特的优点在于，可快速制备满足细胞生长需求、力学强度要求及结构成分与天然细胞外基质相近的生物载体，是组织工程构建技术的重大突破，同时本发明原理可靠，工艺简单灵活，产品重现性好，极易实现产业化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理
I、制备本实施例的以脱细胞羊膜交联肝素的载体：
(1)对天然生物组织进行脱细胞处理；
在室温，常规无菌操作下，将新鲜猪羊膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡后，放于摇床上震荡清洗30分钟，重复4次。接着，分别用0.25％胰酶、1％的TritonX-100、0.5％SDS、0.2％戊二醛和中性蛋白酶处理羊膜组织。具体来说：①将清洗干净的羊膜浸泡于质量分数0.25％胰酶中震荡1小时，PBS缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗3次后，置于质量分数1％的Triton X-100溶液中浸泡过夜。②用质量分数0.5％SDS浸泡过夜，PBS缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗3次，再用质量分数0.2％戊二醛震荡10分钟。③用质量分数0.25％胰酶浸泡羊膜，于37℃下震荡1小时，PBS缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗三次后，放于-80℃条件下冷冻3天。④中性蛋白酶中浸泡24小时，PBS缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗3次，用质量分数1％Triton X-100浸泡24小时。⑤分别加入质量分数0.5％SDS、10％氯化钠、中性蛋白酶浸泡羊膜组织，每种溶液震荡浸泡两小时后，均用PBS缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗3次，0.5％SDS浸泡8小时。⑥质量分数10％氯化钠浸泡1小时，质量分数1％Triton X-100浸泡1小时，得到天然脱细胞羊膜载体。
(2)检测天然羊膜和对照组脱细胞羊膜的糖胺聚糖含量；
根据文献“The use of phospholipase A2to prepare acellular porcinecornealstroma as a tissue engineering scaffold”所述方法对糖胺聚糖含量进行检测：即利用木瓜蛋白酶消化脱细胞羊膜基质，使用BlyscanTMkit对消化液中的糖胺聚糖成分进行检测。对比天然羊膜和对照组脱细胞羊膜中的糖胺聚糖含量，确定脱细胞过程中糖胺聚糖的丢失量。
(3)在脱细胞基质中交联丢失的糖胺聚糖；
在室温下，常规无菌操作下，用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞羊膜材料，用1mL含20～25mg/mL肝素、22mmol/mL EDC、30mmol/mL磺基-NHS和50mmol/mL MES缓冲液浸泡6小时，得到脱细胞羊膜交联肝素的载体。依次用磷酸氢二钠溶液(0.1mol/L)清洗3次，每次15分钟；氯化钠溶液(4mol/L)清洗3次，每次15分钟；蒸馏水轻柔清洗3次，每次15分钟。清洗后的脱细胞羊膜交联肝素的载体密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)照射灭菌后，4℃下保存备用。
II、制备对照组：
脱细胞羊膜：按步骤Ⅰ(1)取新鲜羊膜制备脱细胞羊膜，用环钻钻取12mm直径脱细胞羊膜材料钴60(15kGy)照射灭菌，4℃下保存备用。
二、检测方法
(1)糖胺聚糖定性检测：用0.5wt％阿尔新蓝溶液(用50％冰乙酸水溶液配置，pH＜1)浸泡脱细胞羊膜，37℃下，摇床上反应12小时。取出脱细胞羊膜，用50％冰醋酸水溶液轻柔清洗3次，每次15分钟。
(2)糖胺聚糖定量检测：根据文献“The use of phospholipase A2to prepareacellular porcine cornealstroma as a tissue engineering scaffold”所述方法对糖胺聚糖含量进行检测：即利用木瓜蛋白酶消化脱细胞羊膜基质，使用BlyscanTMkit对消化液中的糖胺聚糖成分进行检测。
(3)种植细胞后的细胞生长情况：在脱细胞羊膜上种植1*103的成纤维细胞，并在培养1，3，5，7天后，利用MTT检测技术检测细胞的增殖活性。具体来说：收集细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至1000～10000个/孔，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液反应4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
(4)生物相容性：将脱细胞羊膜进行皮下移植，2周后对周围纤维组织进行HE染色，观察结果。具体来说：在实验小鼠背部皮肤上打开一2cm的小创口，将无菌的脱细胞羊膜移植进去后缝合，2周后观察移植结果。
三、检测结果
(1)糖胺聚糖定性分析：天然猪羊膜、对照组和交联后的脱细胞基质三组均呈阿利新蓝染色阳性，说明三组羊膜中均含有一定的糖胺聚糖。但与对照组相比，我们可以明显观察到天然猪羊膜和交联后的脱细胞基质着色程度更深，说明糖胺聚糖的含量更高。
(2)糖胺聚糖定量分析：天然猪羊膜中硫酸软骨素的含量约为29.8～30.3μg/mg；对照组猪羊膜中硫酸软骨素的含量约为0.03～0.05μg/mg，可以发现脱细胞处理会造成猪羊膜基质中硫酸软骨素的大量丢失。交联后的脱细胞基质硫酸软骨素的含量从约0.03～0.05μg/mg恢复至28.3～33.7μg/mg，可以得出硫酸软骨素得到了较大的恢复，且能被交联在脱细胞羊膜上。
(3)细胞生长情况：MTT结果分析得：第一、三天实验组与对照组并无太大差异，第五天之后，实验组的细胞量相对于对照组增殖率较高，有统计学差异。表明了糖胺聚糖的补充能够为细胞生长提供更好地微环境。
(4)生物相容性：2周后，对周围纤维组织HE染色结果显示：无明显免疫排斥反应发生，未发现中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞的渗透。说明了脱细胞羊膜具有良好的生物相容性，可进行体内移植手术。
实施例2制备脱细胞角膜接枝硫酸角质素的载体
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理
I、制备本实施例的以脱细胞角膜接枝硫酸角质素的载体：
(1)对天然生物组织进行脱细胞处理；
在室温，常规无菌操作下，将新鲜兔角膜用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡5次，每次10分钟。将角膜置入无菌纯水中，在37℃水浴中浸泡60分钟。浸泡后将其置入10mL无菌磷脂酶溶液(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH＝8～9；磷脂酶A1＝200U/mL，磷脂酶A2＝250U/mL)中，在37℃水浴中震荡处理(转速＝185rpm)6小时。后置入50mL含抗生素(100U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)中，在25℃水浴中震荡(转速＝185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到天然脱细胞角膜。
(2)检测天然角膜和对照组脱细胞角膜的糖胺聚糖含量；
检测方法同实施例1，所不同的地方在于：我们利用ELISA kit对消化液进行定量分析。对比天然角膜和对照组脱细胞角膜中的糖胺聚糖含量，确定脱细胞过程中糖胺聚糖的丢失量。
(3)在脱细胞角膜基质上接枝糖胺聚糖；
在室温下，常规无菌操作下，用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞角膜。在35℃氮气环境下，将脱细胞角膜浸泡于含1g聚L-谷氨酸和2g聚L-天冬氨酸的PBS溶液(pH＝7.4)中反应24小时。将反应所得脱细胞角膜放于PBS溶液(pH＝7.4)中透析2天。接着，浸泡在含30～40mg/mL硫酸角质素的PBS溶液(pH＝7.4)中，4℃摇床反应24小时，得到脱细胞角膜接枝硫酸角质素的载体。再次放于PBS溶液(pH＝7.4)中透析2天。所得脱细胞角膜接枝硫酸角质素的载体密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)照射灭菌后，4℃下保存备用。
II、制备对照组：
脱细胞角膜：按步骤Ⅰ(1)取新鲜兔角膜制备脱细胞角膜，用环钻钻取12mm直径脱细胞角膜材料钴60(15kGy)照射灭菌，4℃下保存备用。
二、检测方法
(1)糖胺聚糖定性检测：根据文献“A comparison of glycosaminoglycandistributions,keratansulphatesulphation patterns and collagen fibril architecture fromcentral toperipheral regions of the bovine cornea”中所述方法，使用5D4单克隆抗体对脱细胞基质进行免疫荧光染色。
(2)糖胺聚糖的定量检测：检测方法同实施例1，所不同的地方在于：我们利用ELISA kit对消化液进行定量分析。
(3)种植细胞后的细胞生长情况：检测方法同实施例1。
(4)透光性：根据文献“PEG stabilized carbodiimidecrosslinked collagen–chitosan hydrogels for cornealtissue engineering.”所述方法对脱细胞角膜进行透光性实验，具体为：对样品进行紫外可见光分光光度计检测，从300～800nm的波长范围内，每10nm就对脱细胞角膜进行透光性检测。
(5)生物相容性：检测方法用实施例1。
三、检测结果
(1)糖胺聚糖定性分析：免疫荧光定性结果，我们可以看出脱细胞角膜中硫酸角质素含量不均匀，且含量从中间到两边含量减少。而实验组硫酸角质素较均匀分布于脱细胞角膜的内部和表面。
(2)糖胺聚糖定量分析：天然猪角膜中硫酸角质素的含量约为129.3～139.5μg/mg；对照组猪角膜中硫酸角质素的含量约为43.2～46.8μg/mg，可以发现脱细胞处理会造成猪角膜膜基质中硫酸角质素的大量丢失。与对照组相比，糖胺聚糖的含量从45.8μg/mg恢复至128.5～136.9μg/mg，可以得出糖胺聚糖恢复至接近天然含量，且能被交联在脱细胞角膜上。
(3)细胞生长情况：MTT结果分析得：第一、三天实验组与对照组并无太大差异，第五天之后，实验组的细胞量相对于对照组增殖率较高，有统计学差异。表明了糖胺聚糖的补充能够为细胞生长提供更好地微环境。
(4)透光性：透光性结果显示：未交联糖胺聚糖的脱细胞角膜透光性与天然角膜相比受到较大破坏，实验组所得角膜能够较好地恢复一定透光性，同天然角膜相比无统计学差异。表明了交联的糖胺聚糖能使脱细胞过程中被破坏的纤维结构得到一定程度的恢复，改善角膜透光性。
(5)生物相容性：2周后，对周围纤维组织HE染色结果显示：无明显免疫排斥反应发生，皮下组织结构正常，几乎没有炎症细胞产生。说明了脱细胞羊膜具有良好的生物相容性，可进行体内移植手术。
实施例3制备脱细胞心包膜加入透明质酸的载体
一、以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理
I、制备本实施例的以脱细胞心包膜交联透明质酸的载体：
(1)对天然生物组织进行脱细胞处理；
在室温，常规无菌操作下，将新鲜猪心包膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G，100μg/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)浸泡5次，每次10分钟。将猪心包膜反复冰冻融解(-80℃冷冻，37℃解冻)3次，每次1小时。置入10mL 0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA溶液中37℃水浴中震荡(转速＝185rpm)过夜，后用PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)清洗3次，每次30分钟。再次置入10mL 0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA溶液中37℃水浴中震荡处理(转速＝185rpm)2小时，重复相同清洗步骤。清洗后将其置入含50U/mL核糖核酸酶A的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH＝7.4)中37℃水浴中震荡(转速＝185rpm)过夜。后置入50mL含抗生素(100U/mL青霉素G，100μg/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH＝9.0～9.6)中，在25℃水浴中震荡(转速＝185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到脱细胞猪心包膜。
(2)检测天然心包膜和对照组脱细胞心包膜的糖胺聚糖含量；
检测方法同实施例2。
(3)在脱细胞基质上加入糖胺聚糖；
在室温下，常规无菌操作下，用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞心包膜材料，用含0.1～0.5mg/mL透明质酸、20mmol/mL EDC和45mmol/mL MES缓冲液完全浸泡6小时，得到脱细胞心包膜交联透明质酸的载体。依次用氯化钠溶液(4mol/L)和蒸馏水轻柔清洗3次，每次15分钟。在清洗后的脱细胞心包膜交联透明质酸的载体上覆盖一层Matrigel基质胶溶液(BD BiocoatMatrige)，提高透明质酸的固定量。所得脱细胞心包膜交联透明质酸的载体密封于无菌塑料袋中，用钴60(15kGy)照射灭菌后，4℃下保存备用。
II、制备对照组：
脱细胞心包膜：按步骤Ⅰ(1)取新鲜猪心包膜制备脱细胞心包膜，用环钻钻取12mm直径脱细胞心包膜材料钴60(15kGy)照射灭菌，4℃下保存备用。
二、检测方法
(1)糖胺聚糖定性检测：用1,9-二甲基亚甲蓝染液浸泡脱细胞心包膜，染色15分钟后，吸出染色液，并用蒸馏水轻柔清洗3次，每次15分钟。
(2)糖胺聚糖的定量检测：检测方法同实施例2。
(3)种植细胞后的细胞生长情况：检测方法同实施例1。
(4)生物相容性：检测方法用实施例1。
(5)力学强度：将样品裁剪为30mm(长)×5mm(宽)大小的样品，固定后置入到机电拉伸测量仪(Instron 4411)中并浸入装有PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.2～7.4)的恒温槽(Unitronic 6320200)中37℃下测量。
三、检测结果
(1)糖胺聚糖定性分析：与对照组相比，实验组蓝色着色较深。
(2)糖胺聚糖定量分析：天然猪心包膜中透明质酸的含量约为0.60～0.65μg/mg；对照组猪心包膜中透明质酸的含量约为0.27～0.39μg/mg，可以发现脱细胞处理会造成猪心包膜膜基质中透明质酸的大量丢失。糖胺聚糖的含量从0.27～0.39μg/mg恢复至0.64～0.73μg/mg，可以得出糖胺聚糖恢复至天然含量，且能被交联在脱细胞心包膜上。
(3)细胞生长情况：MTT结果分析得：第一、三天实验组与对照组并无太大差异，第五天之后，实验组的细胞量相对于对照组增殖率较高，有统计学差异。表明了糖胺聚糖的补充能够为细胞生长提供更好地微环境。
(4)生物相容性：2周后，对周围纤维组织HE染色结果显示：皮下组织结构正常，几乎没有炎症细胞产生和渗透。说明了脱细胞心包膜具有良好的生物相容性，可进行体内移植手术。
(5)拉伸力学强度：脱细胞猪心包膜拉伸强度：0°：12.2MPa，90°：21.8MPa，与天然猪心包膜拉伸强度比较无统计学差异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)对天然生物组织进行脱细胞处理，得到脱细胞基质；
(2)检测脱细胞基质中糖胺聚糖的丢失量；
(3)借助脱细胞基质中天然成分接入补充糖胺聚糖，得到具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的天然生物组织为异种、同种异体或自体的天然脂肪组织、软骨组织、血管组织、真皮组织、肝脏组织、肾脏、输尿管和生物膜中的至少一种；
步骤(2)和步骤(3)中所述的糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的脱细胞处理包括如下步骤：利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对天然生物组织进行脱细胞处理；
所述的制备脱细胞基质的方法包含如下方法：通过酶破坏细胞得到脱细胞基质的酶消化法；通过物理方式破坏细胞得到脱细胞基质的物理法；通过化学试剂裂解细胞得到脱细胞基质的化学法。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述的酶包括蛋白酶、核酸酶和磷脂酶中的至少一种；
所述的物理方式包括冷冻、高压、超声波、机械震荡、反复冻融和渗透压改变中的至少一种；
所述的化学试剂包括酸、碱、螯合剂和表面活性剂中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述的脱细胞处理包括如下步骤：对天然生物组织进行预处理，使其处于无菌状态；接着利用制备脱细胞基质的方法中的至少一种对天然生物组织进行脱细胞处理；
所述的预处理包括如下的步骤A，或步骤A和步骤B，或步骤A～C：
A、用含抗生素的生理缓冲液对天然生物组织进行清洗、消毒、分离；
B、用低渗或等渗溶液浸泡用抗生素处理过的天然生物组织；
C、震荡和调节洗涤温度，超声波处理。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的接入方法为物理共混、化学交联、离子键合和化学接枝中的一种或一种以上；
所述的物理共混是利用高分子试剂的分子缠绕、盐键、氢键及疏水作用使糖胺聚糖分布于脱细胞基质的表面以及内部；
所述的高分子试剂包含水凝胶、聚电解质中的一种或两种；
所述的化学交联是在交联剂的作用下，脱细胞基质中大分子与糖胺聚糖链间通过化学键联结起来，形成网状或体形结构；
所述的交联剂包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、1,1-羰基二咪唑、京尼平、氧化海藻酸钠、戊二醛、多醛基葡聚糖和辣根过氧化物酶中的至少一种；
所述的离子键合是在脱细胞基质上接入高分子，通过高分子与糖胺聚糖间的离子键反应，将糖胺聚糖接入脱细胞基质中；
所述的高分子包括盐酸十六烷基胺和聚氨酯中的至少一种；
所述的化学接枝是利用高分子试剂，使脱细胞基质表面的反应基团与糖胺聚糖直接或间接发生化学反应，实现表面接枝；
所述的高分子试剂包含氨基酸，1,4-丁二醇缩水甘油醚，β-硫酸酯乙砜基苯胺和溴化氰中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的糖胺聚糖的检测方法包含定性检测法和定量检测法；所述的定性检测法包含：组织化学染色法和免疫组化染色法中的至少一种；所述的定量检测法包括：Dubious法、Carbazole法、Elson-Morgan法、ELISA法和电泳法中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
所述的组织化学方法是利用染色剂对组织中的糖胺聚糖进行染色，再测定组织的吸光度来对糖胺聚糖进行定性和定量分析；
所述的染色剂包含阿利新蓝、1,9-二甲基亚甲蓝和天青A中的至少一种；
所述的免疫组化染色法是利用荧光标记抗体标记组织中的成分，从而对成分进行定性分析；
所述的荧光标记抗体优选为5-氨基荧光素；
所述的电泳法是指对糖胺聚糖进行电泳，并将泳动位置与标准品对比来对糖胺聚糖进行定性分析。
9.一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质，通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质在组织工程领域中的应用。
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